QUÁ TRÌNH KHỬ ĐẠM NHỜ VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC

Việc nghiên cứu về ứng dụng các vi sinh vật có tiềm năng sinh học, khử được các hợp chất chứa nitơ vô cơ là rất cần thiết. Điển hình là khả năng khử đạm của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong môi trường nước, quá trình này sẽ làm giảm tác hại ô nhiễm môi trường trong tự nhiên.

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA MÔI TRƢỜNG & BẢO HỘ LAO ĐỘNG NỘP BÁO CÁO MÔN SINH THÁI HỌC ỨNG DỤNG (Mã mơn học: 902061) Q TRÌNH KHỬ ĐẠM NHỜ VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI TRONG MÔI TRƢỜNG NƢỚC Họ tên : Trần Mỹ Tâm MSSV : 91602111 Lớp : 16090202 Khoá : 2016-2020 Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Anh Đức TP Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2019 i MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG iv CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU 1.3 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI CỦA ĐỀ TÀI 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.5 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 1.6 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CHƢƠNG TỔNG QUAN GIỚI THIỆU VỀ KHỬ ĐẠM TRONG SINH HỌC 2.1 3 2.1.1 Giới thiệu đạm 2.1.2 Tác hại ô nhiễm đạm môi trƣờng nƣớc 2.1.3 Khử đạm 2.2 GIỚI THIỆU VỀ VI SINH VẬT THAM GIA Q TRÌNH CHUYỂN HĨA ĐẠM 2.2.1 Tổng quan vi sinh vật 2.2.1.1 Vi khuẩn dị dƣỡng 2.2.1.2 Vi khuẩn tự dƣỡng 2.2.2 2.3 Vi sinh vật tham gia chuyển hóa đạm GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI 2.3.1 Cơ sở hình thành 2.3.2 Chủng Pseudomonas 2.3.3 Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri 2.3.3.1 Đặc điểm hình thái 2.3.3.1 Đặc điểm sinh thái học phân bố tự nhiên CHƢƠNG MỐI QUAN HỆ GIỮA VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI VÀ ĐẠM TRONG MƠI TRƢỜNG 10 3.1 CHU TRÌNH CHUYỂN HÓA NITƠ TRONG TỰ NHIÊN 10 ii 3.2 CHU TRÌNH CHUYỂN HĨA NITƠ TRONG MƠI TRƢỜNG NƢỚC 14 3.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH KHỬ NITRATE16 3.3.1 Ảnh hƣởng oxy 16 3.3.2 Ảnh hƣởng pH 16 3.3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ 16 3.3.4 Ảnh hƣởng chất hữu 16 CHƢƠNG CƠ CHẾ KHỬ ĐẠM CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI 17 CHƢƠNG ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI 19 KẾT LUẬN 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 iii DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG Hình 2.1 Phú dưỡng hóa Hình 2.2 Hình thái chủng Pseudomonas Hình 2.3 Một số hình thái thuộc địa điển hình chủng Pseudomonas stutzeri Hình 3.1 Chu trình nitơ tự nhiên 10 Hình 3.2 Chu trình nitơ nước 14 Hình 4.2 Tổ chức gen tham gia vào trình khử nitrate vi khuẩn Pseudomonas stutzeri (Lalucat, 2006) 17 Hình 4.1 Cơ chế khử nitrate vi khuẩn Pseudomonas stutzeri 18 Bảng 5.1 Một số giống vi khuẩn có bùn hoạt tính chức chúng tham gia xử lý nước thải 19 Hình 5.1 Sơ đồ cơng nghệ A/O 20 iv CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, tình trạng nhiễm nước thải có chiều hướng gia tăng với phát triển kinh tế, xã hội Để làm giảm mức độ ô nhiễm từ nước thải nhiều phương pháp nghiên cứu cách kết hợp biện pháp vật lý, hóa học sinh học Xử lý nước thải dựa vào phương pháp hóa học, vật lý có hiệu cao, nhanh chi phí lớn, khơng mang tính bền vững Xử lý nước thải phương pháp sinh học dựa sở sử dụng vi sinh vật phương pháp quan tâm nghiên cứu Nhiều nhóm vi sinh vật tự nhiên có khả chuyển hóa hợp chất nước thải thành chất không độc hại với môi trường Vi sinh vật giới sinh vật vô nhỏ bé mà ta khơng thể quan sát thấy mắt thường Nó phân bố hầu hết nơi Trái Đất, đất, nước, khơng khí có vai trị