Khóa luận tốt nghiệp đại học phân tích vai trò của gốc methionine trong cấu trúc nhân tố phiên mã ở cây đậu tương (glycine max (l ) merr 1917

MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đậu tƣơng 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu tương 1.1.2 Đặc điểm sinh học đậu tương 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái học đậu tương 1.1.2.2 Đặc điểm di truyền đậu tương 1.1.3 Vai trò đậu tương 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam 1.1.4.1 Tình hình sản xuất đậu tương giới 1.1.4.2 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam 1.2 Tổng quan nhân tố phiên mã nghiên cứu 10 1.2.1 Nhân tố phiên mã bHLH (Basic Helix-Loop-Helix) 10 1.2.2 Nhân tố phiên mã bZIP (Basic Leucine Zipper) 11 1.2.3 Nhân tố phiên mã SRF (Serum-Response Factor) 11 1.3 Met vai trò Met đáp ứng điều kiện bất lợi 12 1.4 Lịch sử nghiên cứu 13 1.4.1 Lịch sử nghiên cứu giới 13 1.4.2 Lịch sử nghiên cứu Việt Nam 14 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1.Vật liệu nghiên cứu 15 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phương pháp phân tích đặc tính protein đậu tương 15 2.2.3 Phương pháp tính %Met ngồi vùng bảo thủ 16 2.2.4 Phương pháp xác định vị trí phân bố protein tế bào 16 2.2.5 Phương pháp phân tích mức độ biểu gen mã hóa điều kiện thường điều kiện mặn 17 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Phân tích đặc tính protein ba nh m TF giàu Met đậu tƣơng 18 3.1.1 Nhóm bHLH đậu tương 18 3.1.2.Nhóm bZIP đậu tương 22 3.1.3 Nhóm SRF đậu tương 23 3.2 Phân tích mật độ phân bố Met vùng bảo thủ nhóm TF giàu Met đậu tƣơng 26 3.3 Phân tích liệu biểu gene mã h a TF giàu Met đậu tƣơng điều kiện 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 Kết luận 32 Đề xuất 32 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây đậu tƣơng (Glycine max) đối tƣợng trồng quan trọng giới Đây nguồn nguyên liệu quan trọng ngành công nghiệp, đặc biệt sản xuất chế biến, sử dụng làm thức ăn cho gia súc [6] Tuy nhiên, tác động biến đổi khí hậu diễn liên tục kéo dài ảnh hƣởng đến suất sản lƣợng đậu tƣơng [1] Chính vậy, nghiên cứu đậu tƣơng thƣờng hƣớng đến mục tiêu cải thiện tính chống chịu bất lợi nâng cao suất giống nh m đáp ứng với biến đổi khí hậu Trong genome thực vật có khoảng 7% gene mã hóa cho yếu tố phiên mã (transcription factor, TF) [47], phần nhiều số đ đƣợc chứng minh c đáp ứng với bất lợi môi trƣờng [26] Các TF phân tử protein nhận biết trình tự đặc hiệu v ng promoter (yếu tố điều h a cis- , từ đ điều h a biểu gene đích c tác động điều kiện bất lợi [26], chúng tham gia vào đáp ứng bất lợi môi trƣờng [12,43] Các họ TF lớn thực vật c thể đƣợc liệt kê nhƣ bZIP [51], NAC [30], WRKY [50] bHLH [20] Trong nội dung kh a luận này, họ TF lớn thực vật gồm bHLH, bZIP SRF đƣợc tập trung nghiên cứu Methionine (Met) gốc amino acid đ ng vai trị vơ quan trọng đời sống sinh giới [42] Met đơn vị cấu thành nên cấu trúc chuỗi protein, tham gia vào chu trình Yang, liên quan đến hàng loạt chu trình nội bào quan trọng nhƣ hình thành nên màng tế bào, tổng hợp diệp lục củng cố thành tế bào [9] Tuy nhiên, cấu tạo mạch có chứa lƣu huỳnh nên gốc Met dễ bị ôxi h a, làm thay đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi chức phân tử protein tế bào Điều đáng ý khoảng 68% phân tử bị ơxi hóa tế bào protein [44], đƣợc xem đối tƣợng dễ bị tác động điều kiện bất lợi [27] Xuất phát từ lí trên, chúng tơi thực đề tài “Phân tích vai trị gốc methionine cấu trúc nhân tố phiên mã đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merr.1917)” Mục ti u nghi n cứu đề tài Mục đích nghiên cứu nh m làm r giả thuyết vai tr bảo vệ gốc Met phân tử protein đ ng vai tr TF đậu tƣơng Nội dung nghi n cứu  Phân tích đặc tính nh m TF giàu Met đậu tƣơng  Xác định mật độ phân bố Met ngồi vùng bảo thủ nhóm TF giàu Met đậu tƣơng  Phân tích mức độ biểu gene mã h a TF giàu đậu tƣơng điều kiện thƣờng điều kiện xử lí mặn Ý nghĩa hoa học ý nghĩa thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học  Nghiên cứu nh m cung cấp dẫn liệu quan trọng cho nghiên cứu nh m phân tích rõ vai trị gene mã hóa giàu Met liên quan đến tính chống chịu bất lợi thực vật 4.2 Ý nghĩa thực tiễn  Kết nghiên cứu s cung cấp gene ứng viên mã h a bHLH, bZIP SRF c đáp ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi nh m phục vụ công tác chọn tạo giống nh m nâng cao tính chống chịu đậu tƣơng NỘI DUNG Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đậu tƣơng 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu tương Cây đậu tƣơng trồng có lịch sử lâu đời đ ng vai trị quan trọng nơng nghiệp nhƣ công nghiệp giới Theo nghiên cứu gần nhà khoa học r ng đậu tƣơng c nguồn gốc từ châu Á đƣợc trồng Trung Quốc vào khoảng 5000 năm trƣớc công nguyên [19] Nghiên cứu khác Hymowitz cho r ng đậu tƣơng đƣợc hóa gieo trồng phần phía đơng bắc Trung Quốc vào kỉ XI trƣớc công nguyên, sau đ n đƣợc du nhập vào