Đánh giá đa dạng di truyền và nhân giống trà hoa vàng tam đảo (camellia tamdaoensis ninh et hakoda) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro​

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ====== NGUYỄN THỊ HƯỜNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ====== NGUYỄN THỊ HƯỜNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã ngành: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Việt Hà Nội - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Văn Việt Các nội dung nghiên cứu, kết nghiên cứu đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức Luận văn sử dụng thông tin, số liệu từ báo nguồn tài liệu tác giả khác có trích dẫn thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có gian lận tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Học viên Nguyễn Thị Hường ii LỜI CÁM ƠN Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Phòng Đào tạo, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trang bị kiến thức cho tơi xuất q trình học tập Đặc biệt xin gửi lời cám ơn chân thành tới TS Nguyễn Văn Việt, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam tận tình bảo hướng dẫn tơi xuất q trình nghiên cứu đề tài hồn chỉnh Luận văn Thạc sỹ Tôi xin cám ơn cán Bộ môn Công nghệ tế bào tồn thể cán Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt đề tài nghiên cứu Xin cám ơn Ban quản lý Vườn quốc gia Tam Đảo cho phép thu thập mẫu vật làm nguồn vật liệu cho đề tài Cuối cùng, xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè đơng nghiệp sát cánh hỗ trợ động viên vật chất tinh thần xuất trình học tập nghiên cứu Xin chân thành cám ơn ! Hà nội, ngày tháng năm Học viên Nguyễn Thị Hường iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.Giới thiệu Trà hoa vàng Tam Đảo 1.1.1.Hệ thống phân loại phân bố 1.1.2.Đặc điểm sinh học Trà hoa vàng Tam Đảo 1.1.3.Giá trị sử dụng trà hoa vàng 1.2.Phân tích di truyền kỹ thật RAPD–PCR 1.2.1.Kỹ thuật thị phân tử cải tiến di truyền Camellia 1.2.2.Kỹ thật RAPD 1.2.3.Vị trí tầm quan trọng đa dạng di truyền 10 1.3.Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 1.3.1.Khái niệm nuôi cấy in vitro 11 1.3.2.Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô tế bào 12 1.3.3.Ý nghĩa nhân giống in vitro 12 1.3.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 14 1.4.Các cơng trình nghiên cứu chi Camellia 20 1.4.1.Các cơng trình nghiên cứu chi Camellia giới 20 1.4.2.Các công trình nghiên cứu chi Camellia Việt Nam 22 CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1.Mục tiêu nghiên cứu 26 2.2.Đối tượng nghiên cứu 26 2.3.Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 2.4.Nội dung nghiên cứu 27 2.4.1.Phân tích đa hình ADN lồi Trà hoa vàng Tam Đảo kỹ thuật RAPD 27 iv 2.4.2.Xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 27 2.5.Phương pháp nghiên cứu 28 2.5.1.Phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam Đảo 28 Trà hoa vàng Tam Đảo 2.5.2.Xây dựng quy trình nhân giống 31 2.6.Phương pháp đánh giá kết xử lý số liệu 33 2.6.1.Chỉ tiêu theo dõi 33 2.6.2.Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1.Kết phân tích đa hình ADN lồi Trà hoa vàng Tam đảo 35 3.1.1.Tách chiết ADN tổng số 35 3.1.2.Khuếch đại PCR với 15 mồi RAPD 36 3.1.3.Tương quan di truyền 10 hệ gen nghiên cứu 37 3.2.Kết nhân giống in vitro Trà hoa vàng 40 3.2.1.Kết khử trùng tạo mẫu tái sinhh chồi 40 3.2.2.Kết tạo cụm chồi nhân nhanh chồi 44 3.2.3.Nghiên cứu rễ tạo hoàn chỉnh 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 4.1 Kết luận 56 4.1.1 Kết phân tích đa hình ADN kỹ thuật RAPD 56 4.1.2 Kết nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo kỹ thuật nuôi cấy in vitro 56 4.2 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Trà hoa vàng Tam Đảo Hình 3.1 Kết điện di ADN tổng số gel agarose 1% Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm khuyếch đại từ mồi CP1 mồi CP9 gel agarose 1,2% Hình 3.3 Biểu đồ mơ tả quan hệ di truyền 10 mẫu trà hoa vàng Hình 3.4 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo mẫu tái sinh chồi Hình 3.5 Một số hình ảnh tái sinh trà hoa vàng từ phơi hạt Hình 3.6 Hạt chè nảy mầm môi trường WPM Hình 3.7 Chồi Trà hoa vàng Tam Đảo tái sinh môi trường