quan trọng chu trình tự nhiên Chúng tham gia vào tất vịng tuần hồn vật chất tự nhiên khâu quan trọng chuỗi thức ăn hệ sinh thái Vi sinh vật đóng vai trị định q trình tự làm môi trường tự nhiên Trong số đó, có lồi vi sinh vật có khả xử lý sinh học, chuyển hóa hợp chất chứa nitơ môi trường nước thành chất không độc hại với môi trường Việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật có tiềm sinh học, khử hợp chất chứa nitơ vô cần thiết Điển hình khả khử đạm vi khuẩn Pseudomonas stutzeri mơi trường nước, q trình làm giảm tác hại ô nhiễm môi trường tự nhiên 1.2 MỤC TIÊU Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri để khử nitrate xử lý nước thải chứa nhiều hợp chất nitơ 1.3 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI CỦA ĐỀ TÀI - Đối tượng: Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri - Phạm vi đề tài: Quá trình khử đạm vi khuẩn Pseudomonas môi trường nước 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Chu trình nitơ tự nhiên - Vai trò vi khuẩn Pseudomonas stutzeri chu trình nitơ mơi trường nước - Quá trình khử đạm (nitrate) vi khuẩn Pseudomonas stutzer - Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri xử lý nước thải 1.5 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Phương pháp thu thập tổng hợp tài liệu: thực thu thập liệu, thơng tin có liên quan thông qua đề tài nghiên cứu qua sách, báo internet  Phương pháp kế thừa tra cứu tài liệu  Phương pháp tham khảo ý kiến chuyên gia 1.6 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN  Ý nghĩa khoa học: - Đóng góp vào nguồn tài liệu tham khảo chuyên ngành sinh thái học môi trường nhằm đánh giá rút kinh nghiệm  Ý nghĩa thực tiễn: - Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri xử lý nước thải góp phần vào công tác bảo vệ môi trường nhằm cải thiện nguồn tài nguyên nước ngày CHƢƠNG TỔNG QUAN 2.1 GIỚI THIỆU VỀ KHỬ ĐẠM TRONG SINH HỌC 2.1.1 Giới thiệu đạm Chất đạm (còn gọi protein) chất hữu giàu dinh dưỡng, có động thực vật Đạm tồn dạng hợp chất hữu vô chứa nitơ Nitơ nguyên tố có nguồn dự trữ giàu khí (chiếm khoảng 78% thể tích) Nitơ nguyên tố dinh dưỡng quan trọng sinh trường phát triển thực vật thành phần quan trọng thể sống thành phần cấu tạo nên axit amin, protein, axit nucleic, chlorophyll, Trong mơi trường nước, nitơ tồn dạng hợp chất vô cơ, hữu hịa tan khơng hịa tan Các hợp chất vơ hịa tan quan trọng là: NH3, NH4+, NO2-, NO3- Trong đời sống thực vật, thực vật hấp thụ trước hết dạng NH4 dạng NO3- hợp chất thường có thủy vực Do đó, thủy vực đạm thường nhân tố giới hạn cho đời sống sinh vật Sự tạo thành hợp chất hữu thủy vực phụ thuộc đáng kể vào hàm lượng NH4+ NO3- thủy vực Trong thủy vực toàn nitơ liên kết với protein thể sống + Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn chủ yếu dạng amoni (NH4+), nitrate (NO3-), dạng nitrite (NO2-) số hợp chất hữu khác Nitơ hữu tồn sinh vật sống sản phẩm trung gian trình phân hủy vật chất hữu 2.1.2 Tác hại ô nhiễm đạm môi trƣờng nƣớc Nitơ nước thải cao, chảy vào sông, hồ làm tăng hàm lượng chất dinh dưỡng Do gây phát triển mạnh mẽ loại thực vật phù du rêu, tảo gây tình trạng thiếu oxy nước, phá vỡ chuỗi thức ăn, giảm chất lượng nước, phá hoại môi trường thủy vực, sản sinh nhiều chất độc nước NH4+, H2S, CO2, CH4… tiêu diệt nhiều loại sinh vật có ích nước Hiện tượng gọi phú dưỡng hóa nguồn nước Hiện nay, phú dưỡng hóa thường gặp hồ đô thị, sông kênh dẫn nước thải Hiện tượng tác động tiêu cực tới hoạt động sống dân cư đô thị, làm biến đổi hệ sinh thái nước hồ, tăng thêm mức độ nhiễm khơng khí khu dân cư Hình 2.1 Phú dưỡng hóa Trong nước mặt, nitơ thêm vào dẫn đến làm giàu mức chất dinh