Hàn Quốc, Nhật Bản nƣớc Đông Nam Á vào khoảng kỉ XI đến kỉ XIII trƣớc công nguyên [18] Sau chiến tranh giới thứ hai, đậu tƣơng đƣợc trồng phát triển mạnh Hoa Kỳ, Brazil Canada Theo sách “Vân Đài loại ngữ” Lê Quý Đơn, Việt Nam có lịch sử canh tác đậu tƣơng vào khoảng kỉ thứ VI [4] Trong số ghi chép cho r ng đậu tƣơng đƣợc canh tác nƣớc ta vào thời vua H ng trƣớc đậu xanh đậu đen [2] Đậu tƣơng đƣợc trồng chủ yếu để lấy hạt, loại thực phẩm quan trọng sau lúa mì, lúa nƣớc ngô Ở Châu Mỹ nơi c diện tích canh tác đậu tƣơng lớn lên tới 70% tiếp sau đ Châu Á Theo số liệu năm 1993 Việt Nam hình thành vùng sản xuất đậu tƣơng trọng điểm nƣớc với diện tích lớn bao gồm: v ng Đơng Nam Bộ (26,2%), miền núi Bắc Bộ (24,7% , đồng b ng sông Cửu Long (12,4% , đồng b ng sông Hồng (17,5%), hai vùng lại đồng b ng ven biển miền Trung Tây Nguyên với diện tích canh tác thấp [2] Đậu tƣơng hay số nơi c n gọi đỗ tƣơng, đậu nành hoàng đậu miêu thuộc Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bƣớm Papilionoideae, chi Glycine với tên khoa học Glycine max Dựa vào đặc điểm hình thái, phân bố địa lý số lƣợng nhiễm sắc thể Hymowit Newell (1984) xây dựng ngồi chi Glycine cịn có thêm chi phụ Soja Chi Glycine đƣợc chia thành loài hoang dại lâu năm, chi phụ Soja đƣợc chia làm loài: loài đậu tƣơng trồng Glycine (L.) Merr loài hoang dại hàng năm G.Soja Sieb Zucc [6] 1.1.2 Đặc điểm sinh học đậu tương 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái học đậu tương Đậu tƣơng hai mầm, thân thảo Thân có hình trịn, thân có nhiều lơng nhỏ, màu trắng Thân lúc cịn non có màu xanh màu tím, già chuyển sang màu nâu nhạt Màu sắc thân non cho ta biết màu sắc hoa sau này, thân lúc non màu xanh hoa màu trắng c n non thân c màu tím hoa c màu tím đỏ Thân đậu tƣơng thƣờng có chiều cao từ 0,3 - 1m tùy theo giống [6] Cây đậu tƣơng c kép, mọc so le, gồm chét có dạng hình bầu dục hình trái xoan Gốc tr n, đầu nhọn, dài từ - 12cm, rộng từ - 8cm Lá chét bên lệch, hai mặt có lơng bao phủ, gân có cuống chung dài từ - 10cm, có lơng bao phủ (Hình 1.1) [5] Lá đa dạng hình dạng phụ thuộc vào giống, giống có dài nhỏ chịu hạn tốt nhƣng thƣờng cho suất kém, giống to thƣờng cho suất cao nhƣng tính chống chịu Số lƣợng nhiều, to khỏe vào thời kì hoa rộ Khi phiến phát triển to, rộng, mỏng phẳng c màu xanh tƣơi chứng tỏ sinh trƣởng khỏe có khả cho suất cao [6] Hoa thƣờng nhỏ, có màu tím màu trắng, hình chng, phủ lơng mềm Tràng hoa có cánh cờ mở rộng, khơng có tai, nhị bó, bầu có lơng (Hình 1.1)[5] Hoa thƣờng mọc thành chùm, chùm có từ - hoa Hoa đậu tƣơng hoa lƣỡng tính nên tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn thấp chiếm khoảng 0,5 - 1% [6] Quả đậu tƣơng thẳng cong, dài từ - 7cm Mỗi thƣờng có từ - hạt Lúc cịn non có màu xan, chín có màu nâu Hạt có hình trịn, hình bầu dục Những giống có hạt màu vàng thƣơng c giá trị thƣơng phẩm cao Trong hạt, phôi thƣờng chiếm 2%, hai tử điệp chiếm 90% 8% lại vỏ hạt tổng khối lƣợng hạt Hình dạng màu sắc rốn hạt đặc trƣng cho giống (Hình 1.1)[6] Bộ rễ đậu tƣơng gồm rễ rễ phụ Trên rễ có nhiều nốt sần, đ kết cộng sinh vi khuẩn Rhizobium jabonicum với rễ Nốt sần dài tới 1cm, đƣờng kính từ - 6mm, hình thành có màu trắng sữa, phát triển tốt nốt sần có màu hồng Nốt sần tập trung nhiều tầng đất c độ sâu từ - 20cm, có vai trị quan trọng việc cố định từ nitơ khơng khí với lƣợng đạm cung cấp cho khoảng 30 - 60kg/ha (Hình 1.1) [6] Hình 1.1: Đặc điểm Hình thái đậu tƣơng (Nguồn tài liệu tham khảo: https://www.croplan.com) A: Hoa đậu tƣơng; B: Quả đậu tƣơng; C: Lá đậu tƣơng; D: Rễ đậu tƣơng 1.1.2.2 Đặc điểm di truyền đậu tương Đậu tƣơng thuộc chi Glycine có tổ tiên loài hoang dại Glycine soja Glycine chi Phaseoleae mà loài có số nhiễm sắc thể nhị bội 2n = 40 80 20 [2] Trong nghiên cứu Lackey số nhiễm sắc thể Glycine bắt nguồn từ loài nhị bội với số nhiễm sắc thể gốc x = 11 trải qua trình đa bội lệch khuyết có gốc x = 10 đa bội thể cho nhiễm sắc thể lên đến 40 80 [29] Theo Gurley, đậu tƣơng dạng tứ bội bền vững nhiễm nhị bội [15] Cây đậu tƣơng có nhiễm sắc thể lƣỡng bội 2n = 40 với kích thƣớc vào khoảng 1115Mb bao gồm 1,115 triệu cặp bazơ nhiễm sắc thể đơn bội [8] Trong tồn genome có khoảng 40 - 60% trình tự gen lặp lại [15,16] Đậu tƣơng c nhiễm sắc thể 2n = 40 với tỷ lệ G/C trung bình 34,8%, số lƣợng protein trung bình 89 597 số lƣợng gen trung bình 56 680 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5) 1.1.3 Vai trị đậu tương Đậu tƣơng trồng ngắn ngày đem lại giá trị kinh tế cao có tác dụng nhiều mặt nhƣ: làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu nhiều ngành công nghiệp, cải tạo đất Vì đậu tƣơng đƣợc mệnh danh “ Ơng hồng loại họ đậu” [6] Đậu tƣơng đƣợc biết tới loại ngũ cốc c hàm lƣợng dinh dƣỡng cao hàm lƣợng protein trung bình khoảng 35,5 - 40% So với hàm lƣợng protein gạo (6,2 - 12%), ngô (9,8 - 13,2%) hay loại thịt nhƣ thịt bò (21%), thịt gà (20%), cá (17 - 20% hàm lƣợng