Bg thuc hanh ky sinh trung phan 2 718

Bài KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM KÝ SINH TRÙNG Mục tiêu Mơ tả quy trình xét nghiệm phân Làm tiêu phân phương pháp trực tiếp Phát sai lầm thao tác xét nghiệm phân trực tiếp Khái quát Trong phòng xét nghiệm, nhận bệnh phẩm, phân tươi khơng có chất bảo quản, cần quan sát mắt (đại thể) trước để có nhận xét sơ mẫu phân, ghi nhận đặc tính mẫu phân, phân loại bệnh phẩm xét nghiệm: mẫu phân lỏng, có chất nhày, máu phải xét nghiệm Khơng nên để phân ngồi trời, khơng có nắp đậy; không nên để lọ phân phiếu xét nghiệm để dồn mẫu vào cuối buổi xét nghiệm Đối với phân bảo quản dung dịch cố định quan sát đại thể khơng thực Để phát KST cần phải dùng kính hiển vi để quan sát (vi thể) 1.1 Quan sát đại thể Quan sát đại thể (bằng mắt kính lúp) để ghi nhận trạng thái, màu sắc chất lạ, tìm kiếm xác định loại giun, sán thải theo phân 1.1.1 Trạng thái phân Phân trạng thái: Cứng rắn (khó đâm thủng) Cứng (đâm thủng được) Mềm (cắt được) Nhão (có thể bị biến dạng) Lỏng Lỏng nước 1.1.2 Màu sắc Thay đổi từ đen, nâu đậm, nâu, nâu nhạt, vàng, xanh, màu đất sét hay đỏ, trắng 44 1.1.3 Các chất lạ Chất nhày: thường đục, kết thành sợi, hình dáng giống ký sinh tùng Chất xem xét cẩn thận để tìm đơn bào, trứng Schistosoma Mơ liên kết: màu trắng xà cừ Xem kính hiển vi sau làm với acid acetic thấy sợi dài Máu: cần ghi nhận diện máu tươi tiêu hóa làm phân có màu đen Mũ: gồm có nhiều bạch cầu biến dạng Các cặn bã thực vật chưa tiêu hóa, thường hình thức sợi 1.2 Quan sát vi thể Quan sát vi thể thực với kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp, tập trung KST phân, kỹ thuật chuyên biệt, cấy nhuộm cố định Kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp Kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp sử dụng phân hòa tan nước muối cho phép phát di động thể hoạt đơn đơn bào, trứng giun, sán, ấu trùng giun vật thể bất thường phân (hồng cầu, bạch cầu,…) Ưu điểm: Đơn giản Cho kết nhanh chóng xác Khơng địi hỏi dụng cụ, hóa chất đắt tiền Nhược điểm: Độ nhạy thấp 2.1 Dụng cụ Kính hiển vi Lam kính, kính Viết chì sáp Khăn vải Bình đựng dung dịch sát trùng Kẹp 2.2 Hóa chất NaCl 0.85% Lugol 1% 45 Dung dịch sát trùng 2.3 Quy trình làm tiêu phân Lấy lam kính sạch, khơ Dùng viết chì chia lam kính làm phần Ghi tên bệnh nhân vào nhỏ đầu lam kính Nhỏ lên lam kính giọt NaCl 0.85% vào giữa, giọt Lugol ô cuối Dùng que gỗ lấy phân đầu que diêm, hịa tan phân vào giọt NaCl 0.85% Lấy phân lần thứ hai hòa tan phân vào giọt Lugol Bỏ que gỗ vào dung dịch sát trùng Đậy kính lên giọt phân Khảo sát tiêu