dưỡng, đặc biệt vùng nước ven biển tiếp nhận dịng chảy từ sơng bị ô nhiễm Sự làm giàu mức chất dinh dưỡng với hàm lượng vượt 10 mg/l dẫn đến tượng phú dưỡng hóa, gia tăng tần số cá chết ven biển, tăng tần suất nở hoa tảo có hại dịch chuyển loài hệ sinh thái ven biển Ngày nay, nhiều nước giới sử dụng nguồn nước ngầm nguồn nước cho ăn uống Khi người ăn phải nguồn nước bị nhiễm nitrate dẫn đến tượng rối loạn máu không đủ oxy nuôi thể (methaemoglobinaemia), sinh hội chứng xanh da trẻ em tháng tuổi Nitrate chuyển hóa thành nitrite ruột nguyên nhâ hình thành hợp chất nitrosoamine – hợp chất gâ ung thư máy tiêu hóa người động vật 2.1.3 Khử đạm Khử đạm trình phân hủy hợp chất chứa nitơ NH4+ , NO3-, NO2- thành chất đơn giản NO, N2O giải phóng N2 Nitrate sản phẩm cuối q trình oxy hóa amoni chưa xem bền vững gây độc cho mơi trường nên cần tiếp tục chuyển hóa dạng khí nitơ, tức thực q trình khử hóa học, chuyển hóa trị nitơ từ +5 (NO3-) hóa trị khơng (N2) 2.2 GIỚI THIỆU VỀ VI SINH VẬT THAM GIA Q TRÌNH CHUYỂN HĨA ĐẠM 2.2.1 Tổng quan vi sinh vật Vi sinh vật sinh vật nhỏ bé, đơn bào phân bố rộng rãi tự nhiên Tế bào chúng nhìn thấy kính hiển vi phóng đại Vi sinh vật gồm có vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, xạ khuẩn, virut Chúng nhiễm vào nước từ nguồn: đất, nước thải sinh hoạt, nước thải sản xuất, từ bụi khơng khí rơi vào,…Vi sinh vật nước chiếm tỉ lệ cao vi khuẩn Trong môi trường nước, chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng để xây dựng tế bào mới, sinh trưởng phát triển Vi khuẩn nước chủ yếu lồi dị dưỡng hoại sinh Các lồi có khả phân hủy chất hữu cơ, oxy hóa chất chất thành chất đơn giản, sản phầm cuối CO2 nước Vi khuẩn chia làm nhóm chính: - Vi khuẩn dị dưỡng - Vi khuẩn tự dưỡng 2.2.1.1 Vi khuẩn dị dưỡng Nhóm vi khuẩn sử dụng chất hưu làm nguồn carbon dinh dưỡng nguồn lượng để sống, sinh trường phát triển  Vi khuẩn hiếu khí: Vi khuẩn hiếu khí vi sinh vật cần cung cấp lượng oxy liên tục suốt trình hoạt động sống, sinh trưởng phát triển chúng Oxy cung cấp cho q trình oxy hóa chất hữu theo phản ứng: Chất hữu + O2 → CO2 + H2O + lượng  Vi khuẩn kỵ khí Vi sinh vật kỵ khí vi sinh vật có khả hoạt động sinh trưởng, phát triển khơng cần cung cấp nguồn oxy từ khơng khí Chúng sử dụng oxy hợp chất nitrat, sulfat để oxy hóa chất hữu Chất hữu + NO3- CO2 + N2 + lượng Chất hữu + SO42- CO2 + H2S + lượng  Vi khuẩn tùy nghi Vi khuẩn tùy nghi sống điều kiện mơi trường có khơng có nguồn oxy Chúng tổng hợp hình thành tế bào nhờ giải phóng phần lượng, phần cịn lại thoát dạng nhiệt 2.2.1.2 Vi khuẩn tự dưỡng Vi khuẩn tự dưỡng có khả oxy hóa chất vô để thu lượng dùng CO2 làm nguồn carbon cho trình sinh tổng hợp Trong nhóm có vi khuẩn nitrat hóa, vi khuẩn sắt, vi khuẩn lưu huỳnh Một số phản ứng oxy hóa sau: Ở Nitromonas: 2NH4+ + O2 2NO2- + 4H+ + 2H2O + lượng Ở Nitrobacter: 2NO2- + O2 2NO3- + lượng 2.2.2 Vi sinh vật tham gia chuyển hóa đạm Số lượng vi khuẩn thực q trình phản nitrate tương đối phong phú có 14 chủng vi khuẩn biết có khả phản nitrate Ví dụ chủng: Bacillius, Pseudomonas, Methanomonas, Paracocus, Spirillum, Thiobacillus,… Hầu hết vi khuẩn phản nitrate vi khuẩn hơ hấp tùy tiện, chúng sử dụng O2 NO3- làm chất nhận điện tử cuối q trình hơ hấp Trong trường hợp vi khuẩn sử dụng oxy làm chất nhận điện tử q trình hơ hấp hơ hấp hiếu khí Cịn trường hợp vi khuẩn sử dụng NO3- NO2- gọi hơ hấp thiếu khí Tuy nhiên, chế hai trình tương tự Sự khác hơ hấp hiếu khí thiếu khí enzyme xúc tác cho vận chuyển điện tử Trong tự nhiên, chi Nitrosomonas, Nitrobacter có khả chuyển hóa hợp chất chứa nitơ có nước NH4+, NO2-, NO3- cịn có số chi vi sinh vật khác