protein đậu tƣơng mức cao, lipit khoảng 15 - 20%, carbohydrate khoảng 15 - 16% số khoáng chất khác cần cho sống [3] Protein đậu tƣơng đƣợc coi loại protein thực vật có phẩm chất tốt, dễ tiêu h a protein thịt đặc biệt khơng có thành phần tạo cholesterol Hàm lƣợng lipid đậu tƣơng cao, chứa khoảng 60 - 70% acid béo không no tốt cho sức khỏe Bên cạnh đ , hạt đậu tƣơng c chứa nhiều vitamin khoáng chất nhƣ vitamin B1, vitamin B2, vitamin C, Ca, Fe, P [6] Ngoài đƣợc sử dụng để chế biến thành loại thực phẩm cho ngƣời, đậu tƣơng c n đƣợc sử dụng làm thức ăn cho gia súc Khoảng 1kg hạt đậu tƣơng khô tƣơng đƣơng với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn đậu tƣơng c chứa hàm lƣợng đạm cao sử dụng làm thức ăn cho gia súc nghiền khô để chế biến thức ăn tổng hợp tốt Sản phẩm phụ công nghiệp nhƣ khơ dầu có thành phần dinh dƣỡng cao: N: 6,2%, P2O5: 0,7%, K2O: 2,4% làm thức ăn bổ sung cho gia súc tốt [2] Hiện nay, nguồn lƣợng hóa thạch nhƣ than đá, dầu mỏ có trữ lƣợng ngày giảm kèm theo tƣợng biến đổi khí hậu vấn đề môi trƣờng nên nhiên liệu sinh học giải pháp thay tốt Biodiesel nhiên liệu tái tạo đƣợc coi thay tốt cho nhiên liệu diesel Trong đ dầu đƣợc chiết xuất từ hạt đậu tƣơng đƣợc coi nguồn nguyên liệu để sản xuất dầu diezel sinh học Ngồi nguyên liệu sản xuất dầu diezel sinh học, dầu đậu tƣơng c thể sử dụng để sản xuất dạng nhiên liệu sinh học khác bioethanol Vỏ đậu tƣơng chứa lƣợng lớn carbohydrate sử dụng để tạo bioethanol làm thức ăn cho động vật có chứa hàm lƣợng protein cao Kết kiểm tra khí thải động cho thấy r ng sử dụng dầu diesel sinh học tạo khí thải CO, HC, NOx kh i so với petro-diesel [25] Toàn đậu tƣơng (thân, lá, quả, hạt) tƣơi khơ làm thức ăn cho gia súc Đặc biệt đậu tƣơng c vai tr quan trọng việc cải tạo đất rễ có nhiều nốt sần (là kết cộng sinh vi khuẩn Rhizobium jabonicum với rễ) c cố định đạm Vậy trồng khoảng đậu tƣơng sinh trƣởng tốt s tạo khoảng 30 - 60 kg nitơ đất Đối với thân đậu tƣơng c chứa lƣợng lớn nitơ nên sau thu hoạch sử dụng nhƣ phân hữu để b n cho đất trồng khác Việc luân canh đậu tƣơng với loại trồng khác đƣợc xem biện pháp cải tạo đất trồng tốt [6] 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam 1.1.4.1 Tình hình sản xuất đậu tương giới Đậu tƣơng trồng có giá trị kinh tế dinh dƣỡng cao, đƣợc xem loại thực phẩm quan trọng bậc giới sau lúa mì, lúa nƣớc ngơ Do có khả thích ứng rộng với điều kiện khí hậu khác nên đậu tƣơng đƣợc canh trồng rộng rãi toàn giới, nhƣng tập trung chủ yếu Hoa Kỳ, tiếp đến Châu Á Theo số liệu từ bảng 1.1 cho thấy tổng diện tích canh tác đậu tƣơng tồn giới khoảng 121,5 triệu ha, đ : Hoa Kỳ 33,5 triệu (28% , Brazil đạt 33,2 triệu (27,2%), Argentina 19,5 triệu (16%), Ấn Độ 11,5 triệu (9%) Trung Quốc 6,6 triệu (5,5%) Số liệu từ bảng 1.1 cho thấy tổng sản lƣợng giới 334,9 triệu tăng khoảng 11,7 triệu so với năm 2015 Tổng sản lƣợng thu hoạch Hoa Kỳ năm 2016 khoảng 117,2 triệu chiếm gần 35% sản lƣợng giới (FAO, 2016) Bảng 1: Diện tích sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc dẫn đầu toàn giới (FAO, 2016) T n quốc gia Diện tích canh t c Sản lƣợng thu hoạch (triệu ha) (triệu tấn) Hoa Kỳ 33,5 117,2 Brazil 33,2 96,3 Argentina 19,5 58,8 Ấn Độ 11,5 14 Trung Quốc 6,6 11,9 Thế giới 121,5 334,9 protein required for expression of DFR and BAN genes in Arabidopsis siliques”, Plant Cell, (12), 1863–1878 [39] Quach, T.N., Nguyen, H.T.M., Valliyodan, B., Joshi, T., Xu, D., Nguyen, T.H., (2014 , “Genome-wide expression analysis of soybean NF-Y genes reveals potential function in development and drought response”, Mol Genet Genomics, 290(3),1095-115 [40] Quail, P.H., Huq, E., (2002 , “PIF4, a phytochrome-interacting bHLH factor, functions as a negative regulator of phytochrome B signaling in Arabidopsis”, EMBO J, 21(10), 2441-2450 [41] Ramsay, N.A., Glover, B.J., (2005 , “ MYB-bHLH-WD40 protein complex and the evolution of cellular diversity”, Trends Plant Sci, (10), 63–70 [42] Ravanel, S., Gkière, B., Job, D., and Douce, R., (1998 , “The specific features of methionine biosynthesis and metabolism in plants”, Proc Natl Acad Sci USA, (95), 7805-7812 [43] Rushton, D.L., Tripathi, P., Rabara, R.C., Lin, J., Ringler, P., Boken, A.K., Langum, T.J., Smidt, L., Boomsma, D.D., Emme, N.J., Chen, X., Finer, J.J., Shen, Q.J., Rushton, P.J., (2012 , “WRKY transcription factors: Key components in abscisic acid signalling”, Plant Biotechnol J, (10), 2-11 [44] Rinalducci, S., Murgiano, L., Zolla, L., (2008), “Redox proteomics: basic principles and future perspectives for the detection of protein oxidation in plants”, J Exp Bot, 59(14), 3781-3801 [45] Shore, P., Andrew, D., Sharrocks, (1995 , “The MADS-box family of transcription factors”, Eur J Biochem, (229), 1-13 [46] Umezawa, T., M Fujita, Y Fujita, K Yamaguchi-Shinozaki and K Shinozaki, (2006), “Engineering drought tolerance in plants: discovering 38 and tailoring genes to