(Luận văn) nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn gram dương của chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN LÂM THÁI Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GRAM DƯƠNG lu CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC an n va tn to p ie gh KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC oa nl w Hệ đào tạo d : Chính quy lu : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP u nf : 2010 - 2014 ll Khóa học va an Chuyên ngành oi m z at nh z gm @ Thái Nguyên, năm 2014 m co l an Lu n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN LÂM THÁI Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN GRAM DƯƠNG lu CỦA CHẾ PHẨM PHỐI HỢP CHITOSAN – NANO BẠC an n va to p ie gh tn KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC oa nl w Hệ đào tạo : Chính quy d lu : Cơng nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP u nf : 2010 - 2014 ll Khóa học va an Chuyên ngành m oi Giảng viên hướng dẫn : ThS Lương Hùng Tiến z at nh ThS Nguyễn Thị Đoàn Khoa CNSH - CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên, năm 2014 n va ac th si LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, em nhận giúp đỡ nhiều từ cá nhân tập thể Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn, thầy Lương Hùng Tiến cô Nguyễn Thị Đoàn giảng viên Khoa CNSH – CNTP, tin tưởng giao đề tài, tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo làm việc quản lí phịng Thì nghiệm vi sinh thường xuyên giúp đỡ em thực hoàn thành kháo luận tốt lu nghiệp an Cuối cùng, em xin cảm ơn tồn thể người thân gia đình bạn bè n va quan tâm, ủng hộ tạo điều kiện để em hồn thành tốt khóa luận Kính mong nhận chia sẻ ý kiến đóng góp q báu thầy, gh tn to Dù cố gắng nhiều, xong khóa luận cịn thiếu xót hạn chế ie giáo bạn p Em xin chân thành cảm ơn! nl w oa Thái Nguyên ngày 29 tháng năm 2014 d Sinh viên u nf va an lu Nguyễn Lâm Thái ll oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .2 lu PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 an 2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN .3 n va 2.1.1 Nguồn gốc cấu trúc hóa học chitosan 2.1.3 Đặc tính kháng vi sinh vật chitosan yếu tố ảnh hưởng đến hoạt gh tn to 2.1.2 Tính chất chitosan ie động kháng khuẩn chitosan p 2.1.4 Các ứng dụng chitosan sống 13 nl w 2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NANO BẠC 14 oa 2.2.1 Lịch sử hình thành cơng nghệ nano 14 d 2.2.2 Cơ sở khoa học công nghệ nano .14 lu an 2.2.3 Giới thiệu hạt nano bạc .15 u nf va 2.2.4 Ứng dụng nano bạc sống 20 2.3 GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN 22 ll m 2.3.1 Khái niệm chung vi khuẩn 22 oi 2.3.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 22 z at nh 2.3.3 Vi khuẩn Bacillus cereus 24 2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .26 z @ 2.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 26 gm 2.4.2 Tình hình nghiên cứu giới 27 l PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 m co 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .29 3.1.1 Vật liệu 29 an Lu n va ac th si 3.1.2 Chủng vi sinh vật thí nghiệm 29 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị mơi trường sử dụng thí nghiệm 29 3.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 29 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 30 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 30 3.4.2 Phương pháp phân tích 31 3.4.