Bacillus, Pseudomonas,… NO3- sản phẩm cuối q trình oxy hóa amoni chưa coi bền vững gây độc cho mơi trường nên cần phải chuyển hóa dạng khí N2 Vi sinh vật thực q trình chuyển hóa vi sinh vật khử nitrate bao gồm số vi sinh vật thuộc chi Bacillus, Pseudomonas, Methanomonas, Thiobacillus Các vi sinh vật khử nitrate sử dụng oxy nitrate, nitrite làm chất oxy hóa để cung cấp lượng cho q trình sinh hóa 2.3.3 Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri - Tên danh pháp: Pseudomonas stutzeri - Phân loại khoa học: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas Lồi: Pseudomonas stutzeri 2.3.3.1 Đặc điểm hình thái Pseudomonas stutzeri vi khuẩn gram âm, di chuyển cực tiên mao Tế bào có hình que, dài đến 3μm, rộng 0.5 μm Hình dạng khơng kiên định phân lập trực tiếp, có dạng sần, khơ, bám chặc với Chúng khơng có sắc tố huỳnh quang Hình 2.3 Một số hình thái thuộc địa điển hình chủng Pseudomonas stutzeri 2.3.3.1 Đặc điểm sinh thái học phân bố tự nhiên Pseudomonas stutzeri vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí, có khả khử nitrat (loại nitơ từ NO3- giải phóng N2) Chúng phân bố rộng rãi vùng địa lý Trong nghiên cứu, số lượng lớn chủng P stutzeri phân lập từ mẫu trầm tích biển từ bờ Biển Bắc Thái Bình Dương, độ sâu từ 2.000 – 2.600 m (Sikorski et al., 2002) Một số chủng phân lập từ Biển Đen độ sâu 100 m (Sorokin et al., 1999) Pseudomonas stutzeri biết loài vi khuẩn khử nitrat mạnh, có khả sinh trưởng mơi trường chứa nitrat, nitrit nitrous oxide Nó có khả khử nitơ theo nhiều đường khác nhau, khử nitrate thành N2 mà khơng có tích lũy nitrite, khử nitrate theo hai bước (khử NO3- thành NO2- khử NO2thành N2), khử nitrate với tích tụ nitrite nồng độ thấp (Su et al, 2001) Pseudomonas stutzeri tăng trưởng mơi trường amylase, maltose tinh bột khơng phát triển gelatinase Chúng có khả chuyển hóa, làm giảm chất độc cho mơi trường hợp chất có trọng lượng phân tử cao polyethylene glycols Pseudomonas stutzeri sử dụng tinh bột làm nguồn carbon lượng Có thể sinh trưởng nhiệt độ từ - 45 C (Lalucat et al., 2006) Nhiệt độ tối ưu khoảng 35 C, pH tối ưu khoảng sinh trưởng pH = (van Niel Allen, 1952) CHƢƠNG MỐI QUAN HỆ GIỮA VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI VÀ ĐẠM TRONG MƠI TRƢỜNG 3.1 CHU TRÌNH CHUYỂN HÓA NITƠ TRONG TỰ NHIÊN Nitơ phân tử (N2) Cố định nitơ N-protein động vật N-protein thực vật Ammonia hóa NH4+ NH3 Khử nitrat Nitrat hóa NO3- Nitrat hóa + O2 NO2- + O2 Hình 3.1 Chu trình nitơ tự nhiên Các trình chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng sang dạng khác tiến hành nhóm vi sinh vật khác với mục đích lấy lượng để tích tụ nitơ thành dạng cần thiết cho phát triển chúng Các dạng nitơ hữu từ nguồn động thực vật sau chết vi khuẩn amoni hóa chuyển hóa thành dạng NH4+ , sau NH4+ chuyển hóa thành NO2- nhờ vi khuẩn nitrite hóa NO2- sinh nhóm sinh vật nitrate hóa chuyển hóa thành NO3- cuối nitrate nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ trình khử nitrat [8], [9] Chu trình chuyển hóa nitơ chu trình xảy nhanh liên tục Chu trình bao gồm nhiều giai đoạn: cố định nitơ, sư amon hóa, notrite hóa, nitrate hóa phản nitrate  Sự cố định nitơ (Nitrogen fixation) (N2 Cố định đạm địi hỏi hoạt hóa phân tử N2 để tách thành nguyên tử 2N) Trong q trình cố định nitơ sinh học địi hỏi lượng kết hợp 10 nitơ với hydro tạo thành amoniac (N + H NH3) Tất sinh vật cố định nitơ cần lượng từ bên ngồi, mà hợp chất carbon đóng vai trị để thực phản ứng nội nhiệt Trong trình cố định đạm, vai trị điều hịa enzyme: nitrogenase hydrogenase Để hoạt hóa nitơ, sinh vật tự dưỡng sử dụng lượng trình quang hóa hóa tổng hợp, cịn vi sinh vật dị dưỡng sử