unlock the future”, Curr Opin Biotechnol, (17), 113-122 [47] Udvardi, M.K., Kakar, K., Wandrey, M., Montanari, O., Murray, J., Andriankaja, A., Zhang, J.Y., Benedito, V., Hofer, J.M., Chueng, F., (2007), “Legume transcription factors: Global regulators of plant development and response to the environment”, Plant Physiol, (144), 538–549 [48] Valley, C.C., Cembran, A., Perlmutter, J.D., Lewis, A.K., Labello, N.P., Gao, J., Sachs, J.N., (2012 , “The methionine – aromatic motif plays a unique role in stabilizing protein structure”, J Biol Chem, 287(42), 34979-91 [49] Wei, L.Q., W.Y Xu, Z.Y Deng, Z Su, Y Xue and T Wang., (2010), “Genome-scale analysis and comparison of gene expression profiles in developing and germinated pollen in Oryza sativa”, BMC Genomics, (11), 338 [50] Yu, Y., Wang, N., Hu, R., Xiang, F., (2016 , “Genome-wide identification of soybean WRKY transcription factors in response to salt stress”, SpringerPlus, (5),920 [51] Zhang, M., Liu, Y., Shi, H., Guo, M., Chai M., He, Q.,Yan, K., Cao, D., Zhao, L., Cai, H., and Qin, Y., (2018 , “Evolutionary and expression analyses of soybean basic Leucine zipper transcription factor family”, BMC Genomics, (19), 159 39 PHỤ LỤC Trình tự protein 21 gene nghiên cứu định dạng fasta: >Glyma01g15930 MSQCVPSWDVEDNPPPSRVSLRSNSNSTAPDVPMLDYEVAELTWENGQLSMHGLGLPRVPVKPPTAVTNK YTWEKPRASGTLESIVNQVTSFPHRGKPTPLNGGGGGGVYGNFRVPWFDPHATATTTNTVTMDALVPCSN REQSKQGMESVPGGTCMVGCSTRVGSCCGGKGAKGHEATGRDQSVSGSATFGRDSKHVTLDTCDREFGV GFTSTSINSLENTSSAKHCTKTTTVDDHDSVSHSKPVGEDQDEGKKKRANGKSSVSTKRSRAAAIHNQSER KRRDKINQRMKTLQKLVPNSSKSDKASMLDEVIEYLKQLQAQLQMINRINMSSMMLPLTMQQQLQMSMM SPMGMGLGMGMGMGMGMGMDMNSMNRAHIPGIPPVLHPSAFMPMAASWDAAAAAGGGDRLQGTPAN VMPDPLSTFFGCQSQPMTIDAYSRLAAMYQQLHQPPPASGSKN* >Glyma02g00980 VSFGCVLTSHLHSLFSFNSLCKKSTVDIHQMIRTILHLVNVLSFLWFMNDEEPEDVVKEKPAREGTGVKRSR NAQVHNLCERKRRDKINKRMRILKELIPNCNKTDKASMLDDAIEYLKTLKLQIQMMSMDAGFCIPFMMLR NAAHHMMNTPLLHQLMGLGMGFRPDTAIPCSLPQFPITPLPAITDNRVHFFGFPNQVPPMPISHAPFIPMLG NPSTQTPLATSTAINLAENPASSQLTTLMASVPKNLYLTCQRQLL* >Glyma03g04000 MSQRVPNCDVDDNNNIPTTTKIPLLPNFNFISHEVPMLGYQAAELPCKKGQPSTYKGSHGNLTSTWDKPRT SGGTLESIVSQHVSENRYKLVTMDALVPCSEQQGTQKAVVSERLDACGKSRFPRVVAQEEVEKRAGVVAR GTRGTTTLELGGCKDWSVSGSETCRRELSVTFNSATKGSPENTTSSGKQCTGTTTNDDRDSISHRISQGEVP DEDYKATKVDRSSGSNKRIKANSVVHKQSERRRRDKINQRMKELQKLVPNSSKTDKASMLDEVIQYMKQ LQAQVQMMNWMKMYTSMMLPITMQQQQQQQQLKMSMMMAQMGMGMGMSKDMVMNMNSMNIPGF PPMLPFPSFMPMAPCGDQLQGTPEKSVTMDAYSTMASLYQQLFHPPASSSKN* >Glyma03g32740 MELLWHNGQVVVQSQNQRSLRKLPPVTNSHDASPAGPSMTREIRPLVENFNQHLFMHEGEMASWLHYPID DDEPAFMQTLGHTSQLTELRPMSANPRPPIPPPRRPEQRTPNFAYFSRHNTRAAEPSVKAAARESTVVDSCD TEAAASRVSETVRSAAEGGAGVAAPSTSAGGGRSTMMYDLTMTSSPGGSSSCDEPVQVAAAEEDRKRKG REAEEWECQSELQIPCTLVYANVRWVSDVGLREHSPRCCIYFGAVALCSFGTVITFTVVAAHVQAKKQVC GSTSTKRSRAAEVHNLSERRRRDRINEKMKALQELIPRCNKSDKASMLDEAISYLKSLQLQVQMMSMGCG MVPVMFPGIQQYMPAMGMGVGMGMGMEMGMNRPVMPFPNMLPGSALPAATAAAAHLGPRMQAANQS DNNMVTSAGPPDPNQSRIPNFTDPYQQYLGPHQMQFQLIQNQAMNQPNVSKPSNNGGPANPENH* >Glyma04g04190 MEQLKPEEYQMDVMTMMLQQLPQLSEPYTHTMEGFHPPEDHFYGNNTMPLADLIDNNNPHSSMPWSSSY SFTHLPSSTISFSNNNPIMLQEQQQHSPSETYEDANANPYGGEKRSSMAAMREMIFRMAAMQPIHIDPESVK QPKRRNVKISKDPQSVAARHRRERISERIRILQRLVPGGTKMDTASMLDEAIHYVKFLKTQVQSLQRASSAN NNIRPLGTSTVNATGIGFPVAMSTTSNSTPYFPLPKPYQARHMENMHDRYD* >Glyma11g17120 MSQCVPSWDVEDNPPPSRVSLRSNSNSTAPDVPMLDYEVAELTWENGQLSMHGLGLPRVPVKPPTAATNK YTWEKPRGSGTLESIVNQATSFSHQEKPRPLNGDSGGGGGVYGNFMVPWFDPHAAATTTTTTTNTMTMD ALVPCSNREQGKKKGMESGPGTCMVGCSTRVGSCCGGKGAKGHEASGRDQSVSGSATFGRDSKHVTLDT CDREFGVAFTSTSINSLENTSYAKHCTKTTTIEEHDSVSHSKPMGEDGDEEKKKRANGKSSVSTKRSRAAAI HNQSERKRRDKINQRMKTLQKLVPNSSKTDKASMLDEVIEYLKQLQAQVQMMNRINMSSMMLPLTMQQ QLQMSMMSPMGMGLGMGMGMGMGMGMDMNSMNRANIPGIPPVLHPSAFMPMAASWDAAVAAAAGG GDRLQGTPASVMPDPLSTIFGCQSQPMTMDAYSRLAAMYQQLHQPPTSGSKN* >Glyma13g19250 MELLWQNGQVVMQSQNQRPFRKPPQPPEANGGDGAISAREIRSSEAENYNNSQHLFMQEDEMAAWLHYP IHEDPPPFDHHDFGADIFYPPPNATASQNRGSAAVQSSFRTTELWHPAPRPPIPPPRRPEHAPSRIHNFAHFTK HGNASSSSKAAAAAQPTVVDSCETPVATAEHAETGRARAAAGKTAVSDGGRETATCDVTVTSSPGDSSGS AEPVEREPMADRKRKGREHEESEFQSEDVDFESPEAKKQVHGSTSTKRSRAAEVHNLSERRRRDRINEKM KALQELIPRCNKSDKASMLDEAIEYLKSLQLQVQMMSMGYGMVPMMFPGIQQYMPPMGMGIGMGMGM EMGMGMNRPVMPFTNMLASSTLPAATAAVHLGPRFPMPPFHMPHVAAPDSSRMQGANHPDNNMLNSLG TLDPDQSRIPNFTDPYQQYLGLQQAQLQLMQTMNQQNVSKPSSSRGQENPEKHQSDET* >Glyma20g22280 MEIKNKGAAATSSNPPESILVDSSGECSKEPTMQCQQVVEQSKPDVNSLQPKSVEQNAVPSKQSEPASKESA TKIDQTPNQVLGDSGTKGQTAAEKSMEPAVASSSVCSGTGADQGSDEPNQNLKRKTKDTDDSECHSEDVE EESAGAKKTAGGQGGAGSKRSRAAEVHNLSERRRRDRINEKMRALQELIPNCNKVDKASMLDEAIEYLKT LQLQVQIMSMGAGLYMPPMMLPAGMQHMHAPHMAPFSPMGVGMHMGYGMGYGMGMPDMNGGSSRF PMIQVPQMQGTHIPVAHMSGPTALHGMARSNPPGYGLPGQGYPMHMPPASVFPFSGGPLMNSPAQGLHA RGSSGLVETVDSASASGLKDQMQNVDPQVKQSTGGCDSTSQMPTQCEAAAVGFEQSALAHSRGHASKAN DNGAVNPDPGR* >Glyma05g19920 MDVDIVKTSSNNNNMDVMAMMMQMEKFPELFCDPFYTTSYQETDLLSSGSSSTTSASTLFNNNSIVTTTPP PTTTLVDPTPSNVVQFSKIDDLFQHQHQQQPMSQSLQPYPSEKKNSMAAMREMIFRIAVMQPVHIDPESIKP PKRRNVKISKDPQSVAARHRRERISERIRILQRLVPGGTKMDTASMLDEAIHYVKFLKKQVQTLEQAGANT