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 32 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA NANO BẠC lu ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG 33 an 4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA CHITOSAN n va ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG 34 4.3.1 Xác định khả kháng B cereus phức chất chitosan/nano bạc 36 gh tn to 4.3 LỰA CHỌN CÔNG THỨC PHỐI TRỘN CHITOSAN VỚI NANO BẠC .36 ie 4.3.2 Xác định khả kháng S aureus phức chất chitosan/nano bạc 37 p PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 w 5.1 KẾT LUẬN 39 oa nl 5.2 ĐỀ NGHỊ 39 d TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Số nguyên tử lượng bề mặt hạt nano bạc .19 Bảng 3.1 Công thức phối trộn chitosan nano bạc .31 Bảng 4.1 Kết kháng B cereus S aureus nano bạc 34 Bảng 4.2: Kết kháng B cereus S aureus nồng độ 35 Bảng 4.3: Hiệu kháng vi khuẩn B cereus công thức phối trộn chitosan nano bạc 36 Bảng 4.4: Hiệu kháng vi khuẩn S aureus công thức phối trộn chitosan nano bạc 38 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Một số loài giáp xác chứa chitin Hình 2.2: Cơng thức cấu tạo chitin Hình 2.3: Cấu trúc hóa học chitosan Hình 2.4: Hiện tượng cộng hưởng plasmon hạt hình cầu 17 Hình 2.5: Ion bạc vơ hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy vi khuẩn 19 Hình 2.6 Nồng độ khác dung dịch hạt nano bạc 21 Hình 2.7: Vi khuẩn Staphylococcus aureus 23 Hình 2.8 : Vi khuẩn Bacillus cereus 25 lu Hình 4.1: Khả kháng 36 an Hình 4.2: Khả kháng 36 n va Hình 4.3: Khả kháng 38 tn to Hình 4.4: Khả kháng chitosan khác 35 Hình 4.5: Khả kháng B cereus phức chất 36 gh p ie Hình 4.6: Khả kháng S aureus phức chất 37 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Từ viết tắt DD Degree of deacetylation MIC Minimum inhibitory concentration TSC Trisodium Citrate UV-Vis Ultraviolet-Visible DI Deionized PVA Polyvinyl acetat lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chitosan chế phẩm sinh học, hình thành từ trình deacetyl hóa chitin, có nhiều loại giáp xác Sản xuất chitosan khơng góp phần làm giảm ảnh hưởng đến môi trường từ phế liệu thủy sản mà cịn tạo giá trị kinh tế lớn Chitosan có tính chất quan trọng, chất phụ gia thực phẩm, tạo màng bao gói, khả kháng khuẩn, làm giảm q trình nước sản phẩm điều kiện bảo quản đặc biệt không gây ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng, chitosan ứng dụng nhiều lĩnh vực lu Bạc biết đến nguyên tố có khả khử trùng an mạnh tồn tự nhiên Các 200 năm nhà khoa học xem huyết n va người dịch keo, keo bạc sử dụng làm chất kháng khuẩn bệnh nấm da, điều trị vết thương, vết bỏng, bệnh miệng, làm thuốc gh tn to thể người Kể từ keo bạc sử dụng rộng rãi để chữa ie nhỏ mắt Tuy nhiên, sau thuốc kháng sinh phát minh (giữa kỉ 20) với p hiệu lực khử trùng mạnh hơn, keo bạc bị thay dần Nhưng 30 năm sau w người ta nhận có nhiều lồi vi khuẩn có khả chống lại tác oa nl dụng thuốc kháng sinh vấn đề ngày trở nên đáng lo ngại Lúc d tính kháng khuẩn bạc lại ý có phổ tác dụng rộng không bị lu an hạn chế hiệu ứng kháng thuốc [31, 23] Ngày nay, việc tạo vật thể kích va thước nano trở nên phổ biến, kích thước hạt vật chất thể nhiều u nf tính chất lý-hóa khác thường so với vật chất trạng thái khối, khả ll kháng khuẩn cao 20-60 ngàn lần so với ion Ag+ [10] Các hạt nano bạc oi m với lượng bề mặt lớn có khả giải phóng từ từ ion bạc