dụng lượng chứa hợp chất hữu có sẵn mơi trường Những sinh vật có khả cố định đạm vi khuẩn tảo Chúng gồm nhóm chính: - Nhóm cộng sinh (phần lớn vi khuẩn, số tảo nấm) Nhóm sống tự (chủ yếu vi khuẩn tảo) Trong môi trường nước, vi sinh vật cố định nitơ phong phú, thường gặp lồi vi khuẩn kỵ khí thuộc chi Clostridium, Methano, Bacterium, Methanococcus, Desulfovibrio số vi sinh vật quang hợp khác Ngoài vi khuẩn cố định đạm , kiện tự nhiên lượng cao sét, cháy rừng chí dịng dung nham nóng gây cố định lượng nitơ nhỏ không đáng kể Năng lượng cao tượng tự nhiên phá vỡ liên kết ba phân tử N2 , làm cho nguyên tử N riêng lẻ có sẵn để biến đổi hóa học  Q trình amon hóa (Ammoiafication) Amoni (NH4+) tạo vi khuẩn cố định đạm, sau chuyển đổi trở lại thành dạng nitơ vơ thơng qua q trình gọi khống hóa hay amon hóa Trong đất nước vi khuẩn dị dưỡng chúng sử dụng chất hữu giàu đạm thải môi trường dạng nitơ vơ (NO2-, NO3- NH3)  Q trình nitrate hóa (Nitrification) Nitrate hố q trình tự dưỡng (tạo lượng cho phát triển vi khuẩn lấy từ hợp chất oxy hoá nitơ, chủ yếu amoni Ngược với vi sinh vật dị dưỡng vi khuẩn nitrat hoá sử dụng CO2 (dạng vô cơ) nguồn bon hữu để tổng hợp sinh khối Sinh khối vi khuẩn nitrat hoá tạo thành đơn vị trình trao đổi chất nhỏ nhiều lần so với sinh khối tạo thành trình dị dưỡng 11 Quá trình biến đổi NH3, NH4+ thành NO2-, NO3- gọi trình nitrite hóa hay nitrate hóa Q trình phụ thuộc vào pH môi trường xảy chậm Trong điều kiện pH thấp, trình nitrite thường trải qua hai bước: Bước NH4+ + 1,5 O2 NO2- + 2H+ + H2O Bước NO2- + 0,5 O2 NO3- Các vi khuẩn Nitrosomonas vi khuẩn Nitrobacteria sử dụng lượng lấy từ phản ứng để tự trì hoạt động sống tổng hợp sinh khối Có thể tổng hợp trình phương trình sau : NH4+ + 2O2 NO3- + 2H+ + H2O Cùng với trình thu lượng, số ion amoni đồng hố vận chuyển vào mơ tế bào Q trình tổng hợp sinh khối biểu diễn phương trình sau : 4CO2 + HCO3- + NH4++ H2O C5H7O2N + 5O2 C5H7O2N tạo thành dùng để tổng hợp nên sinh khối cho tế bào vi khuẩn Tồn q trình oxy hố phản ứng tổng hợp thể qua phản ứng sau : NH4+ + 1,83O2 +1,98HCO3- 0,021C5H7O2N + 0,98 NO3- +1,041H2O +1,88H2CO3  Q trình phản nitrate (Denitrification) Con đường chuyển hóa nitrate qua q trình đồng hóa- dị hóa để trở dạng N2, NO, N2O gọi trình phản nitrate Chúng sử dụng nitrate nguồn oxy với có mặt glucose phosphate Khi phản ứng đồng hóa dị hóa nitơ diễn sau: - Dị hóa nitơ: Khử NO3- thành NO2-: 3NO3- + CH3OH - 3NO2- + H2O + H2CO3 Khử NO2- thành N2: 2NO2- + CH3OH + H2CO3 N2 + 2HCO3- + 2H2O Khử NO3- thành N2: 6NO3- + 5CH3OH + H2CO3 3N2 + 8H2O + 6HCO3- Đồng hóa nitơ: 14CH3OH + 3NO3- + 4H2CO3 3C5H7NO2 + 20H2O + 3HCO3- 12 - Phản ứng kết hợp hai q trình đồng hóa dị hóa: Khử nitrat : NO3- + 1,08 CH3OH + H+ 0,065 C5H7O2N + 0,47 N2 + 0,76CO2 + 2,44H2O Khử nitrit : NO2- + 0,67 CH3OH + H+ 0,04 C5H7O2N + 0,48 N2 + 0,47CO2 + 1,7 H2O Quá trình diễn nhờ vi khuẩn phản nitrate hóa Các vi khuẩn sống điều kiện thiếu oxy, chúng dùng NO3- làm nguồn oxy để hơ hấp yếm khí, giải phóng N2O, NO, N2 vào khí Cơ chế: NO3- NO2- NO N2 O N2 Nitơ phân tử giải phóng q trình phản nitrate trở lại nguồn dự trữ khí Do q trình phản nitrate xảy điều kiện yếm khí hay kỵ khí phần nên q trình thường gặp đáy sâu hồ, biển…khơng có oxy giàu chất hữu bị phân hủy 13 3.2 CHU TRÌNH CHUYỂN HĨA NITƠ TRONG MƠI TRƢỜNG NƢỚC Trong mơi trường nước, chuyển hóa hợp chất nitơ có nét đặc trưng riêng Hợp chất nitơ có sẵn nguồn nước, chủ yếu chất thải từ hoạt động người dạng hợp chất hữu chứa nitơ (axit amin, protein, urin ) chất dễ dàng bị thủy phân (phản ứng với nước) tạo thành amoniac Hợp chất nitơ Phân hủy vi sinh thủy phân Amoniac Tạo sinh