Đánh giá đa dạng di truyền của một số giống dứa thơm (pandanus amaryllifolius roxb ) ở khu vực miền núi phía bắc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÙI THỊ LINH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG DỨA THƠM (Pandanus amaryllifolius) Ở KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: CNSH – CNTP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khóa học: 2018 - 2022 THÁI NGUYÊN – 2023 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÙI THỊ LINH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG DỨA THƠM (Pandanus amaryllifolius) Ở KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: CNSH – CNTP Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa học: 2018 – 2022 Họ tên người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Tiến Dũng THÁI NGUYÊN – 2023 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khố luận tốt nghiệp với nỗ lực cá nhân, em nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cơ, bạn bè gia đình Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng, người trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa CNSH - CNTP dạy dỗ giúp đỡ em suốt thời gian vừa qua Em xin chân thành cảm ơn đến tới cán bộ, anh chị làm việc Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Phát triển bền vững Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện để em học tập nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ em vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện thân Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng Sinh viên Bùi Thị Linh năm 2023 ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT .iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH .vi PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề 1.2.Mục tiêu đề tài 1.2.1.Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1.Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1.Tổng quan dứa thơm 2.1.1.Nguồn gốc phân loại giống dứa thơm 2.1.2.Đặc điểm nông sinh học 2.1.3.Thành phần hóa học 2.1.4.Công dụng 2.2.Chỉ thị ISSR 2.3.Tình hình nghiên cứu thị ISSR thực vật 2.4.Ứng dụng thị ISSR đánh giá di truyền dứa thơm PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 3.1.Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 10 3.2.Địa điểm thời gian nghiên cứu 10 3.3.Vật liệu nghiên cứu, hóa chất thiết bị sử dụng 10 3.3.1.Vật liệu nghiên cứu 10 3.3.2.Hóa chất nghiên cứu 11 3.3.3.Thiết bị nghiên cứu 12 iii 3.4 Nội dung nghiên cứu 12 3.5.Phương pháp nghiên cứu 12 3.5.1 Đánh giá đặc điểm hình thái 12 3.5.2.Phương pháp tách chiết DNA tổng số 13 3.5.3.Phương pháp kiểm tra nồng độ DNA 13 3.5.4.Phương pháp PCR 14 3.5.5.Phương pháp điện di Gel Agarose 15 3.5.6.Phương pháp phân tích mối quan hệ di truyền dựng phân loại 15 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Đặc điểm hình thái từ giống dứa thơm thu thập 17 4.1.1 Đặc điểm hình thái chiều cao 17 4.1.2 Đặc điểm hình thái kích thước 18 4.2 Kết nghiên cứu đặc điểm đa dạng di truyền thị ISSR 21 4.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số 21 4.2.2 Kết PCR sử dụng mồi ISSR 22 4.2.3 Sơ đồ phân loại hệ số đa dạng di truyền giống dứa thơm 28 4.2.4 Sơ đồ phân loại hệ số đa dạng di truyền giống dứa thơm 28 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC iv DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ Từ, thuật ngữ viết tắt DNA ISSR PCR PIC Deoxyribonucleic Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản (InterSimple Sequence Repeat-ISSR) Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Polymorphic Information Content (chỉ số đa hình di truyền hay thước đo độ đa hình) Unweighted Pair Group Method using UPGMA arithmetic Averages (phương pháp nhóm cặp khơng trọng số với giá trị trung bình số học) v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các giống dứa thơm thu thập số tỉnh miền núi phía Bắc 10 Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 11 Bảng 3.3 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm 11 Bảng 3.4 Các dụng cụ, thiết bị sử dụng thí nghiệm 12 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR 14 Bảng 4.1 Một số đặc điểm hình thái giống dứa thơm nghiên cứu 18 Bảng 4.2 Kích thước giống dứa thơm nghiên cứu 19 Bảng 4.3 Kết đo nồng độ DNA 21 Bảng 4.4 Tổng số phân đoạn DNA nhân giống dứa thơm phân tích với mồi ISSR 23 Bảng 4.5 Tỷ lệ phân đoạn đa hình sử dụng mồi ISSR 24 vi DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Chu trình nhiệt chạy PCR khuếch đại DNA 15 Hình 4.1 Hình ảnh giống dứa thơm thu thập 17 Hình 4.2 Hình ảnh giống dứa thơm thu thập 19 Hình 4.3 Sơ đồ phân loại dựa hình thái giống dứa thơm nghiên cứu 20 Hình 4.4 Kết điện di kiểm tra mồi với giống BL-TN 22 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm ISSR với mồi ISSR8 giống dứa thơm 25 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm ISSR với mồi ISSR14 giống dứa thơm 26 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm ISSR với mồi ISSR880 giống dứa thơm 27 Hình 4.8 Sơ đồ mối quan hệ di truyền giống dứa thơm với mồi ISSR8, ISSR14 ISSR880 29 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Việt Nam nước có vị trí địa lý vơ thuận lợi với khí hậu nhiệt đới độ ẩm cao giúp cho cối sinh trưởng phát triển mạnh, nguồn tài nguyên quan trọng cho tiềm dược liệu Theo ước tính, nước ta có 12000 lồi thực vật bậc cao, có khoảng 4000 loài sử dụng làm thuốc Ngày nay, nhu cầu thuốc có nguồn gốc từ dược liệu ngày tăng, việc sâu vào nghiên cứu, xác minh kinh nghiệm y học cổ truyền tìm kiếm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao giới quan tâm[1] Việt Nam lại nước giàu nguồn tài nguyên dược liệu nên việc sâu vào nghiên cứu phát triển sản phẩm từ tự nhiên hướng hoàn đắn Việt Nam sở hữu hệ sinh thái vô phong phú đa dạng, nhiều loại quý có giá trị cao ngành thực phẩm, hương liệu, mỹ phẩm dược liệu Trong giống dứa thơm có tên khoa học Pandanus amaryllifolius, thuộc họ dứa dại (Pandanaceae), phân bố tỉnh miền núi trung du phía Bắc vào đến Khánh Hòa [5] Theo dân gian, dứa thơm loại dược liệu, hương liệu có mặt nhiều thuốc hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa, đái tháo đường, sỏi tiết niệu, lợi tiểu, an thần, tiêu viêm, giảm phù nề,… Đây tiền đề cho y học đại tiếp tục sâu nghiên cứu Công tác thu thập, bảo tồn đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen thực vật bước nghiên cứu quan trọng cho việc phân biệt loài khác tìm hiểu liên hệ di truyền loài để bảo tồn nguồn đa dạng gene, sở việc chọn tạo giống chất lượng cao, phù hợp với vùng sinh thái Có nhiều phương pháp khác sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền phương pháp sử dụng đặc điểm hình thái, thị isozyme, hay thị phân tử (RFLP, RAPD, AFLP, SSR, ISSR) Tùy vào đối tượng, điều kiện mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp phù hợp Trong đó, đặc điểm hình thái thị phân tử ISSR phương pháp phân tích sử dụng hiệu nghiên cứu phân loại phát sinh loài Nhận thức vấn đề này, em lựa chọn đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền số giống dứa thơm (Pandanus amaryllifolius Roxb.) khu vực miền núi phía Bắc” để xác định đa dạng di truyền giống dứa thơm, giúp thuận tiện cho nghiên cứu sau liên quan đến dứa thơm, bảo tồn nguồn gene đa dạng giống 1.2.Mục tiêu đề tài 1.2.1.Mục tiêu tổng quát - Đánh giá đa dạng di truyền giống dứa thơm thu thập số tỉnh khu vực miền núi phía Bắc 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Đánh giá đặc tính hình thái mẫu dứa thơm thu thập - Tách chiết DNA tổng số mẫu dứa thơm thu thập - Lựa chọn thị ISSR - Phân tích mối quan hệ di truyền 1.3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1.