(Luận văn) đánh giá đa hình di truyền của một số giống cam bằng kỹ thuật rapd và issr

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ THU THỦY lu an va n Tên đề tài: tn to ĐÁNH GIÁ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ p ie gh GIỐNG CAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ ISSR nl w d oa KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC nf va an lu lm ul Hệ đào tạo : Chính quy z at nh oi Chun ngành/ngành: Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP z : 2012 - 2016 m co l gm @ Khóa học an Lu Thái Nguyên – năm 2016 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM lu TRẦN THỊ THU THỦY an n va Tên đề tài: tn to ĐÁNH GIÁ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ p ie gh GIỐNG CAM BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ ISSR w d oa nl KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC an lu nf va Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Lớp : K 44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 - 2016 Giảng viên hƣớng dẫn 1: TS Dƣơng Văn Cƣờng Giảng viên hƣớng dẫn 2: PGS TS Đào Thanh Vân z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên – năm 2016 n va ac th si i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp nỗ lực, cố gắng thân, nhân đƣợc giúp đỡ, hƣớng dẫn, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành khóa luận: Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Dƣơng Văn Cƣờng , giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện, tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài hồn thành khố luận lu an Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đào Thanh Vân, Phó trƣởng phịng Đào n va tạo sau đại học, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu trồng ơn đới, Trƣờng Đại học hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Ma Thị Trang, KS Vũ Hoài Nam, cán p ie gh tn to Nông lâm Thái Nguyên tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài phịng thí nghiệm Sinh học phân tử Công nghệ gene, Viện Khoa học Sự Sống, Đại học nl w Thái Nguyên, trực tiếp bảo kĩ làm việc, tạo điều kiện tốt để học d oa tập nghiên cứu an lu Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống - Đại học nf va Thái Nguyên, thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thái Ngun tận tình bảo, giúp đỡ, tạo điều lm ul kiện để học tập hồn thành khố luận z at nh oi Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, ngƣời ln bên cạnh động viên giúp đỡ suốt thời gian thực gm @ Tôi xin chân thành cảm ơn! z khoá luận tháng l Thái nguyên, ngày năm 2016 m co Sinh viên an Lu Trần Thị Thu Thủy n va ac th si ii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần dinh dƣỡng cam tƣơi (tính 100g) Bảng 2.2: Diện tích, suất, sản lƣợng cam, quýt giới 2005 – 2010 Bảng 2.3: Tình hình sản xuất cam số nƣớc vùng châu Á năm 2010 Bảng 2.4: Tình hình sản xuất cam quýt giai đoạn 2006 - 2010 Bảng 2.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cam, quýt giới 19 Bảng 2.6 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền Cam, quýt Việt Nam 30 Bảng 3.1 Danh sách 19 mẫu cam nghiên cứu 32 lu an Bảng 3.2 Trình tự mồi RAPD mồi ISSR sử dụng 33 n va Bảng 3.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 33 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng RAPD ISSR 36 gh tn to Bảng 3.4 Danh mục loại hóa chất sử dụng đề tài 34 ie Bảng 4.1 Những thông số thay đổi qua quy trình 39 p Bảng 4.2 Kết đo độ tinh nồng độ DNA 42 nl w Bảng 4.3 Số phân đoạn DNA xuất mẫu tƣơng ứng với mồi 52 d oa Bảng 4.4 Tỷ lệ phân đoạn đa hình 53 nf va an lu Bảng 4.5 Hệ số tƣơng đồng di truyền 20 mẫu cam, quýt 54 z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 37 Hình 3.2 Minh họa phân đoạn đồng hình, phân đoạn đa hình PCR-RAPD 37 Hình 4.1 Kết điện di DNA tổng số mẫu 10, 20 40 Hình 4.2 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hai mẫu 10, 20 tách từ quy trình với mồi OPM-13 40 Hình 4.3 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số từ 20 mẫu cam, quýt đƣợc tách theo quy trình 42 lu Hình 4.