Bài giảng xu hướng phát triển thực phẩm các phương pháp xác định gmogmf

5/13/2016 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GMO/GMF Nguyễn Tiến Thành April, 2015 Nội dung Tại phải xác định/phát GMO Xác định GMO dựa sở nào? Các phương pháp xác định 5/13/2016 TẠI SAO PHẢI PHÁT HIỆN GMO TẠI SAO? • Xem kiện chứng nhận hay chưa nước sở • Xác nhận sản phẩm hữu cơ/GMF • Liên quan tới dán nhãn • Liên quan tới việc nghiên cứu phát triển giống mới: tính ổn định di truyền, đánh giá khả phát tán gen vào môi trường… 5/13/2016 Sự khác biệt mặt di truyền GMO đối chứng non-GMO • GMO = non GMO + đoạn gen chuyển vào (chèn vào) Đoạn chèn bị biến đổi  chức dự kiến, ví dụ kháng thuốc trừ cỏ) Các cá thể mang đoạn chèn bị loại bỏ (môi trường chọn lọc…) Đoạn chèn nguyên vẹn (giữ chức dự kiến) chèn nhiều vị trí khác cá thể chọn cuối (dựa ưu thế) để phát triển tiếp Trong cá thể này, vị trí chèn đoạn chèn cụ thể đặc trưng (sự kiện chuyển gen) Đoạn gen chuyển GMO hoạt động/biến đổi Đoạn ADN chuyển sản phẩm protein biểu tương ứng Phát tán mơi trường, sang sinh vật khác (ví dụ phấn hoa sang trồng khác) lai tạo, sinh sản thành hệ (mang đoạn chèn nguyên vẹn bị biến đổi) Thức ăn trực tiếp cho sinh vật khác: chuột, động vật, sâu bọ (ADN, protein bị biến đổi?) Sản phẩm chế biến  ADN, protein bị biến đổi, có mặt sản phẩm cuối hay khơng? Sản phẩm khơng qua chế biến (có mặt ADN, protein) 5/13/2016 Sự biến đổi đoạn AND chuyển chèn protein tương ứng • Trong GMO: • ADN đoạn chèn tồn tế bào phận • Protein tương ứng biểu khơng đồng phụ thuộc tác động bên ngồi (mơi trường, điều kiện dinh dưỡng) • Từ GMO qua q trình chế biến, ADN protein giữ nguyên, bị biến đổi phân giải hoàn toàn tới sản phẩm cuối Trong GMO sản phẩm có chứa GMO cịn tồn ADN ngoại lai chèn vào sản phẩm protein tương ứng  phát GMO/sản phẩm chứa GMO thơng qua có mặt đối tượng Tại phải kiểm tra GMO ? • Đánh giá di truyền qua hệ: ổn định hay không? • Đánh giá khả phát tán gen trôi gen? • Kiểm tra xem lơ sản phẩm có mang kiện chứng nhận an toàn nước sở hay chưa • Dán nhãn sản phẩm 5/13/2016 Các bước phân tích GMO Khơng sử dụng nước sở Sản phẩm nghi chứa GMO? Không Kiểm tra GMO hay khơng phải GMO? Có Chưa Sự kiện chứng nhận AT chưa? Rồi Định lượng Dán nhãn hay khơng? Quy trình định dán nhãn sản phẩm hay khơng? (ví dụ ÚC) 5/13/2016 Các vấn đề cần quan tâm với phương pháp kiểm tra GMO/GMF • Mục đích phép kiểm tra: định tính hay định lượng? • Chi phí: tăng lên độ xác u cầu tăng • Sản phẩm dạng gì: nguyên liệu, sản phẩm trung gian, hay sản phẩm cuối: • Sản phẩm đồng hay không? Sản phẩm đồng cho phép độ xác cao hơn, định cỡ mẫu… Phân loại nhóm phương pháp • Theo mục đích • Định tính: sàng lọc GMO, xác định gen chuyển kiện chuyển gen gì? • Định lượng • Theo đối tượng xác định • Dựa