vào dung z at nh dịch, nhờ nano bạc có hiệu lực khử khuẩn mạnh nhiều lần kéo dài so với bạc dạng keo, dạng ion hay dạng rắn [31, 24] Chính tính z @ chất lượng tử đặc biệt nên nano bạc bị biến thể gian bảo quản, để ổn gm định cần phải có phương pháp chế tạo đặc biệt giúp cho khả sử m co l dụng triệt để Dựa vào đặc tính quý giá trên, ý tưởng kết hợp hai loại vật liệu hình thành Chitosan loại chế phẩm có khả kháng khuẩn, khơng gây độc có khả tạo thành lớp màng mỏng bao quanh thực phẩm Nano bạc, vật liệu có khả an Lu n va ac th si lu an n va p ie gh tn to kháng khuẩn cực mạnh với nồng độ nhỏ, lại dễ bị oxi hóa Khi sử dụng kết hợp với cho hỗn hợp dung dịch bền vững có hoạt tính mạnh để ứng dụng rộng rãi sản xuất Vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus vi khuẩn Gram dương hai loài vi khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên (Đất, nước, thể người, động vật …), loài vi khuẩn tồn phổ biến nông sản thực phẩm Chúng tác nhân gây vụ ngộ độc thực phẩm khắp nước thời gian qua Chính phổ biến tác hại nguy hiểm người nên chúng tơi tập trung tồn thời gian làm khóa luận “Nghiên cứu khả kháng vi khuẩn Gram dương chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc” 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục đích - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nano bạc vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chitosan vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus - Nghiên cứu kết hợp chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc kháng vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus 1.2.2 Yêu cầu - Tìm kết hợp tối ưu kháng vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc - Đánh giá kết kháng vi khuẩn Bacillus cereus Staphylococcus aureus chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc 1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Giúp sinh viên có hội tiếp cận với thao tác kỹ thuật thực tế Qua kết hợp với kiến thức lý thuyết học sinh viên có hiểu biết chun sâu nhìn tổng quát 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Hiện nano bạc chitosan ứng dụng nhiều y học, thực phẩm, nơng nghiệp, xử lí mơi trường… - Chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc ứng dụng bảo quản loại thực phẩm d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 31 Thí nghiệm 3: Xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc Phối trộn 0,2 ml Chitosan nồng độ MIC, MIC/2 với 0,2 ml nano bạc nồng độ MIC, MIC/2 theo công thức sau: Bảng 3.1 Công thức phối trộn chitosan nano bạc Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 Chitosan MIC/2 MIC/2 MIC MIC Nano bạc MIC/2 MIC MIC/2 MIC Tiến hành trộn 0,1ml huyền dịch vi khuẩn, 0,4 ml hỗn hợp Chitosan nano lu bạc theo công thức (kiểm chứng dung dịch đệm acetate) với 0,5ml môi an trường MP ống eppendoff Sau 24h nuôi cấy tiến hành định lượng mật độ vi n va sinh vật cịn sống sót dịch trộn 3.4.