khối Tế bào nitơ hữu Tế bào nitơ thực Phân hủy nội sinh NO2- Khử nitrate Khử nitơ NO3Chất hữu carbon Hình 3.2 Chu trình nitơ nước Trong môi trường nước tồn yếu tố ảnh hưởng đến họat động sống sinh vật thủy sinh, amoniac (NH3), nitrite (NO2-) nitrate (NO3-) Các chất thành phần hợp chất chứa nitrogen tạo thành từ trình phân hủy protein, chất hữu chất thải qua trình trao đổi chất Vi sinh vật sử dụng amoniac để xây dựng tế bào, phần tế bào bị chết (phân hủy nội sinh) tiết amoniac phần tạo lượng sinh khối thực Loại vi sinh tự dưỡng thực phản ứng oxy hóa amoniac với oxy để sản xuất lượng cho mục đích hoạt động sống, sinh trưởng phát triển.[4] Amoni nước cần thiết cho phát triển sinh vật, nhiên hàm lượng amoni cao chất độc nguy hại, có khả làm chết thực vật thủy sinh, đặc biệt mơi truờng khép kín Đồng thời, chất dễ bị oxy hóa vi khuẩn hiếu khí Kết trình taọ thành nitrite, sản phầm vi khuẩn hiếu khí độc hại amoni 14 Sau đó, nitrite bị phân hủy tiếp vi khuẩn tạo thành nitrate Nitrate dạng đạm thực vật thủy sinh hấp thụ dễ nhất, không gây ảnh hưởng đến thực vật thủy sinh nitrate tích tụ nước lâu ngày tạo acid nitrite Nó làm ảnh hưởng đến thành phần hóa học nước độ pH khơng ổn định Do đó, số nitrate bị phân hủy thơng qua q trình quang hợp thủy sinh rêu tảo Một số khác bị phân hủy vi khuẩn tạo nitrous oxide (N2O) nirogen (N2) Quá trình phân hủy nitrate tạo nitrous oxide nitrogen gọi trình khử nitrate Vi sinh vật thực q trình khử có tên chung Denitrifier bao gồm 14 loại vi sinh vật, ví dụ Bacillus, Pseudomonas, Methanomonas, Thiobacillus [2] Phần lớn loại vi sinh thuộc loại tùy nghi với nghĩa chúng sử dụng oxy nitrate, nitrite làm chất oxy hóa (nhận điện tử phản ứng sinh hóa) để sản xuất lượng Phần lớn vi sinh vật nhóm Denitrifier thuộc loại dị dưỡng, sử dụng nguồn carbon hữu để xây dựng tế bào phần sử dụng cho phản ứng khử nitrat Rất vi sinh vật Denitrifier thuộc loại tự dưỡng.[4] Để khử nitrat, vi sinh vật cần có chất khử (nitrat chất oxy hóa), chất khử chất hữu vơ H2, S, Fe2+ 15 3.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH KHỬ NITRATE 3.3.1 Ảnh hƣởng oxy Nồng độ oxy có tác động trực tiếp oxy bên tập hợp keo tụ màng vi sinh oxy chất lỏng đo Khả khử nitrate điều kiện có oxy xảy đạt khoảng 20% Cịn điều kiện yếm khí hiệu suất khử nitrate đạt gần 90% Do đó, nồng độ oxy hòa tan lý tưởng để vi khuẩn thực q trình khử nitrate nhỏ 0,2 mg/l 3.3.2 Ảnh hƣởng pH Cũng giống trình xử lý sinh học khác, khoảng pH tối ưu cho trình khử nitrate nằm khoảng rộng: từ - 9, vùng tối ưu tốc độ khử nitrat giảm nhanh Tại pH =10 pH = tốc độ khử nitrate lại vài phần trăm so với vùng tối ưu Vi sinh Denitrifier có khả thích nghi với mơi trường pH với nhịp độ chậm Trong vùng pH thấp có khả xuất khí có độc tính cao vi sinh vật từ trình khử nitrate N2O, NO Chúng có khả đầu độc vi sinh vật với nồng độ thấp 3.3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ Ảnh hưởng nhiệt độ lên trình khử nitrate tương tự q trình xử lý hiếu khí vi sinh vật tự dưỡng: tốc độ tăng gấp tăng thêm 10 C khoảng nhiệt độ - 25 C Q trình khử nitrate xảy vùng nhiệt độ 50 - 60 C, sử dụng thực tế Trong điều kiện nhiệt độ cao, tốc độ khử nitrate cao khoảng 50% so với 35 C 3.3.4 Ảnh hƣởng chất hữu Bản chất chất hữu ảnh hưởng đến tốc độ khử nitrate: chất hữu tan, dễ sinh hủy tạo điều kiện tốt thúc đẩy tốc độ khử nitrat Nhiều kết nghiên cứu cho thấy tốc độ khử nitrate tăng dần sử dụng chất hữu từ phân hủy nội sinh, từ nguồn nước thải chủ động đưa vào hệ metanol, axit axetic Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy nguồn hữu từ nhiều loại nước thải (lên men, bia, rượu) thúc đẩy tốc độ khử nitrate