kính hiển vi 46 2.4 Tiêu chuẩn tiêu tốt Không dày: phân nhiều làm tiêu đục tối, che lấp KST, khó phát Khơng q mỏng: phân q khơng tìm thấy KST, trừ chúng nhiều Tiêu có độ dày vừa phải thấy chữ in tờ bào đặt tiêu Tiêu khơng có bọt khí, dung dịch phân tràn quanh kính 2.5 Khảo sát tiêu kính hiển vi Khảo sát tiêu phân vật kính x10, muốn nhìn rõ chi tiết chuyển sang vật kính x40 Khảo sát mẫu phân theo hình zic zac để khơng bỏ sót vi trường Lưu ý: Nên để ánh sáng vừa phải Mẫu phân xét nghiệm sớm tốt, để lâu KST chết thay đổi hình dạng, khó xác định Mẫu phân tìm trứng giun, sán: khơng để q 10 Mẫu phân tìm đơn bào: khơng để q 2.6 Những sai lầm nên tránh Phết phân không đều, chỗ dày, chỗ mỏng Nếu phết phân loãng đặc quá, nên bỏ đi, làm lại phết phân khác Đậy kính làm tiêu có bọt khí Dung dịch phân tràn xung quanh kính Quên khơng đặt kính kên phết phân phết phân chóng khơ, vật kính bị bẩn màu nhuộm nhạt nhanh Dùng nước thường để hòa tan phân thay dùng dung dịch NaCl 0.85%, nước thường làm biến dạng hay hủy hoại thể hoạt động đơn bào Dùng nhiều ánh sáng Nên để tụ kính gần với bàn kính Giảm ánh sáng cách đóng bớt màng chắn sáng hay dùng kính lọc màu xanh da trời lấy ánh sáng 47 2.7 Cách trả lời kết xét nghiệm phân Trên phiếu trả lời kết xét nghiệm phân, phải ghi nội dung sau: Đặc tính phân: phân cứng, mềm, nhão, có khn, lỏng,… Màu sắc phân: vàng, xanh, nâu, đen,… Các yếu tố bắt thường thấy mắt: chất nhày, máu, đốt sán,… Kết quả: Âm tính: tìm không thấy trứng bào nang KST đường ruột Dương tính viết chi tiết sau: Tên tiếng việt tên khoa học KST Trứng, thể hoạt động, bào nang, ấu trùng Mật dộ nhiễm tiêu bản: Ít: (+) Vừa: (++) từ – trứng/tiêu từ – trứng/tiêu Nhiều: (+++), (++++) > trứng/tiêu Ví dụ: tìm thấy trứng giun đũa (Ascaris lumbricoides): (+) 2.8 Cách xử lý dụng cụ dùng bệnh phẩm 2.8.1 Bệnh phẩm que xét nghiệm Sau xét nghiệm xong, cho lọ đựng phân que xét nghiệm vào dung dịch sát trùng hấp tiệt trùng trước bỏ Nếu khơng có lị hấp, nấu sơi 30 phút chơn vào hố sâu 2.8.2 Dụng cụ Lam kính: cho vào dung dịch sát trùng, hấp khử trùng, rửa nước thường cho sạch, ngâm xà bông, rửa sạch, ngâm dung dịch acid sulfochromic 24 Rửa lại nước thường, tráng lại nước cất, sấy khơ Lá kính: rửa tương tự lam kính sấy khơ 600C Kỹ thuật nhuộm Ziehl-Neelsen cải tiến 3.1 Mô tả Các trùng bào tử đường ruột (Cryptosporidium, Cyclospora…) khó xác định cách soi phân trực tiếp Vì vậy, người ta dùng phương pháp nhuộm để tạo tương phản màu KST cặn bã phân Kỹ thuật nhuôm Ziehl-Neelsen cải tiến dùng dựa đặc điểm kháng acid KST Nguyên tắc kỹ thuật nhuộm tiêu phân 48 carbon