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi an n va OPA-08 43 OPB-18 44 gh tn to Hình 4.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi p ie Hình 4.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPC-08 45 nl w Hình 4.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi d oa OPG-16 46 an lu Hình 4.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi nf va OPG-17 46 Hình 4.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi lm ul OPM-13 47 z at nh oi Hình 4.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi OPA-04 48 Hình 4.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi z gm @ OPQ-18 49 Hình 4.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi l co OPT-01 49 m Hình 4.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với mồi an Lu OP0-04 50 n va ac th si iv Hình 4.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T1 50 Hình 4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T2 51 Hình 4.16 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T3 51 Hình 4.17 Sơ đồ mô tả quan hệ di truyền 20 mẫu cam, quýt nghiên cứu 56 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT lu an n va : Amplified Fragment Length Polymorphism Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimetyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic acid EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid FAO : Food and Agriculture Organization FHB : Fusarium hesd blight ISSR : Inter – simple sequence repeat PCR : Polymerase Chain Reaction gh tn to AFLP RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA p ie RFLP : Simple sequence repeat nl w : Tris-acetate - EDTA d oa TAE SSR : Restriction fragment length polymorphism : Tris - EDTA nf va an lu TE z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si vi MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC .vi Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề lu 1.2 Mục đích đề tài an n va 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học gh tn to 1.4 Ý nghĩa đề tài p ie 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU nl w 2.1 Tổng quan cam, quýt d oa 2.1.1 Nguồn gốc phân loại an lu 2.1.2 Giá trị cam, quýt nf va 2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình sản xuất cam, quýt giới lm ul 2.2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt Việt Nam z at nh oi 2.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử đánh giá đa dạng di truyền 2.3.1 Kỹ thuật RAPD 2.3.2 Kỹ thuật ISSR 10 z gm @ 2.3.3 Một số kỹ thuật khác 11 2.4 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cam, quýt giới l co nƣớc 12 m 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 12 an Lu 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 28 n va ac th si vii Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 32 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 32 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 32 3.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu 33 3.2.1 Thiết bị nghiên cứu 33 3.2.2 Hóa chất 34 3.3 Nội dung nghiên cứu 34 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 lu 3.4.1 Phƣơng pháp tách chiết DNA 34 an n va 3.4.2 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng độ tinh DNA tổng số 35 3.4.4 Phƣơng pháp phân tích đa hình 37 gh tn to 3.4.3 Phƣơng pháp PCR-RAPD 36 p ie 3.4.5 Phƣơng pháp phân tích xử lí số liệu 37 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 nl w 4.1 Tối ƣu hóa quy trình tách chiết DNA tổng số từ cam quýt 38 