WPM Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi in vitro Hình 3.9 Ảnh hưởng loại hàm lượng đường đến ni cấy in vitro Trà hoa vàng Hình 3.10 Cụm chồi trà hoa vàng phát triển môi trường MT Hình 3.11 Biểu đồ ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA NAA đến khả rễ in vitro Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng độ IBA NAA đến khả rễ in vitro vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng 26 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng dùng cho phản ứng RAPD - PCR 29 Bảng 2.3 Chương trình chạy phản ứng PCR 30 Bảng 3.1 Nồng độ độ tinh mẫu ADN tổng số (pha loãng 10 lần) 36 Bảng 3.2 Phân đoạn RAPD đa hình thu từ 15 mồi RAPD 36 Bảng 3.3 Hệ số tương đồng di truyền Jaccard 38 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo mẫu tái sinh chồi40 Bảng 3.5 Ảnh hưởng điều kiện khử trùng tới khả nảy mầm 43 Bảng 3.6 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả nhân nhanh chồi .44 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi 47 Bảng 3.8 Ảnh hưởng loại hàm lượng đường đến khả nhân nhanh chồi 49 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ BAP kinetin đến khả nhân nhanh chồi 51 Bảng 3.10 Ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA NAA đến khả rễ in vitro 53 Tên viết tắt AFLP CTAB DNA EBA EBB EDTA EST PCR BAP IBA RAPD RFLP α- NAA WPM MS VQG ĐẶT VẤN ĐỀ Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) loài thực vật hạt kín thuộc họ Chè (Theaceae) phát cơng bố vào năm 2007, lồi trà đặc hữu Vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc 30 loài trà hoa vàng phát công bố giới Theo thống kê nay, có khoảng 28 lồi tìm thấy Trung Quốc 24 loài trà hoa vàng tìm thấy Việt Nam [45] Trà hoa vàng biết đến loại dược liệu có giá trị cao Thành phần chất trà hoa vàng có tác dụng phịng chống ung thư, củng cố tính đàn hồi thành mạch điều hịa huyết áp Ngồi ra, lồi trà hoa vàng nói riêng chi Camellia nói chung có hoa to, màu sắc rực rỡ lạ mắt, thường hoa vào dịp Tết Nguyên đán nên thu hút quan tâm nhà chơi cảnh Với giá trị lớn mặt khoa học kinh tế, việc đánh giá, bảo tồn quản lý nguồn gen công tác nghiên cứu đa dạng di truyền lồi trà hoa vàng trở nên vơ quan trọng Ngày nay, bên cạnh phương pháp truyền thống sử dụng thị hình thái, thị phân tử ADN đánh giá phương pháp hữu hiệu việc nghiên cứu, xác định mối quan hệ di truyền cá thể loài loài, sở cho việc phân loại loài, phát lồi mối quan hệ tiến hóa loài [31] Trong số thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền, kỹ thuật RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) sử dụng rộng rãi kỹ thuật đơn giản, có độ tin cậy xác cao thường sử dụng nghiên cứu sâu mức độ phân tử tất đối tượng thực vật Ứng dụng kỹ thuật RAPD công tác nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể loài Trà hoa vàng Tam Đảo để chọn cá thể có tính đa hình ADN cao phục vụ số công tác nghiên cứu khác Những năm gần đây, khai thác không hợp lý nên trữ lượng loài trà hoa vàng Vườn quốc gia Tam Đảo suy giảm nghiêm trọng, đặc biệt loài Trà hoa vàng Tam Đảo Nhằm bảo vệ, lưu trữ phát triển nguồn gen loài trà hoa vàng phục vụ cho công tác nghiên cứu, khai thác sử dụng bền vững tương lai, việc lựa chọn phương pháp nhân giống tối ưu lồi trà hoa vàng trở nên vơ 62 45 Ninh T., (2007) “Diversity of wild Camellia species of Tam Dao Nationnal Park Journal of Science”, Natural Science and Technology, 23:152-154 46 Ninh, T, N.L.N.H (2013).“The yellow Camellia of the Tam đao National Park”, International Camellia Journal, 1, pp 122-128 47 Orel, G and Curry A S (2013), “Preliminary morphological assessment of six new, yellow flowering Camellia (Theaceae) species from Viet Nam”, International Camellia Journal,pp 83-86 48 Rana V., Thakur K., Sood R., Sharma.T.K (2012), “Genetic diversity analysis of Tinospara cordifolis germplasm collected from northwesten Himalayan region of India”, J.Genet, 91, 99-103 49 Rohlf, F.J., 2002 NTSYS pc: Numerical taxonomy system http://www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html 50 Sealy J, R., (1958) “A Revision of the Genus Camellia Roy Hort Soc., London 51 Tang, Shaoqing, et al "Genetic diversity and population structure of yellow camellia (Camellia nitidissima) in China as revealed by RAPD and AFLP markers." Biochemical genetics 44.9-10 (2006): 444 52 Tankslay, SD and S.R McCouch (1997) Seed bank molecular maps: Unlocking genetic potential from the wild Sci., 277: 1063-1066 53 Visser T (1976) Tea In: Evolation of Crop Plant Longman, England 54 Yang, J-B., Yang S.