fuchsin sau tẩy màu nhuộm tiêu màu xanh Do có tính kháng acid nên trùng bào tử giữ lại màu hồng fuschin Kỹ thuật nhuộm Ziel-Neelsen cải tiến áp dụng cho phân tươi, phân cố định formol, loại bệnh phẩm khác dịch hút tá tràng, mật, đàm 3.2 Dụng cụ Kính hiển vi Lam kính Giá đựng lam kính Que tăm bơng Găng tay 3.3 Hóa chất Methanol Carbon-fuchsin Acid chlorhydric Cồn ethylic 950 Xanh malachit 1% xanh methylen 1% 3.3.1 Pha carbon fuchsin Dung dịch A: Fuchsin 0.3g Cồn ethylic 950 10ml Dung dịch B: Phenol tinh thể Nước cất 5g 100ml Trộn 10ml dung dịch A với 90ml B lại với Bảo quản năm nhiệt độ phòng 3.3.2 Pha dung dịch xanh malachit Xanh malachit Nước cất 1g 100ml Có thể thay xanh malachit xanh methylen Bảo quản năm nhiệt độ phịng 3.4 Quy trình nhuộm 49 Làm phết phân mỏng lam kính Để khơ ngồi khơng khí Cố định methanol phút Để khơ ngồi khơng khí Nhuộm với carbon-fuchsin phút Rửa lam kính với nước Tẩy màu cồn – acid chlorhydric màu khơng trơi nửa Rửa vịi nước chảy Nhuộm tiêu với 1% xanh malachit 30 giây Rửa tiêu vịi nước Để cho khơ Quan sát tiêu với vật kính X40: trứng nang Cryptosporidium có màu hồng nhạt đến màu đỏ, kích thước - 6μm, bên nang thấy thoa trùng 3.5 Các vấn đề thường gặp Nếu làm phết phân q dày, thuốc nhuộm khơng ngắm vào tất KST, làm sai lệch kết Khi tẩy màu, tẩy kỹ (thời gian tẩy kéo dài nồng độ acid đậm) làm cho KST khơng cịn bắt màu sau nhuộm Nếu nhiễm nhẹ, khơng tìm thấy KST Nên xét nghiệm lần, lần cách vài ngày để khơng bỏ sót ca bệnh 50 Bài HÌNH THỂ GIUN Mục tiêu Mơ tả đặc điểm hình thể chung giun trưởng thành trứng giun Nêu cấu tạo giun trưởng thành trứng giun Nhận dạng loại giun ký sinh trứng giun thường gặp người Căn định loại Dựa vào đặc điểm: hình dạng, kích thước, cấu tạo Đặc điểm lớp giun Giun có hình ống, tròn, dài từ vài mm đến vài chục cm, đối xứng hai bên Thường có màu trắng đục, có ống tiêu hóa trọn vẹn Thân giun bao bọc bên lớp vỏ hyaline Dưới lớp vỏ biểu mô lớp dọc Lớp biểu mô nhơ vào phía tạo thành gờ dọc thể: gờ lưng, gờ bụng gờ bên Gờ lưng bụng mang dây thần kinh, gờ bên mang ống tiết Ở phần đầu có miệng với phận móc, răng, dao, gai Xoang miệng có dạng ống biến đổi thành phận để hút tùy theo loại Thực quản hình ống, đơi phình phần cuối, đặc điểm để định danh vài trường hợp Ruột ống dẹp nối thẳng từ thực quản đến hậu môn Hệ tiết gồm ống chạy dọc theo hai bên thân ống nối ngang phía gần đầu, đổ ngồi lỗ tiết khoảng thực quản Hệ thần kinh gồm vòng nối hạch thần kinh quanh thực quản Từ vòng này, sợi thần kinh phía trước sợi thần kinh chạy phía sau Có giới riêng biệt Con đực nhỏ cái, đuôi cuộn lại