d oa 4.2 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền RAPD ISSR 43 an lu 4.2.1 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền RAPD với mồi nf va 43 4.2.2 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền ISSR với mồi 50 lm ul 4.3 Phân tích mối quan hệ di truyền giống cam nghiên cứu dựa giản z at nh oi đồ phả hệ DNA 54 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 5.1 Kết luận 59 z TÀI LIỆU THAM KHẢO m co l gm @ 5.2 Đề nghị 59 an Lu n va ac th si Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây cam (citrus sinensis (L) Osbeck) thuộc họ Rutaceae ăn lâu năm có hƣơng vị thơm ngon, giá trị dinh dƣỡng cao đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng Trong thành phần cam chứa nhiều vitamin nhƣ: vitamin A, B1, C, B9; chất xơ; chất khống vi lƣợng; chứa nhiều chất chống oxy hóa có tác dụng lớn phòng ngừa tim mạch, chống khối u, chống viêm [1] Ngồi vỏ lu cam cịn chứa lƣợng lớn tinh dầu mang mùi thơm đặc trƣng đƣợc sử dụng an va công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm dƣợc phẩm n Ở Việt Nam nay, cam đƣợc trồng nhiều vùng miền hình thành gh tn to vùng trồng cam tiếng nhƣ cam Xã Đoài (Nghệ An), cam sành Bố Hạ (Bắc ie Giang), cam sành Hàm Yên (Tuyên Quang), cam canh (Hà Nội)… mang lại lợi ích p kinh tế cao Theo thống kê Bộ NN & PTNN năm 2011, diện tích có múi nl w đƣợc trồng nƣớc ta đạt 124,057 ha, diện tích trồng cam chiếm 70,300 d oa (xấp xỉ 56%) Tuy nhiên vùng địa lý khác phát triển giống an lu cam khác ảnh hƣởng điều kiện tự nhiên, khí hậu, thổ nhƣỡng trình chọn lọc tự nhiên tạo nên đa dạng mặt di truyền cho giống cam nf va Việc đánh giá đa hình di truyền loài cam, quýt cần thiết nhằm cung lm ul cấp thông tin cần ứng dụng công tác nghiên cứu chọn giống, sử dụng hợp z at nh oi lý bảo tồn nguồn gene quý tự nhiên sản xuất [8] Để đánh giá độ tƣơng đồng di truyền giống cam, quýt thị hình thái, cần có đánh giá sâu mặt di truyền đặc z gm @ điểm hình thái đƣợc hình thành từ kết tƣơng tác kiểu gene môi trƣờng Trong năm gần việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng l co dụng rộng rãi phân tích đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng m loài với Các thị phân tử có độ xác cao, nhanh chóng khơng bị an Lu phụ thuộc vào đặc điểm hình thái n va ac th si 50  Mồi OPO 04 Hình 4.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD 20 mẫu cam, quýt với lu an mồi OP0-04 n va (L: Ladder kb, -20: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự nhƣ bảng 3.1) tn to Hình ảnh điện di mồi OPO-04 cho kết phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại gh với kích thƣớc nằm khoảng 600 – 2750 bp Có phân đoạn đồng hình (chiếm p ie 12,5%), cịn lại phân đoạn đa hình (chiếm 87,5%) thể tính đa hình cao với 20 mẫu nghiên cứu oa nl w 4.2.2 Phân tích phân đoạn DNA đa hình di truyền ISSR với mồi  Mồi T1 d nf va an lu z at nh oi lm ul z gm @ Hình 4.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T1 l (L: ladder kb, -20: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự nhƣ bảng 3.1) co Từ ảnh điện di ta thấy mồi ISSR-T1 có phân đoạn đƣợc khuếch đại có kích m thƣớc dao động khoảng 1100 – 2000 bp Tất phân đoạn đồng hình an Lu cho thấy với mồi ISSR-T1 20 mẫu nghiên cứu khơng có sai khác mặt di truyền n va ac th si 51  Mồi T2 Hình 4.