-X., LiH.-T., and LiD.-Z (2013), “Comparative chloroplast genomes of Camellia species”, PLoS One, (8), pp.e73053 55 Ye Chuang- xing (1993) “Annotation of phylogeny in the family Theaceae III A review of Camellia Sect Chrysantha Chang and evolution of genus Camellia” Guihaia, 13(4): 306-310 56 Ye Chuang- xing (1993) “Annotation of phylogeny in th family Theaceae IV Notes from the type of Camellia petelotii (Merr) Sealy” Guihaia, 15(1): 3-5 57 Ye Chuang- xing, Xu Zhao-ran (1992) “A taxonomy of Camellia Sect Chrysantha Chang Acta Sci Nat Univ” Sunyatseni, 31(4): 68-77 63 58 Ye Chuang- xing, Chang Hong-ta and Xu Zhao-ran (1993) “A systematic study on Camellia Sect Chrysantha Chang, a group of rate limestone phlants” Guihaia, additamentum 4: 115-149 59 WANG Jie-ling (2011) “Research on clone cutting seedling of Camellia oleifera” Horticulture & Seed, 2011-4 60 Williams, J.G.K., A.R Kubelik, K.J Livak, J.A Rafalski and S.V Tingey, 1990 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers Nucl Acids Res., 18: 6531-6535 PMID: 1979162 PHỤ LỤC 1: CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM Mơi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Thành phần Đa lượng NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 CaCl2 (pha riêng) Vi lượng H3BO4 MnSO4.4H2O ZnSO4.4H20 KI MoNa2.2H2O CoCl2.6H2O CuSO2.5H2O Sắt FeSO4.7H2O Na2EDTA Vitamin Glycine Axit Nicotinic (B5) Pyridixine (B6) Thiamine HCl (B1) Inositol STT STT PHỤ LỤC 2: BẢNG KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo mẫu tái sinh chồi Anova: Tỷ lệ mẫu (%) SUMMARY Groups K1 K2 K3 K4 K5 Source of Variation Between Groups Within Groups Total Groups K1 K2 K3 K4 K5 Source of Variation Between Groups Within Groups Total Bảng 3.6 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả nhân nhanh chồi Anova: Chiều cao TB/chồi Groups MS 1/2 MS WPM Knop Source of Variation Between Groups Within Groups Total Groups MS 1/2 MS WPM Knop Source of Variation Between Groups Within Groups Total Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả nhân nhanh chồi Anova: Số chồi TB/mẫu Groups ĐC MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 Source of Variation Between Groups Within Groups Total Groups ĐC MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 Source of Variation Between Groups Within Groups Total Bảng 3.8 Kết ảnh hưởng loại đường hàm lượng đường đến khả tái sinh chồi Anova: Số chồi TB/mẫu Groups ĐC ĐT1 ĐT2 ĐT3 ĐT4 ĐT5 Source of Variation Between Groups Within Groups Total Anova: Chiều cao TB/chồi SUMMARY Groups ĐC ĐT1 ĐT2 ĐT3 ĐT4 ĐT5 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Bảng 3.9 Ảnh hưởng tổ hợp nồng độ BAP Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Anova: Số chồi TB/mẫu Groups MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 Source of Variation Between Groups Within Groups Total Anova: Chiều cao TB/chồi SUMMARY Groups MT6 MT7 MT8 MT9 MT10 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA NAA đến khả rễ Anova: Tỷ lệ mẫu rễ Groups ĐC TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 Source of Variation Between Groups Within Groups Total Anova: Số rễ TB/mẫu Groups ĐC TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 Source of Variation Between Groups Within Groups Total Anova: Chiều dài rễ Groups ĐC TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 Source of Variation Between Groups Within Groups Total ... VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ====== NGUYỄN THỊ HƯỜNG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO... Cây Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) Vườn quốc gia Tam Đảo Vật liệu:  Vật liệu để đánh giá đa dạng di truyền quần thể trà hoa vàng trà hoa vàng lấy từ 10 cá thể VQG Tam. .. Mục tiêu cụ thể: + Đánh giá di truyền quần thể Trà hoa vàng Tam Đảo kỹ thuật RAPD + Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) 2.2 Đối tượng