hay xịe túi hình chng Con có thẳng Cơ quan sinh dục đực nằm 1/3 sau thể, ống đơn hình chóp ống xoắn cuộn gồm tinh hồn, ống dẫn tinh, túi chứa tinh, ống phóng tinh, tận quan giao hợp có dạng cánh dạng túi 51 Cơ quan sinh dục cấu trúc đơn đôi gồm buồng trứng, ống dẫn trứng, túi nhận tinh, tử cung, âm đạo âm mơn mở ngồi lỗ sinh dục nửa thân trên, phía bụng Giun hình ống khơng có hệ hơ hấp hệ tuần hồn Giun đũa – Ascaris lumbricoide 3.1 Giun đũa trưởng thành Thân hình ống, đặn, thon đầu, có vỏ bọc ngồi dày, cứng, có vân ngang Có màu trắng hồng nâu nhạt Đầu giun thuôn nhỏ, co môi xếp cân đối (1 môi lưng môi bụng) Giun đực dài 15 – 17cm, đường kính 0.3 – 0.4 cm, đuôi cong, lỗ hậu môn mặt bụng, gần cuối thân, có gai giao hợp 52 Giun dài 20 – 25 cm, đường kính trung bình 0.5 – 0.6 cm, thẳng, hình nón Lỗ sinh dục nằm khoảng 1/3 trước thân mặt bụng 3.2 Trứng giun đũa Trứng giun đũa có loại: a Trứng thụ tinh (trứng chắc) Có hình bầu dục trịn, cân đối Kích thước khoảng 45 - 75μm x 35 - 50μm Màu vàng Vỏ dày, gồm lớp đồng tâm: Ngoài lớp albumin dày đều, xù xì Lớp dày, nhẵn suốt cấu tạo glycogen Và lớp vỏ màng dinh dưỡng cấu tạo lipid Bên trứng phôi bào chắc, gọn thành khối, chưa phân chia trứng đẻ 53 m Balantidium coli Thân hình bầu dục có lơng tơ bao quanh Kích thước: 50 – 100 μm Có chỗ lõm đầu, gọi miệng, có lơng tơ dài Hậu mơn nằm đối diện với miệng TBC lấm hạt Có nhân to hình hạt đậu, nhân nhỏ hình trịn nằm cạnh chỗ lõm nhân to Nhiều khơng bào tiêu hóa tiết Chuyển động nhan Thể bào nang Bào nang thể có tính đề kháng với yếu tố bất lợi môi trường thể lây nhiễm đơn bào thuộc lớp chân giả, trùng roi trùng lông Thể bào nang thường trịn, có kích thước nhỏ, bất động, chứa hay nhiều nhân Thể bào nang đơn bào đường ruột định danh nhờ đặc điểm sau: Hình thể, kích thước, quan TBC, nhân, màng nhân (thể nhiễm sắc), nhân thể 90 3.1 Entamoeba histolytica Hình trịn, chiết quang Vỏ dày gồm lớp Kích thước: loại lớn 10 - 15 μm loại nhỏ 01 μm Có từ – nhân Có hạt nhiễm sắc nhỏ phân bố đặn màng nhân Bào nang trẻ (1 – nhân) có nhiều cấu hình que có đầu trịn, chiết quang gọi thỏi chromatoid, đơi có khơng bào to Bào nang có nhân: khơng bào thể chromatoid biến 3.2 Entamoeba hartmani Hình trịn, đơi bầu dục Kích thước: - μm Cơ từ – nhân Vách dày 91 3.3 Entomoeba coli Hình trịn bầu dục Kích thước: 12 - 25 μm Có – nhân (thường gặp nhân) Nhân hình trịn Có hạt nhiễm sắc thô phân bố không màng nhân Nhân thể giống vết nhòe, lệch bên Có cấu hình que, mảnh, dài, có đầu nhọn, gọi thỏi chromatoid Đơi có khơng bào to, thường gặp bào nang trẻ (1 -2 nhân) Bào nang trẻ (1 – nhân) có nhiều cấu hình que có đầu nhọn, chiết quang gọi thỏi chromatoid, đơi có khơng bào to Những cấu thu nhỏ lại biến bào nang phát triển đến giai đoạn già 3.4 Endolimax nana Hình bầu dục Kích thước: - 12 μm Vách mỏng, TBC Có nhân trơng vệt nhịe, khơng rõ Nhân thể lớn, bao bọc quầng sáng 92 3.5 Iodamoeba butschlii Hình trịn bầu dục Kích thước: - 15 μm Vách dày TBC chiết quang Có khơng bào chứa glycogen Nhân chứa nhân thể nằm lệch tâm Nhân thể tròn, bầu dục, lớn, bao bọc quầng sáng 3.6 Giardia lamblia Hình bầu dục Kích thước: - 13 μm Có trục sống thân bào nang Có từ – nhân có vài roi xếp lại giống hình S bào nang 3.7 Chilomastix meslini 93 Có hình lê, chiết quang Kích thước: - 10 μm Vách dày Có nhân, to, bị đẩy bên Trong bào nang có vết dọc 3.8 Enteromonas hominis Kích thước: - μm Có – nhân, ghép thành đơi cực 3.9 Retortomonas intestinalis Hình lê, nhỏ bào nang ký sinh người Kích thước: - μm Không màu Vách dày Không thấy rõ cấu bên vách 94 3.10 Balantidium coli Hình trịn trứng Kích thước: 50 - 80 μm Vách dày có lớp Có nhân lớn Nhiều không bào nhiều thể chiết quang Trứng nang 4.1 Cryptosporidium sp Trứng nang có hình cầu Đường kính: - μm Vách mỏng TBC có hạt mịn, với đốm đen ở góc Có thoa trùng hình liềm hay ngón tay Có thể nhìn thấy nhân thoa trùng 4.2 Isospora belli Trứng nang có hình xoan, dài, có đầu nhọn đầu Kích thước: 25 – 33 x 12 - 16 μm Vỏ nhẵn, bên có bào tử nguyên bào Sau ngoại cảnh, bào tử nguyên bào phát triển lên thành bào tử nang, bào tử nang có thoa trùng 95 4.3 Sarcocystis sp Bào tử nang có hình trứng, chiết quang Kích thước: 14 – 15 x - 10 μm Có thoa trùng có dạng hình liềm 4.4 Cyclospora sp Hình cầu Đường kính: - 10 μm Vỏ có lớp màng: màng ngồi dày Bên có hạt chiết quang nỗi lên trông giống trái dâu Điều kiện cần thiết tìm bào nang Các thể hoạt động chóng bị thối hóa nên việc định danh đơn bào ký sinh 96 ruột phần nhiều nhờ tiềm thấy bòa nang Khác với thể hoạt động cần phải xem ngay, mẫu phân nghi bào nang giữ lại nhiệt độ thường tủ lạnh để bào nang có đủ thời gian để nảy nở đủ độ - trường hợp nghi ngơ, nên để dành mẫu phân tủ lạnh, 24h sau xem lại Bào nang chưa nở đủ độ: + Rất khó xác định + Nhân giống nhân thể hoạt động bào nang loại + Khác với bào nang nảy nở đủ độ:  Số nhân nhân to  Khơng bào có glycogen nhuộm màu nâu sẫm nhiều hay với iod Những vật sau lầm với bào nang: + Hạt mỡ: kích thước khơng đều, nhuộm thuốc nhuộm đặc biệt + Tinh bột: nhuộm màu tím với iod + Bạch cầu: nhuộm iod, cấu tạo nhân không thấy rõ 97 BÀI HÌNH ẢNH VI NẤM Mục tiêu Nhận dạng vi nấm da Nhận diện vi nấm ngoại biên Nhận diện