SPHSNTNSPNNHVVGAAGFPLGMSSNYSNNSSVNYSSLLMKGGCQPCQMFGSTSKQLLS* >Glyma06g04380 MEQQHMDMMTMMMLQHLPEFSEPYTHTMEGFHPPSEEFCGNNNNNIRNTMQLADLIDNNNPLSPIPWSSS YSFTHLPASTTEISFSNNSHPTTPIMLQEHEQQYEGANANPYGGEKRNSMAAMREMIFRMAAMQPIHIDPES VKAPKRRNVKISKDPQSVAARHRRERISERIRILQRLVPGGTKMDTASMLDEAIHYVKFLKTQVQSLERASS ANNNIRPLNAAGQIGFPVASTPYFPLPSKPYQAPNMDNMHDTYH* >Glyma10g04890 MDDDDEEYPIPVSKKPSTQNDEIMELLWQNGQVVMQNQNQRPFRKQPPTTDGDGPIPAREIRSSEAENYNS QHLFMQEDEMASWLHYPIHEDPPPFDHHDFCADILYPPPNATASQNQSSASVQSSVRTTELQHPAPRPPIPPP RRQEHTLSRIHNFTHFAKHGNASSSSKAAAPAQPTVATAEHVETGRASVSAAAGKTPASDGGRETATCDV TVTSSPGGSSGSAEPVQREPVVNRKRKGREQEESEYQSEDVDFESPEAKKQVRGSTSTKRSHAAEVHNLSE RRRRDRINEKMKALQELIPRCNKSDKASMLDEAIEYLKSLQLQVQMMSMGCGMVPMIFPGIQQYMPPMG MGIGMGMGMGMEMGMGMNRSVMPFPNMLASSTLPAATATAHLGPRFPMPPFHMPHVATPDSSRMQGA NHPDNNMLNSLGTLDPDQSCIPNFTDPYQQYLSLQQAQLQLMQTMNQPNVSKPSTSRGQENPEKHQSDKT >Glyma02g01600 MASIQRPASSGSSEGGDPVMYERKRKRMESNRESARRSRMKKQKQLEDLTDEVSRLEGENARLAPSIKVK EEAYVEMEAANDILRAQTMELADRLRFLNSIIEIADEVGGESFEIPQIPDPLFMPWQIPHPMMATPPDMFFHG NEGLFA* >Glyma08g12170 MASPGGSGTYSSGSSSLQNSGSEGDRDIMEQRKRKRMLSNRESARRSRMRKQQHLEGLSAQLDQLKKENT QMNTNIGISTQLYLNVEAENAILRAQMEELSKRLNSLNEMISLINSTTTTNNCLMFDEAQETTTQLFNDCGF MDAWNYGIPLNQQIMAYADNDMLMMY* >Glyma05g28960 MASPGGSGTYSSGSSSLQNSGSEGDRDIMEQRKRKRMLSNRESARRSRIRKQQHLEGLSAQLDQLKKENA QINTNISITTQMYLNVEAENAILRAQMGELSNRLNSLNEMISFINSTNNNCLMMFDEAQETTTQLFNDCGFM DYAWNGIPIMASADNEMLIMY* >Glyma11g26260 MKKMNEISTLCGIETCAIIYSPNDPQPEVWPSDSGVQRVLSRFMEMPEVRQSRKMLNQESFLRQMITKGQQ QLTRQRNENRKKEMTNLMLQYLTAGKVVGNPSLVDLNDLSWLIDQNLNEIEKKITMLQIQEVVIPVIENEG HMNHVQGLESNMDTKKKQH* >Glyma11g30490 MAPGKLKLTFIGNDSKRKNVCKKRKQSLLKKTEELSMLCGVEACAIVYGPNDPRPVIWPSEFGVENVLRKF MSMPHWEQSKKMVNQESFIAQSIMKSKEKLQKIVKENKDIEMSLFMAHCFKTGMFQPDINMTTADMNVL ASIIEQNLKDIDKRME >Glyma11g30620 MAPGKLKLTFIGNDFKRKNVCKKRKQSLLKKTEELSMLCGVEACAIVYGPNDPRPVIWPSELGVENVLRKF MSMPQLEQSKKMVNQESFIAQRIMKSKEKLQKIVKENKEIEMSLFMAHCFKTGMFQPDINMTTADMNVLS SIIEQNLKDIDKRME >Glyma18g05930 MTRKKVQPAFISFDSARKLTYKKMKKGMLKKIDEPSTLCGIEACAIVYSPRILRQRVLEKFMSMPELEQSKK MVNQESFTAQSIMKGNKQMMKLMKDNRRRSRARPDNNMTIANLNFLSRMVDQNLKDIDKRMETLKMQT PALNYALGSDMNTAEPMQNLWFMDFLNN >Glyma18g05960 MATGKLKLTFVANDSQRKTVCKKRKQSLLKKTEELSTLCGIEACAIVYGPNDHRPEIWPSESGVKNVLGKF MNKPQWEQSKKMMNQESFIAQSIMKSKDKLQKVVKENKEIEMSLFMAQCFQTGMFQPDINMTAADMNV LSSEIEQNLKDIDKRMEMLK >Glyma20g27320 MSGPKKSRGRQKIEMKKMSNESNLQVTFSKRRSGLFKKASELCTLCGADVALIVFSPGEKVFSFGHPNVDA VIDRYLERAPPTESFMEAHRMAHVRDLNAQLTQISNHLDAGRKRAEELNLMKKEAQAHLWWARPVDGM SMAQMKQFKAALEELKKQVARLADRAMLQSVTNPTHEFFPAAGVSSSSSSNSNSNPLSPQVFSPHLIQPPM LQNFMSMMPRHHGFNYMGMGGYGPAAGFF* >Glyma10g40080 MSGPKKSRGRQKIEMKKMSNESNLQVTFSKRRNGLFKKASELCTLCGTDVALVVFSPGQKVFSFGHPNVD AVIDRYLARPPPTDSGTMQIIEAHRMAHVHDLNVQLTQINNQLDHERKRTNELNLMNKEAQAQMWWARP VDGMSMAQVKQFKAALEEMKKQVARLVDRAMLQSVTNPTLQFFPGVSSSSNSNLVHQPHPLPAPQVFTP HLIQPPMLQNFMFHDGSMMRHHGFDNIGMGGYGPTAGFF* PHÂN TÍCH VAI TRỊ CỦA GỐC METHIONINE TRONG CẤU TRÚC HỌ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở ĐẬU TƢƠNG (Glycine max) Chu Đức Hà1, La Việt Hồng2, Lê Minh Tuấn1,2, Phạm Phƣơng Thu2, Phạm Thị Lý Thu1 Viện Di truyền Nông nghiệp, VAAS Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Đại học Sƣ phạm Hà Nội Thông tin liên hệ: Chu Đức Hà ĐT: 0983 766 070 Email: hachu_amser@yahoo.com TÓM TẮT Methionine (Met) axit amin đ ng vai tr thiết yếu thực vật Các gốc Met cấu trúc đƣợc giả thuyết tham gia bảo vệ phân tử protein chống lại bất lợi ôxi h a xảy tế bào gặp điều kiện bất lợi Trong nghiên cứu này, 21 phân tử protein giàu Met (Met-rich protein, MRP , thuộc ba nh m nhân tố phiên mã (transcription factor, TF lần lƣợt Basic helix-loop-helix (bHLH , Basic leucine zipper (bZIP Serum response factor (SRF đậu tƣơng (Glycine max đƣợc phân tích nh m chứng tỏ giả thuyết Kết phân tích đƣa 15 MRP c phân bố dày đặc gốc Met hai khoảng ngoại biên quanh v ng bảo thủ Thông qua công cụ tin sinh học, TF ƣa nƣớc hầu nhƣ không bền vững ống nghiệm Trong đ , số TF c thể phân bố tế bào chất, ty thể hệ thống bao g i Dựa liệu biểu điều kiện thƣờng, phần lớn gen mã h a họ bHLH bZIP c xu hƣớng tăng cƣờng biểu quan Phân tích liệu RNA-Seq cho thấy, số gen mã h a họ bHLH SRF c mức độ phiên mã đáp ứng, gen mã h a họ bZIP c đáp ứng tăng rễ đậu tƣơng xử lý mặn Nghiên cứu s đƣợc tiếp tục nh m đánh giá thực nghiệm biểu gen mã h a 21 MRP điều kiện ngoại cảnh bất lợi T hóa: Bất lợi, đậu tƣơng, Methionine, nhân tố phiên mã, tin sinh học I MỞ ĐẦU Dƣới tác động ngoại cảnh bất lợi, dƣ thừa số dạng chứa ôxi nguyên tử hoạt động gây tổn thƣởng đến đại phân tử, ảnh hƣởng tiêu cực đến sinh trƣởng phát triển tế bào thực vật Khoảng 68 % đại phân tử bị tác động từ trình protein Trong đ , gốc Methionine (Met) phân tử protein, có mạch chứa lƣu huỳnh, nên dễ bị ôxi hóa, làm biến đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi gây chức protein [1] Đây axít amin đ ng vai tr thiết yếu đời sống thực vật, tham gia vào đƣờng Yang, liên