mạnh so với metanol 16 CHƢƠNG CƠ CHẾ KHỬ ĐẠM CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI Khử nitrat đặc điểm ổn định Pseudomonas stutzeri Nó vi khuẩn dị dưỡng khử nitơ hoạt động mạnh coi hệ thống điển hình cho trình khử nitrat [5] Pseudomonas stutzeri tăng trưởng môi trường amylase, maltose tinh bột không phát triển gelatinase Chúng có khả chuyển hóa, làm giảm chất độc cho môi trường hợp chất có trọng lượng phân tử cao polyethylene glycols Khả khử nitrat P.stutzeri dựa tồn gen mã hóa cho enzyme dị hóa nitrat chứa bên trong: gen nar (nitrate reductase), gen nir (nitrite reductase), gen nor (nitrite oxide reductase), gen nos (nitrous oxide reductase) Hình 4.2 Tổ chức gen tham gia vào trình khử nitrate vi khuẩn Pseudomonas stutzeri (Lalucat, 2006) Q trình chuyển hóa nitrat nước thành nitơ tự nhờ vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có nước, từ làm giảm nồng độ nitơ tổng nguồn nước Trong trình khử nitrat, bao gồm bốn bước liên tiếp: Gen nar: NO3- + 2H+ + 2eGen nir: NO2- + 2H+ + e- NO2- + H2O (Nitrate reductase) NO + H2O (Nitrite reductase) Gen nor: 2NO + 2H+ + 2e- N2O + H2O (Nitric oxide reductase) Gen nos: N2O + 2H+ + 2e- N2 + H2O (Nitrous oxide reductase) 17 Hình 4.1 Cơ chế khử nitrate vi khuẩn Pseudomonas stutzeri [5] Quá trình hồn chỉnh biểu thị dạng phản ứng oxi hóa - khử cân bằng, nitrat (NO3-) khử hoàn toàn thành nitơ tự (N2): 2NO3- + 10e- + 12H+ → N2 + 6H2O Pseudomonas stutzeri sử dụng tinh bột làm nguồn carbon lượng Có thể sinh trưởng nhiệt độ từ - 45 C (Lalucat et al., 2006) Nhiệt độ tối ưu khoảng 35 C, pH tối ưu khoảng sinh trưởng pH = (van Niel Allen, 1952) Khử nitrat vi khuẩn biến đổi khác gắn liền với bảo tồn lượng Nói cách khác, chuyển điện tử enzyme kết hợp với tổng hợp ATP thơng qua chuyển vị proton hình thành điện màng [5] Màng sinh học định nghĩa dạng sống tồn phổ biến tự nhiên khác biệt với dạng tế bào sống tự mạng lưới hợp chất ngoại bào bao quanh thay đổi, biệt hóa tế bào để vi sinh vật thích nghi với mơi trường sống Vi sinh vật hình thành màng sinh học khơng giúp chúng tồn chống chịu với điều kiện bất lợi, tận dụng nguồn dinh dưỡng môi trường mà cịn thơng qua mối quan hệ hợp tác lồi khác để tăng q trình phân giải chất độc hại môi trường 18 CHƢƠNG ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI Hiện nay, vi khuẩn khử nitrate thường sử dụng rộng rãi xử lý nước (nước thải sinh hoạt, nước thải công nghiệp nước thải từ nuôi trồng thủy sản) Trong xử lý nước thải, người ta tạo môi trường bùn hoạt tính chứa vi khuẩn phân hủy sinh học nhằm phân hủy chất hữu nước thải, giảm thiểu nguy gây ô nhiễm môi trường Cụ thể công nghệ A/O - Anoxic/Oxic Để đưa bùn hoạt tính vào thiết bị xử lý, cần thực trình loại bùn gốc ban đầu ni dưỡng tạo thành loại bùn có hoạt tính cao có tính kết lắng tốt Có thể gọi q trình hoạt hóa bùn hoạt tính Trong hệ thống bùn hoạt tính có diện vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn tùy nghi vi khuẩn yếm khí Một số vi khuẩn dị dưỡng thơng thường hệ thống bùn hoạt tính gồm có: Achromobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Citromonas, Flavobacterium, Pseudomonas, Zoogloea Bảng 5.1 Một số giống vi khuẩn có bùn hoạt tính chức chúng tham gia xử lý nƣớc thải STT Chức Vi khuẩn Nitrosomonas Nitrate hóa Nitrobacter Nitrate hóa Pseudomonas stutzeri Phân hủy chất hữu khử nitrate Cytophaga Phân hủy polime Arthrobacter Phân hủy hidrocarbon Flovobacterium Phân hủy protein Bùn hoạt tính dạng bơng, có chứa nhiều vi sinh vật (có khả vơ hoá mạnh mẽ), chủ yếu vi sinh vật tạo màng nhầy kết hợp với tạp chất lơ lửng nước lắng xuống đáy bể Trong bể xảy q trình oxy hóa chất