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn ie gh tn to 3.4.2 Phương pháp phân tích 0,1ml vi sinh vật hoạt hóa 24h, định lượng mật độ vi sinh vật p 0,4ml chế phẩm kháng khuẩn, d oa nl w kiểm chứng an lu ống chứa 0,5ml MP ll u nf va oi m Dịch A, nuôi 37oC z at nh z Sau 24h, quan sát, pha loãng định lượng vi sinh vật gm @ m co l 3.4.2.2 Phương pháp quan sát hình thái tế bào xác định mật độ tế bào a Phương pháp quan sát hình thái tế bào tiêu nhuộm Gram an Lu n va ac th si 32 Khuẩn lạc vi khuẩn sau làm tiêu nhuộm tím tinh thể 60s sau nhuộm lugol 60s tẩy cồn 30s, rửa nước cất, nhuộm bổ sung Fuchsin Safranin 30s, làm khơ soi tiêu kính hiển vi để quan sát hình thái tế bào b Phương pháp xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc - Nguyên tắc + Để xác định số lượng khuẩn lạc mẫu: • Cân 1g mẫu pha lỗng 10-5 đếm số khuẩn lạc cấy mơi trường sau thời gian số vi khuẩn + Cấy xác thể tích mẫu dịch pha lỗng vào lên lu bề mặt môi trường thạch Mỗi độ pha loãng cấy lặp lại hộp an petri Mỗi mầu cần làm độ pha lỗng liên tiếp Đếm tất số khuẩn lạc n va đĩa (30 ÷ 300 khuẩn lạc/1 đĩa) tn to - Cách tính kết + Cơng thức: gh p ie ∑C => đơn vị: khuẩnlạc/g (ml) CFU/g (ml) w N= d oa nl (n1 + 0,1n2).f1.v an lu Trong đó: va ∑ C : Tổng số khuẩn lạc/các đĩa : Số đĩa cấy nồng độ pha loãng thứ n2 : Số đĩa cấy nồng độ pha lỗng thứ hai v : Thể tích mẫu cấy/mỗi đĩa f1 : Độ pha loãng thứ N : Nồng độ khuẩn lạc ll u nf n1 oi m z at nh z @ 3.4.3 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật gm Sử dụng phương pháp bảo quản giống môi trường thạch nghiêng: Vi l sinh vật hoạt hóa mơi trường MP, sau cấy chuyển sang môi m co trường thạch nghiêng, nuôi 24h, 37oC, giữ tủ lạnh để thực an Lu nghiên cứu Cấy chuyền giữ giống thạch nghiêng định kỳ tuần lần n va ac th si 33 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA NANO BẠC ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG Nồng độ ức chế tối thiểu MIC định nghĩa nồng độ nhỏ chất kháng khuẩn ức chế phát triển 104 CFU/ml vi sinh vật so với kiểm chứng [4] Để xác định MIC chế phẩm nano bạc chúng tơi tiến hành theo thí lu nghiệm Nồng độ nano bạc sau đối kháng lại là: 25ppm, an 12,5ppm, 6,25ppm, 3,125ppm, 1,5625ppm, 0,78125ppm, đối chứng nước deion n va tn to Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc với vi khuẩn B cereus S aureus p ie gh w nl Xuất d oa khuẩn lạc ll u nf va an lu oi m Không xuất khuẩn lạc S aureus bạcnano bạc z at nh Hình 4.1: Khả kháng Hình 4.2: Khả kháng B cereus nano z m co l gm @ an Lu n va ac th si 34 Bảng 4.1 Kết kháng B cereus S aureus nano bạc Nồng độ C1 C2 C3 C4 25 12,5 6,25 3,125 B cereus - - - + + + + 6,25 S aureus - - - + + + + 6,25 (ppm) Vi khuẩn C5 C6 Nước 1,5625 0,78125 deion MIC(ppm) Ký hiệu: “+”: Xuất khuẩn lạc “-”: Không xuất khuẩn lạc Dựa vào hình 4.1; 4.2 bảng 4.1 cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu nano vi khuẩn B cereus S aureus 6,25ppm lu Nồng độ dung dịch nano bạc để ức chế hai loại vi khuẩn Gram an dương cao vi khuẩn Gram dương có lớp màng phía ngồi va peptidoglucan tương đối dày, khoảng 20 – 80nm nên phân tử nano bạc khó n tn to xâm nhập qua màng gh Ion Ag+ có tương tác mạnh với peptidoglycan gây ức chế khả vận p ie chuyển oxy vào bên tế bào, thay đổi điện tích tế bào dẫn đến tê liệt vi khuẩn Vì S P xuất nhiều màng tế bào nên hạt nano bạc tương tác với S nl w chứa protein bên bên màng tế bào biến đổi chức oa tế bào Đồng thời hạt bạc có kích thước nhỏ chui vào tế bào, kết d hợp với enzym hay ADN có chứa nhóm sunfuahydrin – SH phốt phát gây lu an bất hoạt enzym hay ADN dẫn đến gấy chết tế bào u nf va Vi khuẩn B cereus sinh bào tử cịn S aureus khơng sinh bào tử nano bạc có tính đâm xuyên lớn không bị ảnh hưởng cấu tạo bên ll 6,25ppm oi m tế bào nồng độ tối thiểu B cereus S aureus z at nh 4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU CỦA z @ CHITOSAN ĐỐI VỚI VI KHUẨN GRAM DƯƠNG gm Để xác định MIC chitosan chúng tơi tiến hành theo thí nghiệm l Nồng độ chitosan sau trộn tính lại là: 4000, 3000, 2000, 1500, m co 1000, 500, 250 ppm (kiểm chứng dung dịch đệm acetate) an Lu n va ac th si 35 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan với vi khuẩn B cereus S aureus Xuất khuẩn lạc Khơng xuất khuẩn lạc lu an Hình 4.3: Khả kháng Hình 4.4: Khả kháng B cereus chitosan S aureus chitosan n va Bảng 4.2: Kết kháng B cereus S aureus nồng độ tn to chitosan khác Nồng độ C1 C2 C3 C4 C5 C6 Nước gh p ie (ppm) Vi khuẩn MIC (ppm) 2000 1500 1000 500 250 - - - - - - acetat - + + + 1000 - - + + 500 an lu Kí hiệu : d S aureus oa B cereus nl w 3000 u nf va « + » : Xuất khuẩn lạc « - » : Khơng xuất khuẩn lạc ll Dựa vào hình 4.3; 4.4 bảng 4.2 cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu nano m oi bạc loại vi khuẩn khác Với B cereus 1000ppm, với S aureus z at nh 500ppm Tương tác ion tích điện dương phân tử chitosan điện z tích âm màng tế bào vi sinh vật dẫn đến thay đổi cấu trúc màng tế bào, @ gm thay đổi khả thẩm thấu gây rò rỉ protein thành phần khác tế bào, l làm giảm chức sinh lý sinh hóa vi khuẩn dẫn đến khả bảo vệ, chất độc phát triển vi khuẩn m co trao đổi chất tế bào, chitosan liên kết với ion kim loại, sau ức chế an Lu n va ac th si 36 Nồng độ ức chế chitosan bị ảnh hưởng cấu tạo bên vi khuẩn màng sinh học, lớp nhày,…Vi khuẩn B cereus có khả tạo bào tử nồng độ ức chế B cereus chitosan 1000ppm cao S aureus 500ppm 4.3 LỰA CHỌN CÔNG THỨC PHỐI TRỘN CHITOSAN VỚI NANO BẠC Phương pháp phối trộn trình bày thí nghiệm - 4.3.1 Xác định khả kháng B cereus chế phấm chitosan/nano bạc MIC hai loại vật liệu B cereus là: MIC chitosan: 1000ppm MIC nano bạc: 6,25ppm lu an n va p ie gh tn to w Hình 4.5: Khả kháng B cereus chế phẩm phối hợp oa nl Từ hình 4.5 ta có cơng thức phối trộn tương ứng với ô: CT1 ô số d CT3 số có khuẩn lạc xuất hiện, CT1 ô số CT4 ô số khơng có lu an khuẩn lạc xuất Mức độ kháng B cereus thống kê theo bảng đây: u nf va Bảng 4.3: Hiệu kháng vi khuẩn B cereus công thức phối trộn chitosan/nano bạc ll 500 Nano bạc (ppm) 3,125 Hiệu + CT2 CT3 CT4 500 1000 1000 6,25 3,125 6,25 - + - z at nh Chitosan (ppm) oi CT1 m Công thức z “-“: Không xuất khuẩn lạc m co - l Theo bảng 4.3 ta có kết quả: gm @ Kí hiệu: “+”: Xuất khuẩn lạc Chitosan/nano bạc: 500/6,25 1000/6,25: B cereus không xuất khuẩn an Lu lạc n va ac th si 37 - Chitosan/nano bạc: 500/3,125 1000/3,125: B cereus xuất khuẩn lạc B cereus không phát triển nồng độ có MIC nano bạc 6,25ppm Trong phát triển nồng độ MIC chitosan 1000ppm Qua thấy mức độ kháng B cereus phụ thuộc nhiều vào thay đổi nồng độ nano bạc chitosan, chứng tỏ ảnh hưởng nano bạc mạnh chitosan phức lợp ức chế B cereus Điều nghiên nhân chitosan hòa tan hình thành dạng mạch phân tử polymetrong dung dịch, tạo phức chất với ion kim loại chuyển tiếp Bạc kim loại chuyển tiếp, dạng nano, hạt ion bạc giải phóng hỗn hợp, phần bị chitosan giữ lấy tạo thành phức chất, nên lượng lu chitosan dung dịch giảm đáng kể so với nguyên trạng nên lượng chitosan an lại chi phối mức độ kháng khuẩn hỗn hợp Đối với bạc hình thành n va dạng nano, số lượng ion hạt nano lên đến hàng trăm nghìn, có tn to tham gia liên kết phức chất số lượng cịn lại tác động đến khả sinh trưởng B cereus S aureus gh ie Vậy, để tiết kiểm chi phí chất nên chọn tỷ lệ phối trộn MIC