quan đến nhiều chu trình nội bào quan trọng nhƣ hình thành màng tế bào, tổng hợp diệp lục củng cố thành tế bào [2] Giả thuyết đặt là, liệu r ng gốc Met liên kết chuỗi polypeptide có thực tham gia vào chế bảo vệ cấu trúc để trì chức phân tử protein điều kiện bất lợi hay không? Gần đây, 213 phân tử protein giàu Met (Met-rich protein, MRP đƣợc sàng lọc đậu tƣơng (Glycine max) [3] Các MRP đƣợc xác định tham gia vào nhiều trình quan trọng tế bào, đ , 20 % MRP liên quan đến điều h a phiên mã đậu tƣơng [3] Nhƣ biết, nhân tố phiên mã (transcription factor, TF họ protein tham gia điều h a biểu gen, liên quan đến chế đáp ứng khả chống chịu với điều kiện bất lợi Trong nghiên cứu này, nh m TF giàu Met đậu tƣơng, bao gồm Basic helix-loop-helix' (bHLH), 'Basic leucine zipper (bZIP Serum response factor (SRF [3], đƣợc khai thác để chứng minh giả thuyết vai tr gốc Met liên quan đến chế đáp ứng thực vật để phân tích đặc tính lý h a học protein khảo sát phân bố gốc Met phân tử Mức độ biểu gen mã h a TF đƣợc phân tích số quan đậu tƣơng Kết nghiên cứu c thể cung cấp dẫn liệu quan trọng vai tr gốc Met liên quan đến tính chống chịu điều kiện bất lợi đậu tƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghi n cứu Trình tự protein mã định danh 21 TF giàu Met, bao gồm 11 TF nh m bHLH, TF nh m bZIP TF nh m SRF đƣợc khai thác từ nghiên cứu trƣớc [3] (Bảng Bảng Thông tin TF giàu Met đƣợc khai thác nghiên cứu [3] TF TT Mã định danh TF TT Mã định danh 08 Glyma10g04890 15 Glyma10g40080 02 Glyma02g00980 09 Glyma11g17120 16 Glyma11g26260 03 Glyma03g04000 10 Glyma13g19250 17 Glyma11g30490 04 Glyma03g32740 11 Glyma20g22280 18 Glyma11g30620 05 Glyma04g04190 12 Glyma02g01600 19 Glyma18g05930 06 Glyma05g19920 13 Glyma05g28960 20 Glyma18g05960 07 Glyma06g04380 14 Glyma08g12170 21 Glyma20g27320 bZIP bHLH Glyma01g15930 bHLH 01 TF SRF TT Mã định danh 2.2 Phƣơng ph p nghi n cứu - Phƣơng pháp phân tích v ng bảo thủ protein: Các nh m TF đƣợc kiểm tra v ng bảo thủ b ng phần mềm MEGA (v 7.0 [4] Trình tự ngoại biên từ đầu đến vị trí tiếp giáp v ng bảo thủ đƣợc tách biệt để xác định phân bố gốc Met b ng công cụ BioEDIT [5] - Phƣơng pháp xác định đặc tính lý h a protein: Trình tự axit amin (.fasta đƣợc phân tích công cụ ExPASy Protparam [6] để đánh giá đặc tính lý h a học chuỗi truy vấn Một số tiêu đƣợc quan tâm, bao gồm điểm đẳng điện lý thuyết (Isoelectric point, pI), số bất ổn định (Instability index, II , độ ƣa nƣớc (Grand average of hydropathicity, GRAVY) - Phƣơng pháp dự đốn vị trí phân bố nội bào protein: Trình tự axít amin (.fasta TF đƣợc sử dụng để tìm kiếm vị trí cƣ trú tế bào thơng qua cơng cụ TargetP [7] Trong đ , mức độ tin cậy thuật toán đƣợc xác định theo thang điểm [7] - Phƣơng pháp phân tích in silico mức độ biểu gen điều kiện thƣờng: Mức độ phiên mã gen mã h a TF đƣợc xác định điều kiện thƣờng dựa liệu microarray cơng bố [8] Trong đ , chín mẫu mơ, bao gồm lông rễ thu thời điểm 84 120 h sau nảy mầm (84-, 120-hour-after-sprayed root hair, RH 84 HAS, RH 120 HAS , nốt sần (Nodule, N , mô phân sinh đỉnh chồi (Shoot apical meristem, SAM), hoa (Flower, F , vỏ xanh (Green pod, GP , (Leaf, L , rễ (Root, R , ch p rễ (root tip, RT đƣợc khai thác phân tích [8] Mã định danh gen mã h a TF đƣợc truy vấn liệu microarray để tìm kiếm mức độ biểu gen tƣơng ứng mô điều kiện thƣờng - Phƣơng pháp phân tích in silico mức độ biểu gen điều kiện bất lợi: Mức độ phiên mã gen mã h a TF điều kiện hạn đƣợc khai thác liệu RNA-Seq ghi nhận gần (GSE57252 [9] Trong đ , mẫu rễ xử lý với dung dịch NaCl 100 mM (đối chứng , 1, vá 12 h đƣợc thu thập để phân tích RNA-Seq [9] Mã định danh gen mã h a TF đƣợc truy vấn liệu RNA-Seq để tìm kiếm mức độ biểu gen tƣơng ứng rễ điều kiện xử lý mặn - Phƣơng pháp phân tích mơ hình h a liệu biểu gen: Số liệu thƣờng phân tích b ng đồ nhiệt (heatmap công cụ Microsoft Excel minh họa Adobe Illustrator III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân tích phân bố gốc Met c c họ TF đậu tƣơng Với giả thuyết đặt ra, v ng thƣợng nguồn (upstream region hạ nguồn (downstream region nh m TF đƣợc chọn lọc để xác định mức độ phân bố gốc Met protein Trƣớc tiên, v ng bảo thủ TF đƣợc xác định b ng công cụ MEGA [4] V ng bảo thủ họ TF bHLH giàu Met đậu tƣơng c cấu tạo gồm bốn domain, basic-helix-loop-helix , thành viên họ TF bZIP chia sẻ cấu trúc bảo thủ gồm ba v ng, basic-hinge-leucine zipper (Hình Phân tích trình tự tƣơng đồng cho thấy họ TF SRF c v ng bảo thủ MADS-box (Hình Hình Sự phân bố gốc Met trình tự polypeptide ba nh m TF đậu tƣơng Khảo sát hai v ng ngồi trình tự bảo thủ ba nh m TF cho thấy mật độ dày đặc gốc Met Cụ thể, phần lớn TF thuộc họ bHLH (tám tổng số 11 c v ng thƣợng nguồn hạ nguồn quy tụ nhiều gốc Met (lớn 10 % (Hình Chỉ c TF thuộc họ bZIP, Glyma02g10600, đƣợc xác định c phân bố dày dặc gốc Met hai v ng ngoại biên cận bảo thủ (Hình Trong đ , hai đoạn trình tự ngồi v ng bảo thu hầu