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T2 lu (L: Ladder kb, -20: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự nhƣ bảng 3.1) an Từ hình ảnh điện di cho thấy với mồi ISSR-T2 có phân đoạn DNA đƣợc va n khuếch đại, với kích thƣớc nằm khoảng 950 – 2500 bp Tất phân  Mồi T3 p ie gh tn to đoạn đa hình (chiếm 100%), thể tính đa hình cao với mẫu nghiên cứu d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul Hình 4.16 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR 20 mẫu cam, quýt với mồi T3 (L: Ladder kb, -20: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự nhƣ bảng 3.1) z Hình ảnh điện di cho thấy, mồi ISSR-T3 có phân đoạn DNA đƣợc khuếch @ gm đại với kích thƣớc dao động khoảng 1100 – 2400 bp Ở kích thƣớc 1100bp m co phân đoạn đa hình (chiếm 60%) l 1600 bp xuất phân đoạn đồng hình (chiếm 40%) đƣợc khuếch đại Còn lại thể nhƣ bảng 4.3 bảng 4.4 an Lu Tổng số băng xuất ứng với mồi mẫu cam, quýt đƣợc thống kê n va ac th si lu 52 an va n Bảng 4.3 Số phân đoạn DNA xuất mẫu tƣơng ứng với mồi to OPB -18 OPC -08 OPG -16 OPG -17 OPM -13 OPO -04 OPQ -18 OPT -01 OPA -04 T1 T2 T3 Tổng 3 3 3 3 3 5 5 5 72 5 5 5 5 6 6 7 7 108 5 5 5 6 5 5 4 94 2 2 3 3 3 2 3 3 3 55 6 5 6 6 5 6 6 112 6 6 4 5 6 4 93 6 4 5 6 6 4 97 6 5 6 5 4 4 5 87 7 8 8 8 10 10 9 9 6 156 4 4 5 4 4 4 4 3 84 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 80 1 2 2 2 2 2 2 2 34 4 4 4 3 4 4 4 4 4 76 55 57 55 60 52 61 59 57 57 61 61 64 63 57 61 61 52 41 59 54 1148 d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu Mẫu S_PL S_KH/M1 S_KH/M2 S_KH/V1 S_KH/V2 M_KH/M1 M_KH/M2 M_KH/V1 M_KH/V2 S_HY1 S_HY2 V2-1 V2-2 NV1 NV2 XD1 XD2 TH32-1 TH32-2 Q_KH Tổng OPA -08 p ie gh tn Mồi n va ac th si 53 Kết cho thấy, với 13 mồi nghiên cứu tổng số phân đoạn thu đƣợc tất mẫu với tất mồi 1148 phân đoạn, trung bình 4,42 phân đoạn/mẫu Số phân đoạn DNA mẫu có biến động lớn mồi: Nhóm mồi OPT-01, OPG-17, OPB-18, OPO-04 cho số phân đoạn trung bình cao, tƣơng ứng đạt 7,8; 5,6; 5,4; 4,85 băng; mồi T2 cho số phân đoạn mồi thấp 1,7 băng/mồi, nhóm mồi lại cho số phân đoạn mẫu dao động 2,75 – 4,65 băng Bảng 4.4 Tỷ lệ phân đoạn đa hình Tên mồi OPA-08 OPB-18 57,14 OPC-08 7 100 OPG-16 66 OPG-17 11 11 100 OPM-13 7 100 d 10 80 lu STT an n va Tổng số phân đoạn đƣợc khuếch đại Số phân đoạn đa hình Tỷ lệ (%) phân đoạn đa hình 80 p ie gh tn to oa nl w OPA-04 OPO-04 87,5 OPQ-18 7 100 10 OPT-01 11 72,7 11 T1 12 T2 z at nh oi 3 100 13 T3 5 100 75 82,42 nf va an lu lm ul z m co l gm 91 @ Tổng an Lu Từ bảng 4.4 cho thấy tổng số phân đoạn DNA 20 mẫu cam, quýt phân tích 13 mồi 91 phân đoạn, có 75 phân đoạn đa hình (chiếm n va ac th si 54 82,42%) số phân đoạn đồng hình 16 phân đoạn (chiếm 17,58%) Kích thƣớc phân đoạn DNA nằm khoảng từ 200 – 3500 bp Số lƣợng phân đoạn tƣơng ứng với mồi nằm khoảng từ đến 11 phân đoạn, mồi nhân đƣợc phân đoạn DNA mồi ISSR-T2 (3 phân đoạn) mồi nhân đƣợc nhiều phân đoạn mồi OPG-17 (11 phân đoạn) Bảng 4.4 cho thấy, có 12 mồi sử dụng biểu tính đa hình với 20 mẫu nghiên cứu, mồi T1 khơng cho phân đoạn đa hình với 20 mẫu nghiên cứu 4.3 Phân tích mối quan hệ di truyền giống cam nghiên cứu dựa giản đồ phả hệ DNA lu Dựa xuất hay không xuất phân đoạn DNA an n va giống điện di sản phẩm PCR RAPD ISSR xác định số đa dạng di phân tích theo chƣơng trình NTSYSpc phiên 2.1, theo quy ƣớc: có xuất gh tn to truyền giống cam, quýt mức độ phân tử Các số liệu đƣợc tính tốn ie băng sáng = 1; không xuất = Kết nhận đƣợc hệ số tƣơng đồng di p truyền cá thể đƣợc thể nhƣ bảng 4.5 nl w Hệ số tƣơng đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền giống cam d oa với Hai giống gần mặt di truyền hệ số tƣơng đồng an lu chúng lớn ngƣợc lại, hai giống có hệ số tƣơng đồng di truyền thấp mối nf va quan hệ di truyền chúng xa Từ kết nhƣ bảng 4.5 cho thấy, hệ số di truyền 20 mẫu cam quýt dao động khoảng 0,57 đến 0,96 Trong đó, lm ul cặp mẫu kí hiệu M_KH/M1 M_KH/M2, mẫu M_KH/M2 M_KH/V1, mẫu z at nh oi M_KH/V1 M_KH/V2, mẫu V2-1 V2-2 có hệ số đồng dạng lớn 0,96; mẫu V2-1, TH32-1 Q_KH có hệ số tƣơng đồng nhỏ 0,57 Giống quýt (Q_KH) cho thấy có khác biệt di truyền lớn so với mẫu lại z m co l gm @ an Lu n va ac th si 55 lu an va n Bảng 4.5 Hệ số tƣơng đồng di truyền 20 mẫu cam, quýt to S_PL S_PL 