loại vật liệu p nên chọn là: - - Nano bạc: 6,25ppm oa nl w Chitosan: 500ppm d 4.3.2 Xác định khả kháng S aureus phức chất chitosan/nano bạc lu an MIC hai loại vật liệu S aureus là: u nf va MIC chitosan: 500ppm MIC nano bạc: 6,25ppm ll oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Hình 4.6: Khả kháng S aureus phức chất n va ac th si 38 Từ hình 4.6 có cơng thức phối trộn chitosan/nano bạc tương ứng với ô: CT1 ô C8/5, CT3 ô C7/5, CT2 ô C8/4, CT4 ô C7/4 Mức độ kháng S aureus thống kê theo bảng đây: Bảng 4.4: Hiệu kháng vi khuẩn S aureus công thức phối trộn chitosan/nano bạc Công thức CT1 Chitosan (ppm) 250 Nano bạc (ppm) 3,125 Hiệu + Kí hiệu: “+”: Xuất khuẩn lạc CT2 250 6,25 - CT3 500 3,125 + CT4 500 6,25 - lu “-“: Không xuất khuẩn lạc an Từ bảng 4.4 ta có kết quả: va n - Chitosan/nano bạc: 250/6,25 500/6,25: S aureus không xuất khuẩn - Chitosan/nano bạc: 250/3,125 500/3,125: S aureus xuất khuẩn lạc S aureus khơng phát triển nồng độ có MIC nano Bạc 6,25ppm ie gh tn to lạc p Trong S aureus phát triển nồng độ có MIC chitosan nl w 500 ppm Qua ta thấy rằng, mức độ kháng S aureus phụ thuộc nhiều vào oa thay đổi nồng độ nano bạc thay đổi nồng độ chitosan, chứng tỏ ảnh d hưởng nano bạc mạnh chitosan phức hợp lên S aureus lu an Vậy tỷ lệ phối trộn MIC loại vật liệu nên chọn là: - Nano bạc: 6,25 ppm ll u nf va - Chitosan: 250 ppm oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 39 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu nano bạc với loại vi khuẩn S aureus B cereus 6,25ppm - Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chitosan loại vi khuẩn S aureus 500ppm B cereus 1000ppm - Xác định công thức kết hợp hiệu chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc ức chế vi khuẩn B cereus chitosan: 500ppm/ nano bạc: 6,25ppm ức chế vi khuẩn S aureus chitosan: 250 ppm/nano bạc : 6,25ppm lu 5.2 ĐỀ NGHỊ an - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phương pháp xác định nồng độ ức va chế tối thiểu chitosan, nano bạc chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc n p ie gh tn to - Tiếp tục nghiên cứu khả kháng loại vi khuẩn khác d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Trần Thị Luyến số cộng sự, 2000 Hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bọ, Nha Trang Đặng Văn Phú, Bùi Duy Du, Nguyễn Triệu, Võ Thị Kim Lăng, Nguyễn Quốc Hiến, Bùi Duy Cam “Chế tạo keo nano bạc nano phương pháp chiếu xạ sử dụng Polyvinyl Pyrolidon/Chitosan làm chất ổn định” Tạp chí khoa học lu công nghệ, tập 46, số 3, 2008 Tr 81-86 an Đặng Văn Luyến, 1995 Chitin/Chitosan Các giảng báo cáo chuyên đề va tập 2, 27 – 35 n nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia sản xuất giò lụa, bánh gh tn to Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Đào cộng Nghiên cứu thử ie Viện dinh dưỡng Trung tâm kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm Việt Nam p Lê Thanh Hà, Nguyễn Thị Tuyết Mai, 2011 Nghiên cứu ảnh hưởng đặc nl w tính Chitosan đến khả kháng khuẩn Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 49 oa (6A), 51-57 d Lưu Văn Chính, Châu Văn Minh, Phạm Hữu Điền, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị lu an Thuận, 2000 Tổng hợp nghiên cứu tác dụng hạ Cholesterol máu N,N,N- u nf va trimethyl chitosan Tạp chí Dược học số 9, mục Nguyễn Thị Ngọc Tú (2003), Nghiên cứu dùng vật liệu chitosan làm phụ gia ll thực phẩm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên oi m cứu sở chọn lọc, Viện Hóa Học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công z at nh nghệ quốc gia Phạm Thị Trân Châu, 1992 Thực hành hóa sinh học Nhà xuất Giáo dục z @ Nguyễn Hoàng Hải.