hữu nhờ vi sinh vật bùn, giống lọc sinh học, trình xảy mạnh mẽ Do hoạt động vi sinh vật, nước thải làm sau khoảng trình vơ hóa gần hồn tồn xong 19 Cấp khí Nước thải vào ANOXIC OXIC (Thiếu khí) (Hiếu khí) + Khử nitrate + Nitrate hóa (Khử BOD) Nước thải Hình 5.1 Sơ đồ cơng nghệ A/O Tại bể sinh học hiếu khí, amoni (NH4+) chuyển thành nitrite (NO2-) nitrate (NO3-) nhờ vi khuẩn Nitrosomonas Nitrobacter Khi qua mơi trường thiếu khí, vi khuẩn khử nitrate Pseudomonas stutzeri tách oxy nitrate nitrite để oxy hóa chất hữu tạo thành nitơ phân từ (N2) khỏi nước Ngồi ra, nước thải từ hệ thống nuôi trồng thủy sản chứa lượng đạm dạng nitrate amoni đáng kể, chất thải từ phân cá, thức ăn dư thừa số chất nitrate, nitrite gây ung thư Các chủng vi khuẩn địa phương khử đạm mạnh, phù hợp với điều kiện sinh thái địa phương ứng dụng vào xử lý môi trương nước nhà khoa học nghiên cứu, đặc biệt gần đề tài phân lập vi khuẩn Pseudomomas stutzeri có khả khử đạm mạnh nước thải ao cá tra Đồng Bằng sơng Cửu Long ứng dụng vào xử lý nước thải Pseudomonas stutzeri có khả làm giảm hàm lượng nitrogen, amoni,…trong nước nuôi cá tra, basa nhằm tăng hiệu kinh tế, cải thiện sống cho người dân (Cao Ngọc Diệp et al., 2009) 20 KẾT LUẬN Với tình hình nhiễm mơi trường ngày gia tăng, hoạt động người ngày thải nhiều lượng chất xả môi trường gây ô nhiễm môi trường, đặc biệt môi trường nước Nguồn nước thải bị ô nhiễm dẫn đến vấn đề gây mĩ quan đô thị, gây mùi hôi thối ảnh hưởng đến sức khỏe người dân xung quanh,…ngồi cịn làm rối loạn hoạt động sống thủy sinh vật nước Nếu nguồn ô nhiễm nặng xảy làm chết sinh vật thủy sinh, làm cân môi trường sinh thái làm giảm thiểu giá trị đa dạng sinh học mơi trường nước Do đó, vai trị vi sinh vật chu trình tự nhiên khơng thể thiếu Nó tham gia hầu hết q trình chuyển hóa mơi trường làm giảm thiểu tối đa chất nhiễm có nguy gây nguy hại đến môi trường Trong môi trường nước nay, hàm lượng nitơ nước lớn Nó xuất phát từ hoạt động sản xuất công nghiệp, hoạt động chăn nuôi, hoạt động nuôi trồng thủy sản,…mà nước thải không xử lý chưa xử lý triệt để thải mơi trường nước Nó chứa hàm lượng đạm cao dễ dẫn đến vấn đề môi trường tượng phú dưỡng hóa, gây ngộ độc cho hệ thống thủy sinh,… Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật có tiềm sinh học khử hợp chất chứa nitơ vô cần thiết, điển hình vi khuẩn Pseudomonas stutzeri lồi có tính đa dạng cao phân bố vùng địa lý rộng Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có khả khử đạm tạo thành sản phẩm cuối khí nitơ phân tử (N2) q trình làm giảm tác hại ô nhiễm môi trường 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt [1] Lê Xuân Phương, 2008, Giáo trình vi sinh vật học mơi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [2] Nguyễn Hoài Hương, 2009, Giáo trình thực hành vi sinh ứng dụng, NXB Đại học Quốc gia TPHCM [3] Vũ Minh Đức, 2011, Hóa học vi sinh vật học nước, NXB Xây dựng Hà Nội [4] Lê Văn Cát, 2007, Xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ photpho, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ  Tài liệu Tiếng Anh [5] Jorge Lalucat, Antoni Bennasar, Rafael Bosch, Elena García-Valdés, and Norberto J Palleroni, Jun 2006, Biology of Pseudomonas stutzeri, Microbiol Mol Biol Rev [6] US Environmental Protection Agency, August 2002, Nitrification, Office of Ground Water and Drinking Water Standards and Risk Management Division, Washington D.C 20004  Tài liệu nguồn Web [7] https://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_stutzeri [8] http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrogen_cycle [9] http://www.visionlearning.com/library/module_viewer.php?mid=98 22