1,00 0,89 S_KH/ M1 0,87 0,82 S_KH/ V1 0,91 S_KH/ V2 M_KH/ M1 M_KH/ M2 M_KH /V1 M_KH /V2 S_HY1 S_H Y2 V2-1 V2-2 NV1 NV2 XD1 XD2 TH32-1 TH32-2 Q_KH 1,00 oa nl w 0,90 S_KH/ M2 1,00 0,90 0,90 1,00 0,82 0,82 0,90 1,00 d 0,89 0,92 0,87 1,00 0,89 0,89 0,87 0,90 0,85 0,96 1,00 0,87 0,85 0,82 0,90 an 0,85 0,91 0,96 1,00 0,85 0,85 0,85 0,90 0,87 0,89 0,91 0,96 1,00 S_HY1 0,82 0,87 0,85 0,86 0,78 0,87 0,87 0,85 0,85 1,00 S_HY2 0,85 0,85 0,82 0.84 0,78 0,80 0,76 0,76 0,91 1,00 V2-1 0,76 0,78 0,74 0,77 0,71 0,76 0,74 0,71 0,71 0,74 0,76 1,00 V2-2 0,78 0,80 0,76 0,77 0,71 0,78 0,76 0,71 0,71 0,76 0.78 0.96 1,00 NV1 0,80 0,76 0,71 0.77 0,76 0,76 0,80 0,78 0,76 0,71 0,71 0,87 0,91 1,00 NV2 0,74 0,74 0,71 0,70 0,64 0,71 0,74 @ 0,71 0,69 0,73 0,73 0,89 0,93 0,89 1,00 XD1 0,74 0,76 0,71 0,73 0,67 0,76 0,76 0,74 0,71 0,71 0,74 0,89 0,93 0,89 0,93 1,00 XD2 0,74 0,69 0,65 0,66 0,63 0,65 0,69 TH32-1 0,71 0,69 0,65 0,64 0,65 0,63 0,65 TH32-2 0,71 0,67 0,60 0,66 0,63 0,67 0,71 0,71 Q_KH 0,68 0,64 0,62 0,63 0,62 0,64 0,68 0,68 ll fu 0,91 a lu 0,89 nv S_KH/M S_KH/M S_KH/V S_KH/V M_KH/ M1 M_KH/ M2 M_KH/ V1 M_KH/ V2 p ie gh tn Giống (Kí hiệu) oi m 0,82 z at nh z o l.c gm 0,69 0,65 0,63 0,76 0,80 0,82 0,87 0,82 1,00 0,63 0,63 0,63 0,69 0,69 0,74 0,71 0,76 0,76 0,71 1,00 0,69 0,63 0,63 0,76 0,80 0,87 0,85 0,87 0,82 0,71 1,00 0,66 0,59 0,62 0,57 0,59 0,66 0,62 0,64 0,64 0,57 0,66 m 0,69 an Lu 1,00 n va ac th si 56 lu an va n Sau phân tích hệ số đồng dạng di truyền 20 mẫu nghiên cứu, chúng tơi tiến hành xây dựng sơ đồ hình thể to gh tn hình 4.17 để sai khác di truyền 20 mẫu cam, quýt nghiên cứu Mức độ khác đƣợc thể hệ số p ie sai khác di truyền mẫu nghiên cứu Các mẫu nghiên cứu có hệ số di truyền tƣơng đƣơng đƣợc xếp vào d oa nl w nhóm nhóm có liên kết với ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ Lu Hình 4.17 Sơ đồ mô tả quan hệ di truyền 20 mẫu cam, quýt nghiên cứu an va Coefficient: Hệ số tƣơng đồng di truyền giống cam, n hệ số lớn giống có mối quan hệ gần gũi ac th si 57 Cây phân loại hình 4.17 đƣợc tạo phân tích 20 mẫu nghiên cứu với 10 mồi RAPD mồi ISSR cho thấy hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu cam, quýt nghiên cứu dao động khoảng từ 0,63 – 0,96; chứng tỏ mẫu cam, quýt có đa hình cao mặt di truyền Từ sơ đồ thấy đƣợc 20 mẫu cam, quýt đƣợc chia làm nhóm chính: Nhóm I: Là mẫu đối chứng qt khơng hạt (Q_KH) Mẫu quýt nằm riêng biệt so với mẫu cam lại Khoảng cách di truyền so với mẫu cam cịn lại nhóm II 0,37 Nhóm II: Bao gồm 19 mẫu cam Trong nhóm tiếp tục đƣợc chia thành nhóm lu an phụ, bao gồm: Nhóm phụ I: chủ yếu giống cam nhập nội nhóm phụ II n va giống cam không hạt, với sai khác di truyền 0,30 (hệ số tƣơng đồng di + Nhóm phụ I: Bao gồm mẫu, chủ yếu giống cam nhập nội, đƣợc chia gh tn to truyền hai nhóm phụ 0,70) ie tiếp thành cụm (cụm cụm 2) có sai khác di truyền 0,28 (tức hệ số tƣơng p đồng di truyền 0,72) nl w  Cụm 1: bao gồm mẫu: hai mẫu cam Valencica (V2-1, V2-2), mẫu cam d oa Navel (NV2, NV1), hai mẫu cam xã Đoài (XD1, XD2) mẫu cam TH32-2 an lu Trong đó, hai mẫu cam Valencica (V2-1 V2-2) có hệ số tƣơng đồng di truyền cao nf va 0,96; hai mẫu NV2 XD1 với hệ số tƣơng đồng di truyền 0,93 Trong cụm có mẫu XD2 nằm tách biệt nhánh với tƣơng đồng di lm ul truyền với mẫu lại 0,81 (sự sai khác di truyền 0,19) z at nh oi  Cụm 2: Chỉ bao gồm mẫu TH32-1 Trong nhóm có giống cam TH32 giống cam chƣa biết rõ nguồn z gốc, đƣợc lấy mẫu nông trƣờng 32 tỉnh Tuyên Quang Từ sơ đồ hình cho gm @ thấy, hai mẫu có sai khác lớn di truyền Hệ số tƣơng đồng di truyền với l giống cam Valencica, Navel, xã Đồi giống TH32-2 có hệ số tƣơng đồng di m co truyền lớn (đạt 0.83) so với giống TH32-1 (đạt 0,72) Giống cam Xã Đồi (XD1) giống cam có nguồn gốc từ Nghệ An, nhiên trình sinh an Lu trƣởng