protein • Dựa DNA 5/13/2016 Phương pháp định tính sàng lọc • Trả lời câu hỏi: YES /NO • Xác định phổ kiện biến đổi gen không xác định cụ thể gen chuyển sử dụng kiện • Thường dựa trình tự phổ biến dùng kiện chuyển gen promoter 35S, trình tự kết thúc Nos 80% kiện chuyển gen sử dụng trình tự Phương pháp định tính xác định • Gen chuyển gì: Dựa gen chuyển vào trồng chủ: ví dụ gen cry1b (tạo δ-endotoxin) từ vi khuẩn Bt đưa vào ngô kháng sâu cánh vẩy  xác định qua ADN gen cry1b qua protein δendotoxin (B) • Cấu trúc đoạn chèn: thường dựa ADN vùng promoter Terminator với gen chuyển (B) • Xác định kiện chuyển gen: dựa ADN vùng tiếp giáp đoạn chèn hệ gen sinh vật chủ (C) 5/13/2016 Phương pháp định lượng • Xác định số lương tuyệt đối GMO có mặt sản phẩm tỷ lệ tương đối GMO tổng số lượng sản phẩm (để dán nhãn) • Các phương pháp dựa ADN hay protein Giới hạn phát (LOD) • Thể độ nhạy phương pháp xác định • Là ngưỡng mà phương pháp sử dụng phát được: ví dụ LOD 1%, 1% phát • Xác định LOD cho sản phẩm chứa nhiều thành phần khác phức tạp hơn: • tỷ lệ GMO sử dụng thấp nhiều, ví dụ bánh sử dụng bột đậu nành 1%, có 1% lượng bột đậu nành đậu nành chuyển gen  0.01 % khối lượng bánh • Sử dụng thông qua ADN, protein: tách chiết từ mẫu, có ADN protein từ thành phần khác khơng phải loại ngun liệu: ví dụ từ ngơ, đậu nành, bột mì, ADN tổng từ nguồn khác 5/13/2016 Giới hạn phát (LOD) • Ở Úc: luật dán nhãn ngưỡng tính theo thành phần, thơng qua tỷ lệ/tổng số để định dán nhãn hay không? • Ví dụ: đặt ngưỡng dán nhãn 1% tổng sản phẩm nguyên liệu GM 1% tổng sản phẩm  không cần kiểm tra • Và LOD phương pháp cần đảm bảo 0.01% Giới hạn phát (LOD) • Ở Nhật: ngưỡng dán nhãn 5% tổng sản phẩm • Đậu tương: sản phẩm dạng bột đậu tương ; chiếm 5% số đậu tương hạt GM  dán nhãn • Bột Đậu tương làm bánh (bao gồm bột nguyên liệu khác): tính tổng khối lượng bánh: lượng đậu tương chuyển gen chiếm 5% khơng phải dán nhãn (mặc dù sử dụng tồn đậu tương chuyển gen) • Nếu ngưỡng dán nhãn 5% tổng số sản phẩm, lượng nguyên liệu sử dụng 5% tổng số sản phẩm, LOD u cầu = 0.25% 5/13/2016 Nhóm phương pháp dựa protein • Xác định dựa đặc tính kích thước, pH: chạy điện di SDS chiều, chiều để phân tách protein thành băng riêng biệt, sau xác định tiếp cách phương pháp khác • Nhóm phương pháp sử dụng phản ứng miễn dịch kháng thể (antibody) • ELISA • Sắc ký miễn dịch ELISA – ngun tắc • Mỗi protein thường có kháng thể đặc hiệu cho (liên kết với protein) sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát protein • Enzyme Linked Immunosorbent Assay: phản ứng miễn dịch liên kết enzyme 10 5/13/2016 ELISA - kết Cơ chất S chuyển hoá Enzyme tạo sản phẩm có màu (hấp phụ UV vis)  định lượng sản phẩm  lượng protein ELISA – ưu điểm • Chuẩn bị mẫu khơng phức tạp Nhanh (2-4 tiếng, bao