hết thành viên họ SRF (sáu bảy đƣợc ghi nhận c mặt nhiều gốc Met (Hình Trƣớc đây, Luo cộng (2009 chứng minh vai tr gốc Met phân tử protein giúp chống lại bất lợi ôxi h a b ng cách thay Met với Norleucine [10] Nhƣ vậy, kết nghiên cứu tìm đƣợc 15 tổng số 21 TF c tập trung nhiều Met quanh v ng bảo thủ, thế, gốc Met c thể giúp phân tử protein đáp ứng lại điều kiện ngoại cảnh bất lợi 3.2 Kết phân tích đặc tính lý hóa nhân tố phi n mã giàu Met đậu tƣơng Đặc tính lý h a phân tử protein đƣợc thể giá trị pI, II GRAVY thơng qua phân tích cổng thơng tin ExPASy Protparam [6] Kết r ng hầu hết TF, ngoại trừ Glyma02g00980 (một thành viên họ TF bHLH c giá trị II lớn 40, cho thấy chúng không ổn định điều kiện kiểm tra ống nghiệm (Bảng Phân tích từ ExPASy Protparam [6] ghi nhận tất TF c số GRAVY nhỏ 0, suy 21 phân tử protein ƣa nƣớc (Bảng Bảng Đặc tính lý h a nh m TF giàu Met đƣợc tìm thấy đậu tƣơng pI II GRAVY BQ TT Tên protein Glyma01g15930 8,88 47,61 -0,55 C5 12 02 Glyma02g00980 9,26 39,46 -0,10 S5 03 Glyma03g04000 9,14 51,91 -0,69 04 Glyma03g32740 7,20 63,57 05 Glyma04g04190 6,84 06 Glyma05g19920 07 Glyma06g04380 08 Glyma10g04890 TF pI II GRAVY BQ Glyma02g01600 5,07 55,40 -0,66 C3 13 Glyma05g28960 5,23 43,56 -0,64 C2 - 14 Glyma08g12170 5,24 44,66 -0,73 C2 -0,51 M3 15 Glyma10g40080 9,76 46,27 -0,47 - 68,89 -0,78 - 16 Glyma11g26260 6,84 55,54 -0,65 - 8,93 52,30 -0,53 - 17 Glyma11g30490 9,26 57,12 -0,44 - 6,63 59,36 -0,72 - 18 Glyma11g30620 9,37 55,52 -0,42 - 5,84 65,40 -0,84 - bZIP 01 TF SRF Tên protein bHLH TT 19 Glyma18g05930 10,0 58,23 -0,64 - 09 Glyma11g17120 8,63 46,28 -0,58 C 20 Glyma18g05960 9,13 59,28 -0,57 - 10 Glyma13g19250 6,03 65,52 -0,82 M4 21 Glyma20g27320 9,79 55,34 -0,44 - 11 Glyma20g22280 5,92 62,84 -0,66 - TT: Thứ tự, T : Nhân tố phiên mã, p : Điểm đ ng điện, : Ch số ất n định, Độ ưa nước, R V : : quan, C: Lục lạp, : ệ thống ao gói, M: Ty thể Tiếp theo, giá trị pI TF dao động từ khoảng 5,07 (tính acid đến 10,00 (tính base (Bảng Trong đ , protein c tính acid c thể phân bố tế bào chất, protein bám màng bào quan thƣờng c tính base [11] Để tăng tính tin cậy vị trí cƣ trú TF tế bào, trình tự amino acid protein đƣợc truy vấn TargetP [7] Kết cho thấy năm TF đƣợc tìm thấy tế bào chất, hai TF c thể cƣ trú ty thể, TF phân bố hệ thống bao g i tế bào (Bảng Trƣớc đ , ty thể đƣợc chứng minh bào quan tích lũy dạng chứa ôxi nguyên tử hoạt động (reactive oxgen species tế bào chịu bất lợi protein cƣ trú hệ thống bao g i c thể đƣợc vận chuyển nội bào để tham gia vào trình sửa chữa tế bào [12] 3.3 Kết phân tích liệu biểu gen mã hóa nhân tố phi n mã giàu Met đậu tƣơng c c điều iện Trong nghiên cứu này, mức độ biểu gen mã h a nh m TF đậu tƣơng đƣợc phân tích in silico dựa liệu phiên mã điều kiện thƣờng [8] xử lý mặn [9] Cụ thể, biểu gen điều kiện thƣờng chín mẫu mơ c thể đƣợc chia làm bốn mức độ, dƣới ngƣỡng phát (fold-change < , biểu (3 ≤ foldchange < 10 , c xu hƣớng biểu mạnh (10 ≤ fold-change < 100 biểu mạnh (fold-change ≥ 100 [8] Trong đ , gen c mức độ phiên mã tăng giảm điều kiện mặn giá trị fold-change ≥ ≤ -2 [9] Kết phân tích in silico mức độ biểu gen mã h a ba nh m TF đƣợc thể Hình Hình Mức độ biểu gen mã h a TF giàu Met quan điều kiện Trong điều kiện thƣờng, phần lớn gen mã h a hai nh m TF bHLH bZIP c xu hƣớng biểu hiển mạnh phận đậu tƣơng, mức độ phiên mã bảy gen mã h a họ TF SRF chín mẫu mơ quan dƣới ngƣỡng phát (Hình Cụ thể, bốn gen, Glyma13g19250, Glyma03g32740, Glyma01g15930 Glyma11g17120 đƣợc xác định biểu mạnh hoa nhƣng không c xu hƣớng biểu mạnh quan dƣới đất, chứng tỏ gen c thể liên quan tham gia cách đặc th vào trình sinh trƣởng phát triển hai phận đậu tƣơng điều kiện thƣờng Đáng ý, Glyma03g32740 Glyma12g19250 c thể phân bố ty thể (Bảng , gen mã h a TF biểu đặc th hoa (Hình , gợi ý r ng chúng c thể liên quan đến trình đáp ứng bất lợi hoa Bên cạnh đ , gen mã h a hai thành viên nh m bZIP biểu đặc th tất phận dƣới mặt đất, Glyma02g01600 c mức độ phiên mã mạnh tất chín mẫu mơ quan (Hình Kết chứng tỏ Glyma02g01600 c thể đ ng vai tr thiết yếu liên quan đến trình sinh trƣởng phát triển điều kiện thƣờng Khi xem xét điều kiện bất lợi, liệu GSE57252 [9] đƣợc khai thác để đánh giá mức độ biểu gen mã h a TF mô rễ xử lý mặn Kết tìm thấy liệu 10 gen, bao gồm sáu gen mã h a TF bHLH, ba gen mã h a TF bZIP gen mã h a TF SRF (Hình Trong đ , năm gen đƣợc xác định c đáp ứng phiên mã tăng mạnh rễ xử lý mặn (fold-change ≥ (Hình Đặc biệt, gen mã h a TF bZIP đƣợc tăng cƣờng biểu rễ điều kiện thƣờng xử lý mặn (Hình , chứng tỏ gen c thể tham gia vào trình đáp ứng bất lợi rễ Bên cạnh đ , gen mã h a cho thành viên thuộc họ TF SRF, Glyma11g26260, c biểu tăng rễ xử lý mặn (Hình Trƣớc đ , xem xét liệu phiên mã xử lý đậu tƣơng V6 R2 điều kiện hạn, Chu et al (2016 ba gen c đáp ứng [3] Cụ thể, hai gen Glyma01g15930 Glyma03g32740 bị giảm biểu hiện, Glyma20g22280 c mức độ phiên mã tăng mẫu V6 R2 xử lý hạn [3] Những kết ph hợp với nhận định vai tr gen Glyma03g32740 đáp ứng bất lợi IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã xác định đƣợc 15 tổng số 21 protein thuộc ba họ TF c tập trung nhiều Met quanh v ng bảo thủ, đặt giả thuyết vai tr gốc Met việc giúp phân tử protein đáp ứng lại điều kiện ngoại cảnh bất lợi - Phân tích đặc tính lý h a cho thấy TF giàu Met ƣa nƣớc, hầu hết không ổn định điều kiện in vitro Các TF c thể cƣ trú tế bào chất, ty thể hệ thống bao g i tế bào - Phân tích in silico liệu phiên mã cho thấy hầu hết gen mã h a họ TF bHLH bZIP c xu hƣớng biểu hiển mạnh phận chính, họ TF SRF hoạt động yếu điều kiện thƣờng Trong điều kiện mặn, số thành viên họ TF bHLH SRF c đáp ứng rễ, tất gen mã h a TF bZIP đƣợc tăng cƣờng biểu rễ xử lý mặn 4.2 Đề nghị - Nghiên cứu s tiếp tục đƣợc thực nh m kiểm chứng b ng thực nghiệm phân tích tin sinh học mức độ đáp ứng gen mã h a TF điều kiện bất lợi đậu tƣơng LỜI CẢM ƠN: Nghiên cứu đƣợc thực từ kinh phí đề tài nghiên cứu mã số 08/HĐƢT-KHCN Đại học Sƣ phạm Hà Nội tài trợ TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] G Kim, S.J Weiss, R.L Levine (2014), "Methionine oxidation and reduction in proteins", Biochim Biophys Acta, 1840(2): 901-905 [2] J.T Brosnan, M.E Brosnan (2006), "The sulfur-containing amino acids: an overview", J Nut, 136(6 Suppl): 1636s-1640s [3] H.D Chu, Q.N Le, H.Q Nguyen, D.T Le (2016), "Genome-wide analysis of genes encoding methionine-rich proteins in Arabidopsis and soybean suggesting their roles in the adaptation of plants to abiotic stress", Int J Genomics, 2016: e5427062 [4] S Kumar, G Stecher, K Tamura (2016), "MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets", Mol Biol Evol, 33(7): 1870-1874 [5] T.A Hall (1999), "BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT", Nucleic Acids Symp Ser, 41: 95-98 [6] E Gasteiger, A Gattiker, C Hoogland, I Ivanyi, R.D Appel, A Bairoch (2003), "ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res, 31(13): 3784-3788 [7] Emanuelsson, S Brunak, G von Heijne, H Nielsen (2007), "Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools", Nat Protoc, 2(4): 953-971 [8] M Libault, A Farmer, T Joshi, K Takahashi, R.J Langley, L.D Franklin, J He, D Xu, G May, G Stacey (2010), "An integrated transcriptome atlas of the crop model Glycine max, and its use in comparative analyses in plants", Plant J, 63(1): 86-99 [9] V Belamkar, N.T Weeks, A.K Bharti, A.D Farmer, M.A Graham, S.B Cannon (2014), "Comprehensive characterization and RNA-Seq profiling of the HD-Zip transcription factor family in soybean (Glycine max) during dehydration and salt stress", BMC Genomics, 15(1): 1-25 [10] S Luo, R.L Levine (2009), "Methionine in proteins defends against oxidative stress", FASEB J, 23(2): 464-472 [11] J Kiraga, P Mackiewicz, D Mackiewicz, M Kowalczuk, P Biecek, N Polak, K Smolarczyk, M.R Dudek, S Cebrat (2007), "The relationships between the isoelectric point and: length of proteins, taxonomy and ecology of organisms", BMC Genomics, 8: 163 [12] D.M Rhoads, C.C Subbaiah (2007), "Mitochondrial retrograde regulation in plants", Mitochondrion, 7(3): 177-194 ANALYSIS OF THE ROLE OF METHIONINE RESIDUES IN THE TRANSCRIPTION FACTOR FAMILIES IN SOYBEAN (Glycine max) Chu Duc Ha1, La Viet Hong2, Le Minh Tuan1,2, Pham Phuong Thu2, Pham Thi Ly Thu1 Agricultural Genetics Institute, VAAS Faculty of Biology - Agricultural technology, Hanoi Pedagogical University SUMMARY Methionine (Met) is considered as an important amino acid residue in the plant The structural Met residues were hypothesized to protect the structure of protein against the oxidative stress in the cell In this study, 21 Met-rich proteins, belonging to three transcription factor (TF) families, namely 'Basic helix-loophelix' (bHLH), 'Basic leucine zipper' (bZIP) and 'Serum response factor' (SRF), were analyzed to demonstrate this hypothesis As the result, the high accumulation of Met residues has been recorded in the upstream and downstream regions close to the conserved domains of 15 MRPs By using various bioinformatics tools, we found that these TFs were hydrophilic and mostly unstable in the test tube Interestingly, several TFs might localize on the cytosol, mitochondrial or the secretory pathways According to the public microarray database, the majority of genes encoding TF bHLH and bZIP was up-regulated in at least one major organ in soybean plant in the normal condition By retrieving the previous RNA-Seq database, several genes encoding TF bHLH and SRF were significantly altered, while all genes encoding TF bZIP were also induced in root under the high salt stress In the further study, the expression levels of genes encoding 21 MRPs under various adverse environmental conditions would be validated by the experimental approach Keywords: Stress, soybean, Methionine, transcription factor, bioinformatics