phát triển Tuyên Quang điều kiện tự nhiên làm biến đổi kiển gene làm n va ac th si 58 cho giống cam có quan hệ gần gũi với giống cam Navel với hệ số tƣơng đồng di truyền 0,93 + Nhóm phụ II: Bao gồm 11 mẫu, chủ yếu giống cam địa phƣơng: cam sành Hàm Yên, cam sành Phù Lƣu (S_PL, S_HY) giống cam ghép Đƣợc chia làm cụm (cụm 1’ cụm 2’) với sai khác di truyền 0,18 (hệ số tƣơng đồng di truyền cụm 0,82)  Cụm 1’: Bao gồm mẫu: cam sành Phù lƣu, cam sành không hạt ghép gốc cam mật, cam sành không hạt ghép gốc cam Volka, cam mật không hạt ghép gốc cam mật cam mật không hạt ghép gốc cam volka (S_PL, lu an S_KH/M1, S_KH/M2, S_KH/V1, S_KH/V2, M_KH/M1, M_KH/M2, M_KH/V1, n va M_KH/V2) Trong cụm có cặp nhóm: M_KH/M1 M_KH/M2, M_KH/V1 S_KH/M1 S_KH/M2 có hệ số tƣơng đồng 0,91 Bên cạnh cụm có gh tn to M_KH/V2 có hệ số tƣơng đồng di truyền cao 0,96 Tiếp theo cặp mẫu p ie mẫu cam sành không hạt ghép gốc cam Volka (S_KH/V2) nằm tách biệt thành nhánh cho thấy khác biệt với giống cam sành khác, với sai khác di nl w truyền 0,15; sai khác ảnh hƣởng trình chọn lọc tự nhiên d oa dẫn tới thay đổi kiểu gene an lu  Cụm 2’: Bao gồm mẫu cam sành Hàm Yên (SHY1 SHY2) với hệ số nf va tƣơng đồng di truyền cao đạt 0,91 Trong nhóm cho thấy có tƣơng đồng di truyền cao giống cam: lm ul giống cam mật đƣợc xếp thành cụm với hệ số tƣơng đồng di truyền đạt z at nh oi 0,92 Điều cho thấy chúng có mối quan hệ gần gũi mặt di truyền Từ kết phân nhóm sơ đồ quan hệ di truyền có sai khác rõ z hai nhóm: Nhóm phụ I: bao gồm chủ yếu giống cam nhập nội cịn Nhóm phụ gm @ II giống cam địa phƣơng Sự sai khác nguồn gốc giống cam m co l hay điều kiện tự nhiên làm ảnh hƣởng tới kiểu gene chúng an Lu n va ac th si 59 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận  Đã tối ƣu hóa đƣợc quy trình tách chiết DNA tổng số từ cam, quýt cho độ tinh cao đứt gãy  Qua trình nghiên cứu với việc sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên RAPD mồi ISSR để khuếch đại DNA tổng số từ 20 mẫu cam, quýt thu đƣợc: - Tổng số 1148 phân đoạn DNA đƣợc khuếch đại từ hệ gene 20 mẫu cam, lu an quýt Trung bình 4,42 phân đoạn/mẫu n va - Số phân đoạn DNA phân tích 13 mồi 91 phân đoạn, có phân đoạn (chiếm 17,58%) Trong 13 mồi sử dụng có 12 mồi thể tính đa hình gh tn to có 75 phân đoạn đa hình (chiếm 82,42%) số phân đoạn đồng hình 16 p ie với 20 mẫu cam, quýt; mồi T1 không cho phân đoạn đa hình phân tích với 20 mẫu cam, quýt nl w - Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu cam, quýt dao động khoảng d oa từ 0,57 – 0,96 an lu - Từ sơ đồ phân loại nhận thấy 20 mẫu cam, quýt đƣợc chia thành nhóm nf va với hệ số sai khác di truyền 0,37 (độ tƣơng đồng di truyền 0,63) - Cây sơ đồ chia 19 mẫu cam thành nhóm chính: lm ul + Nhóm phụ I: gồm mẫu chủ yếu bao gồm giống cam nhập nội cam z at nh oi Valencica, cam navel, cam TH32 cam Xã Đoài + Nhóm phụ II: bao gồm 11 mẫu cam hầu hết mẫu cam có nguồn gốc z địa phƣơng: cam sành phù lƣu, cam sành không hạt, cam mật không hạt, cam sành l gm 5.2 Kiến nghị @ Hàm Yên co Kết hợp số kỹ thuật phân tích quan hệ di truyền khác nhƣ SSR, m RFLP, để xác định mối quan hệ di truyền giống cam quýt để kết an Lu tin cậy cao n va ac th si TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Đƣờng Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, NXB Lao động-xã hội Nguyễn Văn Giang, Vũ Ngọc Lan, Tống Văn Hải (2013), Nghiên cứu đa dạng di truyền khoai Môn - Sọ thị phân tử DNA, Tạp chí Khoa học Phát triển, 11(1), - Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn, Nguyễn Văn Đƣợc lu (2004), Đa dạng sinh học giống có múi huyện Gị Quao, tỉnh Kiên an n va Giang, Tạp chí Khoa học, 1, 111 - 121 Sáng, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo (2015), Phân tích đa dạng di truyền mẫu giống cam sành Hà Giang