Ý nghĩa khoa học đề tài - Cung cấp liệu khoa học đa dạng di truyền mức hình thái mức độ phân tử số giống dứa thơm 1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn đề tài - Góp phần thu thập lưu giữ nguồn gene giống dứa thơm Việt Nam - Góp phần bảo tồn sử dụng hợp lí nguồn gene giống dứa thơm - Làm sở cho việc lai tạo nhân giống, nâng cao chất lượng sản phẩm sử dụng nguyên liệu dứa thơm Descriptives VAR00002 95% Confidence Interval for Mean Std N Mean Deviation Std Error Lower Bound Upper Minimu Bound m BG 10 147.1000 156.74852 49.56824 34.9689 259.2311 21.00 ĐHy1 10 122.7000 190.63581 60.28434 -13.6726 259.0726 49.00 ĐHy2 10 61.9000 4.04008 1.27758 59.0099 64.7901 55.00 ĐH 10 60.8000 5.32917 1.68523 56.9877 64.6123 50.00 AK 10 57.3000 6.25478 1.97793 52.8256 61.7744 47.00 QT 10 63.1000 2.23358 70632 61.5022 64.6978 59.00 TV 10 63.7000 4.94526 1.56383 60.1624 67.2376 55.00 MC 10 56.6000 6.16802 1.95050 52.1877 61.0123 48.00 CX 10 59.7000 6.53282 2.06586 55.0267 64.3733 50.00 Total 90 76.9889 84.77472 8.93604 59.2332 94.7446 21.00 Descriptives VAR00002 Maximu m BG 375.00 ĐHy1 665.00 ĐHy2 67.00 ĐH 67.00 AK 67.00 QT 66.00 TV 69.00 MC 65.00 CX 68.00 Total 665.00 ANOVA VAR00002 Sum of Squares Between df Mean Square 89665.889 11208.236 Within Groups 549955.100 81 6789.569 Total 639620.989 89 F Sig 1.651 123 Groups ANOVA Effect Sizesa,b 95% Confidence Interval Point Estimate VAR0000 Eta-squared Lower Upper 140 000 206 055 -.099 128 Fixed- 055 -.098 127 Omega-squared Random- 007 -.011 018 Epsilon-squared Omega-squared effect effect a Eta-squared and Epsilon-squared are estimated based on the fixed-effect model b Negative but less biased estimates are retained, not rounded to zero Post Hoc Tests Homogeneous Subsets VAR00002 Duncana Subset for alpha = 0.05 VAR0000 N 1 MC 10 56.6000 AK 10 57.3000 CX 10 59.7000 ĐH 10 60.8000 ĐHy2 10 61.9000 QT 10 63.1000 TV 10 63.7000 ĐHy1 10 122.7000 BG 10 Sig 122.7000 147.1000 131 510 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000 Kết so sánh tổng số lá/chồi giống dứa thơm nghiên cứu Oneway Notes Output Created 13-MAR-2023 01:16:01 Comments Input Active Dataset DataSet0 Filter Weight Split File N of Rows in Working 90 Data File Missing Value Definition of Missing Handling User-defined values are missing treated as missing Cases Used Statistics for each analysis are based on cases with no missing data for any variable in the analysis Syntax ONEWAY BY VAR00002 VAR00001 /ES=OVERALL /STATISTICS DESCRIPTIVES /MISSING ANALYSIS /CRITERIA=CILEVEL(0 95) /POSTHOC=DUNCAN ALPHA(0.05) Resources DataSet0] Processor Time 00:00:00.02 Elapsed Time 00:00:00.02 Descriptives VAR00002 95% Confidence Interval for Mean Std N Mean Deviation Std Error Lower Bound Minimu Upper Bound m BG 10 21.2000 2.14994 67987 19.6620 22.7380 17.00 ĐHy1 10 45.3000 5.90762 1.86815 41.0739 49.5261 39.00 ĐHy2 10 45.4000 4.76562 1.50702 41.9909 48.8091 40.00 ĐH 10 44.9000 5.54677 1.75404 40.9321 48.8679 38.00 AK 10 47.3000 5.61842 1.77670 43.2808 51.3192 40.00 QT 10 47.5000 4.88194 1.54380 44.0077 50.9923 40.00 TV 10 48.5000 4.94975 1.56525 44.9592 52.0408 43.00 MC 10 47.0000 6.25389 1.97765 42.5262 51.4738 40.00 CX 10 46.5000 6.65415 2.10423 41.7399 51.2601 40.00 Total 90 43.7333 9.55740 1.00744 41.7316 45.7351 17.00 Descriptives VAR00002 Maximu m BG 24.00 ĐHy1 59.00 ĐHy2 55.00 ĐH 57.00 AK 57.00 QT 58.00 TV 59.00 MC 59.00 CX 60.00 Total 60.00 ANOVA VAR00002 Sum of Squares Between df Mean Square 5823.000 727.875 Within Groups 2306.600 81 28.477 Total 8129.600 89 F Sig 25.561