gồm chuẩn bị mẫu) • Sử dụng tốt cho định tính bán định lượng • Chi phí rẻ (AUS$10-50) • Phương pháp thực đơn giản • Có tính kinh tế sơ với pp dựa ADN • Cần kỹ so với pp dựa ADN • Thiết bị đơn giản, rẻ tiền 11 5/13/2016 ELISA –nhược điểm • • • • Độ nhạy thấp phương pháp dựa ADN, khoảng 0.5%-1% ELISA Kit cần bảo quản tốt 4°C Chi phí thiết bị mức trung bình (máy đọc vi phiến ELISA) Cần kháng thể đặc hiệu: khơng có, thời gian tạo kháng thể đặc hiệu cho • Định lượng dựa protein đơi khơng xác biến thiên hàm lượng tác động bên thời tiết, điều kiện dinh dưỡng • Chỉ áp dụng cho trưòng hợp protein biểu tạo lượng đủ phát hiện, không áp dụng với truờng hợp có protein nội sinh giống protein đưa vào • u cầu cao cấu trúc protein: khơng biến tính, không bị gắn thêm đoạn protein hay polysacharite khác Sắc ký miễn dịch – Nguyên tắc 12 5/13/2016 Sắc ký miễn dịch – Kết Sắc ký miễn dịch – Ưu điểm • Đơn giản, sử dụng thực địa • Khơng cần đào tạo • Chuẩn bị mẫu nhanh đơn giản • Phép thử định tính nhanh (5-10 minutes) • Rẻ (AUS$5-20) • Bảo quản que thử nhiệt độ thường • Khơng cần thiết bị đắt tiền 13 5/13/2016 Sắc ký miễn dịch – Nhược điểm • Độ nhạy thấp (~1% (w/w) GM protein) • Cần kháng thể đặc hiệu thời gian tạo kháng thể thường kéo dài vài tháng, vài năm • Mỗi que thử phép kiểm tra • Nhiều GMO khơng biểu đủ lượng protein tái tổ hợp cho phép thử • Chỉ phù hợp cho phép thử nhanh, đối tượng chưa qua công đoạn chế biến Phương pháp khác • Sử dụng ống nghiệm: kháng thể cố định chất mang, ví dụ hạt nano carbon, phản ứng miễn dịch tốt có di chuyển hạt chất mang kháng thể 14 5/13/2016 Phương pháp dựa protein – Ưu điểm chung • Rẻ tiền, đơn giản • Chuẩn bị mẫu đơn giản • Khơng địi hỏi kỹ cao • Phù hợp cho sản phẩm chưa qua chế biến (đặc biệt tác động làm biến tính protein) • Nhanh Phương pháp dựa protein – nhược điểm chung • Sản xuất kháng thể đặc hiệu • Sự tương tác kháng thể với protein khác có cấu trúc tương tự • Khơng phù hợp để sử dụng cho phép thử sàng lọc tính đặc hiệu kháng thể • Hàm lượng protein tế bào (từ phần sinh vật) khác nhau, áp dụng protein biểu • Thường cho số tuyệt đối lượng protein, thực tế để định sản phẩm có phải dán nhãn hay khơng, cần tỷ lệ tương đối • Khơng phù hợp sử dụng để kiểm sốt trơi gen protein bị thay đổi từ gen chuyển từ cá thể sang cá thể khác 15 5/13/2016 Các phương pháp dựa DNA • Sử dụng trình tự ADN đặc trưng cho GMO thành phần khác thực phẩm • ADN khuyếch đại số lượng = PCR, phương pháp dựa DNA có độ nhạy cao Tách chiết ADN từ mẫu • Công đoạn tốn thời gian nhất, định chất lượng ADN ảnh hưởng tới cơng đoạn tiếp theo: có mặt thành phần khác lipid, protein, polysacharide ảnh hưởng tới phản ứng khuếch đại ADN • 1st: bổ sung hố chất để phá tế bào giải phóng ADN (thường chất tẩy rửa anion, lysozyme) • 2nd: loại protein (kết tủa protein) thành phần khác • 3rd: kết tủa chọn lọc ADN alcohol Sau tiếp tục tinh nhựa liên kết AND (tuy nhiên làm tổn thất ADN) 16 5/13/2016 Khuếch đại ADN PCR • Sử dụng mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng đó, tạo thành sản phẩm có kích thước dự kiến • Tuỳ thuộc thơng tin kiện cụ thể, dựa trình tự đoạn chèn vùng kế cận, mồi sử dụng phản ứng nhân gen PCR thiết kế Khuếch đại PCR • Vùng A: sàng lọc • Vùng B: đặc trưng cấu trúc, nhiều trồng khác nhau, sử dụng để định tính • Vùng C: đặc trưng cho kiện chuyển gen cụ thể, sử dụng định tính định lượng 17 5/13/2016 Phương pháp PCR để sàng lọc • Dưa trình tự phổ biến, sử dụng trồng GM, qua sàng lọc 80% GM sử dụng trình tự sau: • Promoter CaMV 35S (A.tumefaciens) • NOS terminator (A.tumefaciens) • Thơng thường cần kết PCR dương tính với trình tự P35S NOS (tạo băng sản phẩm tương ứng) • Định tính cho nhiều loại GMO (nếu sử dụng trình tự này) • Độ nhạy 0.1% GMO Phương pháp PCR định tính xác định cấu trúc đoạn chèn (gen chuyển) • Dựa trình tự vùng tiếp giáp promoter gen mã hoá vốn khơng có sẵn tự nhiên • Định tính • Độ nhạy 0.1% GMO • Xác định gen sử dụng cụ thể • Có thể sử dụng để phát trơi gen vào trồng khác • Khơng xác định kiện chuyển gen cụ thể 18 5/13/2016 Phương pháp PCR định tính, xác định kiện chuyển gen cụ thể • Dựa vùng tiếp giáp hệ gen chủ đoạn chèn vào • Vùng tiếp giáp đoạn chèn vào hệ gen chủ đặc trưng cho kiện chuyển gen • Ví dụ: • Một quốc gia cho chấp thuận kiện Bông biến đổi gen A, không chấp thuận kiện biến đôi gen B  xác định phương pháp nào? • Nếu quốc gia khơng chấp nhận bơng biến đổi gen, phương pháp sử dụng GM? Phương pháp PCR định lượng • Bắt buộc định lượng để dán nhãn • Định lượng tương đối: tỷ lệ lượng ADN đặc trưng cho GMO/lượng ADN đặc trưng cho non-GMO Tỷ lệ xác định trực tiếp từ mẫu ban đầu mà phải nhân lên phương pháp PCR (realtime PCR), tính tốn tỷ lệ sản phẩm sau khuếch đại  tính tốn ngược lại tỷ lệ ban đầu • Đoạn ADN đặc trưng cho GMO nên vùng tiếp giáp để đảm bảo độ xác để định lượng • Đoạn ADN đặc trưng cho non-GMO nên từ gen hoạt động ổn định điều kiện, có mặt giống • Chi phí đắt: thiết bị hố chất phát quang • Địi hỏi kỹ cao 19 5/13/2016 Ưu điểm chung phương pháp sử dụng PCR • Định tính  định lượng • sàng lọc GMO đặc trưng kiện • Dựa ADN, tất tế bào có • Có thể định lượng tương đối • Độ nhạy cao Nhược điểm chung phương pháp sử dụng PCR • Cần thời gian, kỹ • ADN bị biến đổi, phân giải sau q trình chế biến • Phản ứng PCR bị ảnh hưởng yếu tố bên ngồi • Dễ bị ảnh hưởng nhiễm tạp • u cầu trình tự đoạn ADN đích 20 5/13/2016 Các bước kiểm tra GMO mẫu • Quy trình lấy mẫu • Lấy mẫu cần đại diện cho tồn lơ mẫu, đặc biệt mẫu thơ (dạng hạt rời) độ đồng thấp • Cần quan tâm tới: kế hoạch lấy mẫu, cỡ mẫu, mẫu đại diện, chuẩn bị mẫu, phân tích báo cáo kết Cỡ mẫu • Quyết định độ nhạy phương pháp (LOD), phải đảm bảo đủ lớn phép phát đối tượng cần phân tích độ nhạy yêu cầu, đặc biệt với mẫu không đồng nhất, cỡ mẫu nhỏ, không đủ nhạy để phát GMO • Cỡ mẫu lớn giảm rủi ro cho người bán người mua Nhưng cỡ mẫu cần phải phù hợp với số lượng mẫu cần phân tích, chi phí độ nhạy phát • Tỷ lê thành phần cần xác định định cỡ mẫu, quy trình tách chiết thu nhận thành phần xác định định cỡ mẫu 21 5/13/2016 Cỡ mẫu • Cơng thức tính cỡ mẫu GIPSA (USDA) • 1-(r/100) = (1-(p/100))n • n: cỡ mẫu (số hạt) • p: % số hạt biến đổi gen mẫu • r: xác xuất từ chối lơ mẫu • Ví dụ: người mua chấp nhận ngưỡng tỷ lệ hạt GM 1%, xác xuất từ chối lô hàng 5%, số hạt cần lấy mẫu: 299 hạt Nếu người mua cấp nhận ngưỡng 0.5%, độ tin cậy 95%, số hạt cần cho mẫu 598 hạt Nếu ngưỡng chấp nhận 5%, cỡ mẫu 60 hạt Chuẩn bị phân tích mẫu • Cần nghiền nhỏ mẫu • Hạn chế nhiễm tạp chéo từ dụng cụ lấy mẫu, vận chuyển bảo quản • Phương pháp tách chiết cần đảm bảo thu nhận đủ lượng chất lượng ADN (hoặc protein) để phân tích • Phân tích mẫu với phương pháp thích hợp tuỳ theo mục đích phân tích 22 5/13/2016 Ví dụ • Trong sản phẩm bánh mì sử dụng % bột ngơ so với khối lượng bánh mì, có chiếm lượng nhỏ ngô biến đổi gen MON89034  làm để đưa yêu cầu dán nhãn với bánh mì này? Chọn đoạn ADN đặc trưng cho MON89034 • Tính trạng MON89034 gì? sử dụng gen gì? Cry1A.105 Cry2Ab2, • Chọn vùng tiếp giáp đoạn chèn với hệ gen ngô để sử dụng 23 5/13/2016 Chọn ADN đặc trưng cho hệ gen ngơ • • • • Chỉ có hệ gen Có mặt tất giống ngơ (kể ngơ thường ngơ GM) Trình tự biết rõ ví dụ gen hmg Thiết kế mồi đặc hiệu để nhân đoạn ADN chọn • Dựa trình tự đoạn ADN đặc trưng cho MON89034 gen đối chứng, thiết kế mồi • Mồi phải đảm bảo số yêu cầu cụ thể: đặc hiệu tạo sản phẩm độ dài khoảng 100 -200 bp • Có thể gắn mồi với đuôi phát quang không 24 5/13/2016 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu • Sử dụng phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu bánh mì cho đảm bảo chất lượng ADN tốt, khơng nhiễm tạp thành phần khác ảnh hưởng tới phản ứng PCR • ADN tổng số bao gồm ADN từ ngô chuyển gen ADN từ ngô thông thường ADN từ thành phần khác (lúa mì…) Chạy Real time PCR • Sử dụng cặp mồi thiết kế để nhân đoạn đích đặc trưng cho MON89034 ngơ thơng thường • Theo dõi trình nhân gen hệ thống máy PCR đặc biệt, tín hiệu thu thường xuyên có đoạn phát quang, sử dụng chất màu ADN (như SBGR) • Tính tốn lượng ADN ban đầu tương ứng với MON89034 ngô thường • Xác định tỷ lệ ADN ban đầu ngô MON89034 ngô thường = tỷ lệ lượng ngô sử dụng  dán nhãn hay khơng • Ví dụ tỷ lệ 1%  dán nhãn hay không? (với Việt nam) http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/MON89034_validated_Method.pdf 25