thị RAPD ISSR, Tạp chí Khoa p ie gh tn to Vũ Văn Hiếu, Nông Thị Huệ, Nguyễn Thị Oanh, Ninh Thị Thảo, Vũ Quang học Phát triển, 13(6), 867-875 nl w Nguyễn Thanh Nhàn, Nguyễn Minh Châu, Tokurou Shimizu, Mitsuo Omura d oa (2004), Ứng dụng RAPD marker phân biệt giống phân tích nhóm an lu giống/loài thuộc chi Citrus Việt Nam, 48 - 56 pp., Nxb Nông Nghiệp nf va Nguyễn Bá Phú, Nguyễn Bảo Vệ, Trần Nhân Dũng, Bùi Thị Cẩm Hƣờng (2011), Nhận diện xác định mối quan hệ di truyền hai cá thể quýt Đƣờng lm ul không hột đƣợc phát Đồng Bằng Sông Cửu Long dấu phân tử z at nh oi DNA, Tạp chí Khoa học, 20a, 108 - 118 Nguyễn Quang Thạch Tách chiết ADN, Viện sinh học Nông nghiệp Nguyễn Đức Thành (2014), Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn z gm @ lọc thực vật, Tạp chí sinh học, 36(3), 265-294 Trần Thị Oanh Yến, Nguyễn Ngọc Thi, Luro Francois (2004), Phân biệt tính đa l m marker, 57 - 66 pp., Nxb Nông Nghiệp co dạng di truyền nguồn gen ăn có múi Việt Nam microsatellite an Lu n va ac th si II Tài liệu tiếng anh 10 Adam Healey, Agnelo Furtado, Tal Cooper, and Robert J Herny (2014), Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species, Plant Methods 11 Asadi Abkenar, and Isshiki S (2003), Molecular characterization and genetic diversity among Japanese acid citrus (Citrus spp.) based on RAPD markers, The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 78(1), 108-112 12 Baig M N R, Sapna GREWAL, and Santosh DHILLON (2008), Molecular characterization and genetic diversity analysis of citrus cultivars by RAPD lu markers, Turk J Agric For 33(2009), 375 - 384 an 13 Beedanagari SR, Dove SK, Wood BW, and Conner PJ (2005), A first linkage va n map of pecan cultivars based on RAPD and AFLP markers, Theor Appl to tn Genet, 110(6), 1127 - 1137 polymorphism analysis of somatic embryo-derived plantlets of Cymbopogon p ie gh 14 Bhattacharya S, Dey T, Bandopadhyay T K, and Ghosh P D (2008), Genetic flexuosus through RAPD assay, Plant Biotechnology Reports, 2(4), 245-252 w oa nl 15 Davies, and F S (1986), The navel orange Rep., J Janick (ed.) AVI Press, d Westport, Conn., In: Hort Reviews lu an 16 De Pasquale F, Siracuga M, Abbate L, Tusa N, De Pasquale C, and Alonzo G nf va (2006), Characterization of five sour orange clones through molecular markers lm ul and leaf essential oils analysis, Scisentia Horticulturae, 109(1), 54 - 59 17 Dehesdtani A, Kazemitabar S K, and Rahimian H (2007), Assessment of z at nh oi Genetic Diversity of Navel Sweet Orange Cultivars Grown in Mazandaran Province Using RAPD Markers, Asian Journal of Plant z Sciences, 6(7), 1119 - 1124 @ 18 Doyle and Doyle, Doyle and Dickson, and Cullings (1987), CTAB/Chloroform- l gm Isoamyl Alcohol DNA Extraction Protocol m co 19 Ebtsam M Hamza (2013), Genetic Diversity of Some Citrus Varieties Based on Microsatellite and RAPD Molecular Markers in Egypt, World Journal of an Lu Agricultural Sciences, 9(4), 316 - 324 n va ac th si 20 Fang G, Hammar, and Grumet R (1992), A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA, BioTechniques, 13(1), 52 - 56 21 Gupta V S, and Ranjekar P K (1994), Use of RFLP/RAPD approach in genetic diversity analysis, bacterial blight resistance gene tagging and DNA fingerprinting in rice 22 Helvécio Della Coletta Filho, Marcos Antonio Machado, M Luiza P.N Targon, and Jorgino Pompeu Jr (2000), The use of random amplified polymorphic DNA to evaluate the genetic variability of Ponkan lu an mandarin (Citrus reticulata Blanco) accessions, Genetics and Molecular n va Biology, 23(1), 169 - 172 Genetic relationship of Mediterranean mandarins (Citrus deliciosa Tenore) using RAPD markers, Euphytica, 92(3), 321 - 326 p ie gh tn to 23 Machado M A, Coletta Filho H D, Targon m N P L, and PompeuJr J (1996), 