“Các hạt nano kim loại (metallic nanoparticles)” Trung m co l Hà Nội gm tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia an Lu n va ac th si 41 10 Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo số cộng “Hồn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua” Báo cáo khoa học, Đề tài cấp Nha Trang, 2000 11 Đặng Văn Luyến, 1995 Chitin/Chitosan Các giảng báo cáo chuyên đề tập 2, 27 – 35 12 Đặng Văn Phú, Bùi Duy Du, Nguyễn Triệu, Võ Thị Kim Lăng, Nguyễn Quốc Hiến, Bùi Duy Cam “Chế tạo keo nano bạc nano phương pháp chiếu xạ sử dụng Polyvinyl Pyrolidon/Chitosan làm chất ổn định” Tạp chí khoa học công nghệ, tập 46, số 3, 2008 Tr 81-86 13 Nguyễn Hoàng Hải.“Các hạt nano kim loại (metallic nanoparticles)” Trung lu tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia an Hà Nội va 14 Trần Linh Thước, 2009 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực n 15 Vương Thị Việt Hoa, 2002, Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm Trường Đại gh tn to phẩm mỹ phẩm, NXB giáo dục ie học Nông Lâm TP.HCM 74 trang p 16 Nguyễn Minh Trí, Một phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn w Chitosan d 2009 oa nl 17 Nguyễn Thị Đồn, Bài giảng mơn học Kiểm nghiệm chất lượng thực phẩm, lu an 18 Trương Thu Hiền, Nguyễn Như Lâm, Nghiên cứu nồng độ diệt khuẩn tối thiểu va dung dịch Nano bạc số chủng vi khuẩn u nf 19 Đỗ Quỳnh My, Phan Diệu Phương, Nghiên cứu chế tạo vật liệu tổ hợp Ag- ll Nano/Carbon nanotubes (CNTs)/Cotton ứng dụng xử lý nước nhiễm m oi khuẩn, Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học Đại học Đà z at nh Nẵng, lần 8, 2012 20 Nguyễn Thị Ngọc Tú (2003), Nghiên cứu dùng vật liệu chitosan làm phụ gia z @ thực phẩm đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên l nghệ quốc gia gm cứu sở chọn lọc, Viện Hóa Học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công an Lu Tiếng Anh m co 21 Lê Huy Chính(chủ biên), Vi sinh y học, Nhà xuất y học, 2003 n va ac th si 42 22 Abdelbasset El Hadrami, et al, 2010 Chitosan in Plant protection Marine Drugs 2010, 8, 968-987 23 Sondi Salopek-Sondi - Silver nanoparticles as antimicrobial agent: "a case smdy on E.coli as a model for gram-negative bacteria" J.Colloid Interface Science 275 (2004) 177-182 24 Liau S Y., D C Read W J., Pugh J R et al ''The antibacterial action of silver ions'' Let.Application Microbiology 25 (1997) 279-283 25 Sucdeb Pal, Yu K T., Joon M S ''Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on theshape of the nanoparticle'' Application & Environement, Microbiology 73 (6) (2007) 1712-1720 lu 26 Feredoon Shahidi, et al, 1999 Food applications of chitin and chitosans Trends an in Food Science & Technology 10, 37-51 va 27 Morimoto M and Shigemasa Y , 1997 Charaterization and bioactivities of n Ronbunshu 54, 621-631 gh tn to chitin and chitosan regulated by their degree of deacetylation Kobunshi ie 28 Hsyue-Jen Hsieh, et al, 2007 Improvement in the properties of chitosan p membranes using natural organic acid solutions as solvents for chitosan nl w dissolution Journal of Medical and Biological Engineering 27, 23 – 28 oa 29 Purnama Darmadji, Masathoshi Izumimoto, 