24 Malik S K, Rohini M R, Susheel Kumar, Ravish Choudhary, Digvender Pal, and nl w Rekha Chaudhury (2012), Assessment of Genetic Diversity in Sweet Orange d oa [Citrus sinensis (L.) Osbeck] Cultivars of India Using Morphological and an lu RAPD Markers, Agric Res 1(4), 317 - 324 nf va 25 Marinês Bastianel, Sérgio F Schwarz, Helvécio Della Coleta Filho, Linda Lee Lin, Marcos Machado, and Otto C Koller (1998), Identification of zygotic lm ul and nucellar tangerine seedlings (Citrus spp.) using RAPD, Genet Mol z at nh oi Biol., 21(1), 123 - 127 26 Marinês Bastianel, Ana Lúcia Cunha Dornelles, Marcos Antonio Machado Ester Wickert, Simone de Farias Maraschin, Helvécio Della Coletta Filho, and z gm @ Gilmar Schäfer (2001), Characterization of citrus genotypes (Citrus spp.) using RAPDs markers, Ciência Rural, 31(5), 763 - 768 l co 27 Mariniello L, Sommella M G, Cozzolino A, Di Pierro P, Ercolini D, and Porta R m (2005), Identification of Campania Citrus Limon L by Random Amplified an Lu Polymorphic DNA Markers, Food Biotechnology, 18(3), 289 - 297 n va ac th si 28 Murray M G, and Thompson W F (1980), Rapid isolation of high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Research, 8, 4321-4325 29 Nagai, and Tanigawa K O (1928), On Citrus pollination, Procthird, Pan pacific.Sci.Cong.2(2023 - 2029) 30 Naz S, Shahzadi K, Rashid S, Saleem F, Zafarullah A, and Shabbir Ahmad (2014), Molecular characterization and phylogentic relationship of different Citrus varieties of Pakistan, The Journal of Animal & Plant Sciences, 24(1), 315 - 320 31 Orozco C C, Chalmers K J, Waugh R, and Powell W (1994), Detection of lu an diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD markers, n va Theor Appl Genet., 87, 934 - 940 FreitasI (2003), Characterization of mandarin citrus germplasm from Southern Brazil by morphological and molecular analyses, Pesq agropec p ie gh tn to 32 Patrícia Koehler-SantosI, Ana Lúcia Cunha DornellesII, and Loreta Brandão de bras., 38(7), 797 - 806 nl w 33 Rima El-Mouei, Wafaa Choumane, and Fayssal Dway (2011a), Characterization d oa and Estimation of Genetic Diversity in Citrus Rootstocks, International an lu Juornal of Agriculture & Biology, 13(4), 571 - 575 nf va 34 Rima El-Mouei, Wafaa Choumane, and Fayssal Dway (2011b), Molecular Characterization and Genetic Diversity in Genus Citrus from Syria, Int J lm ul Agric Biol., 13(2), 351 - 356 z at nh oi 35 Saghai - maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, and Allard RW (1984), Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics, Proc Natl z gm @ Acad Sci USA, 81(24), 8014 - 8018 36 Shahzadi, Ahmed R, Hassan A, and Shah M M (2010), Optimization of l co DNA extraction from seeds and fresh leaf tissues of wild marigold m (Tagetes minuta) for polymerase chain reaction analysis, Genet Mol an Lu Res., 9(1), 386 - 393 n va ac th si 37 Shashi Ranjan, Garima Kishore, Vikash S Jadon, JP Bhatt, and Sanjay Gupta (2010), Standardization of extraction of genomic DNA and PCR-RFLP conditions of Allium stracheyi: A high altitude plant, Academia Arena, 2(7), 11 - 14 38 Sonia Chadha, and Gopalakrishna T (2005), Genetic diversity of Indian isolates of rice blast pathogen (Magnaporthe grisea) using molecular markers, Current Science, 88(9), 1466 - 1469 39 Sun G, bond M, Martin R, and Dong Z (2003), RAPD polymorphism in spring wheat cultivars and line with different level of Fusarium resistance, Theor lu an Appl Genet., 106, 1059 - 1067 n va 40 Yun-Jiang Cheng, Wen-Wu Guo, Hua-Lin Yi, Xiao-Min Pang, and Xiuxin to Deng (2003), An Efficient Protocol for Genomic DNA Extraction From p ie gh tn Citrus Species, Plant Molecular Biology Reporter, 21, 177a–177g d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si