1996 Effect of Chitosan on Meat d Preservation Indonesian Food and Nutrition Progress 3, 51-56 lu an 30 Pradip Kumar Dutta, et al Chitin and chitosan: Chemistry, properties and u nf va applications Journal of Scientific & Industrial Research 63, 20 – 31 31 Lin Jiang, 2009 Comparison of disk difusion, agar dilution, and broth ll oi m microdilution for antimicrobial susceptibility testing of five chitosan Fujian Agricultural and Forestry University, China z at nh 32 Inui Hiroshi Application Biology Science., 1997; Vol 2, N02, p 55 – 65 33 Liu X.F., et al, 2001 Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated z @ chitosan Journal of Applied Polymer Science 79, 1324-1335 l Drugs 2010, 8, 968-987 gm 34 Abdelbasset El Hadrami, et al, 2010 Chitosan in Plant protection Marine m co 35 Mohamed E.I.Badawy and Entsar I.Rabea, 2011 "A Biopolymer chitosan and an Lu its derivatives as promising antimicrobial agents against plant pathogen and n va ac th si 43 their application in crop protection" International Journal of Carbohydarate Chemistry 2011, Article ID 460381, 29 pages 36 Dasheng Liu, Yuanan Wei, Pingjia Yao and Linbin Jiang, 2006 "Determination of the degree of acetylation of chitosan by UV spectrophotometry using dual standards" Carbohydrate Research 341 (2006), 782-785 37 Joseph Goldstein, Dale E Newbury, David C Joy, Charles E Lyman, Patrick Echlin, Eric Lifshin, L.C Sawyer, J.R Michael (2003) "Scanning Electron Microscopy and X-ray Microanalysis" Springer; 3rd ed ISBN-13 9780306472923 38 Gerasimenko D.V., Avdienko I.D., et al, 2004 Antibacterial effects of water- lu soluble low-molecular-weight chitosans on diffirent microorganisms Applied an Biochemistry and Microbiology 40, 253-257 va 39 Jeon Y.J., et al, 2001 Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced n tn to by bioreactor Carbohydrate Polymers 44, 71-76 40 Shimojoh M , et al, 1996 Bactericidal effects of chitosan from squid pens on gh ie oral streptococci Nippon Nogeikagaku Kaishi 70, 787-792 p 41 Feredoon Shahidi, et al, 1999 "Food applications of chitin and chitosans" nl w Trends in Food Science & Technology 10, 37-51 oa 42 Feredoon Shahidi, et al, 1999 Food applications of chitin and chitosans Trends d in Food Science & Technology 10, 37-51 lu an 43 Liau S Y., D C Read W J., Pugh J R et al ''The antibacterial action of silver ll u nf va ions'' Let.Application Microbiology 25 (1997) 279-283 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 44 PHỤ LỤC Bảng 4.5: Hiệu kháng vi khuẩn Bacillus cereus chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc theo thời gian Mật độ Bacillus cereus (CFU/ml) Nồng độ (ppm) 500/6,25 Đệm 8,3 ± 0,05 8,02 ± 0,05 6,12 ± 0,04 8,12 ± 0,05 5,75 ± 0,04 8,45 ± 0,03 12 3,13 ± 0,04 8,61 ± 0,03 16 1,23 ± 0,03 8,79 ± 0,03 20 0,85 ± 0,03 8,82 ± 0,04 24 8,85 ± 0,04 Thời gian (h) lu an n va p ie gh tn to w oa nl Bảng 4.6: Hiệu kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus chế phẩm phối hợp chitosan – nano bạc theo thời gian d an lu Mật độ Bacillus cereus (CFU/ml) Đệm 7,32 ± 0,05 7,20 ± 0,05 z at nh oi m 250/6,25 ll Thời gian (h) u nf va Nồng độ (ppm) 6,85 ± 0,04 7,56 ± 0,05 4,56 ± 0,04 7,89 ± 0,03 12 2,89 ± 0,04 16 1,11 ± 0,03 20 0,76 ± 0,03 24 z @ 8,43 ± 0,03 8,72 ± 0,04 m co l gm 8,67 ± 0,03 an Lu 8,79 ± 0,04 n va ac th si 45 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si