vi nấm Candida Nhận diện vi nấm Aspergillus Nhận diện vi nấm hoại sinh A Vi nấm da Mầm bệnh: nấm sợi 1.1 Microsporum Có khoảng 15 loại: Microsporum canis, M audouinii, M gypseum, M ferrigineu,… 1.2 Epidermophyton Chỉ có loại : Epidermophyton floccosum 1.3 Trichophyton Có khoảng 21 loại: Trichophyton rubrum, T mentagrophytes, T concentrium, T violaceum, T tonsurans, T verrucosum, … Bệnh phẩm Da: cạo da phần ngoại vi sang thương Móng: cạo phần lùi xùi bơng cải móng Tóc: chọn sợi tóc xốp, màu, dễgãy sợi tóc phát huỳnh quang ánh sáng đèn Wood Khảo sát trực tiếp Bệnh phẩm dầm vào KOH 20%, khảo sát kính hiển vi 3.1 Mẫu da, móng: Trên tế bào biểu bì da móng có sợi tơnấm phân nhánh, phân vách, sợi tơ nấm đứt thành đoạn ngắn 98 99 a Nhóm phát nội ngoại Kiểu Microsporum: bao quanh sợi tóc lớp nhiều bào tử trịn đường kính khoảng µm, xếp đặn, bên sợi tóc sợi nấm Kiểu giống Microsporum: bao quanh sợi tóc bào tử đường kính 3-4 µm, xếp khơng đều, đơi rời rạc thành chuỗi, bên sợi tóc có sợi tơ nấm Kiểu Microsporum bào tử lớn: giống kiểu Microsporum bào tử lớn đường kính 5-6 µm b Nhóm phát nội Kiểu phát nội: bên sợi tóc chứa đầy bào tử trịn, đường kính 3-4 µm Kiểu lõm chén: bên sợi tóc có sợi tơ nấm đứt thành đoạn ngắn, hơ nóng bên sợi tóc có nhiều bọt khí B Vi nấm ngoại biên Lang ben 100 Tên mầm bệnh : Pityrosporum orbiculare 1.1 Bệnh phẩm Chiếu đèn Wood, vùng da có vi nấm phát huỳnh quang màu vàng nhạt Cạo vẩy da cho rớt vào hộp Petri, lam kính, giấy trắng khơ, Có thể dùng băng keo dán lên vùng da lang ben dạng vẩy 1.2 Khảo sát trực tiếp Vẩy da dấm vào KOH 20% Băng keo dán lên lam Làm phết ướt với dung dịch KOH 20% quan sát KHV, ta thấy nấm thành đám nhỏ gồm có sợi tơ nấm tế bào hạt men Sợi tơ nấm ngắn cong, đường kính khoảng µm, phân nhánh thành hình chữ S, V hay Y; tế bào hạt men trịn đường kính 3-8 µm xếp thành đám 10-30 tế bào Trứng tóc đen Tên mầm bệnh: Piedraia hortai 2.1 Bệnh phẩm Nhổ sợi tóc có hạt đen nhỏ cứng bám chặt lên sợi tóc 2.2 Khảo sát trực tiếp Làm phết ướt: cắt tóc thành đoạn ngắn 1-1.5 cm, dầm vào KOH 20%, đem khảo sát kinh hiển vi thấy hạt nhỏ cấu tạo sợi tơ nấm mà nâu đướng kính 4-8 µm, vách dày, vách ngăn gần Các sợi nấm liên kết với thành bao, bên túi trịn, đường kính 30-60 µm, bên túi trịn có chứa 2-8 bào tử túi hình chuối, dài 13-31, đầu có sợi dây nhỏ (roi) 101 Mầm bệnh Có 8-9 loại Candida có khả gây bệnh 95% trường hợp Candida albicans Bệnh phẩm 102 Rất đa dạng, tùy theo dạng bệnh mà ta có bệnh phẩm khác nhau: mảng trắng miệng, đàm, da, móng, dịch âm đạo, nước tiểu, phân, máu, sinh thiết quan Bệnh phẩm lấy xong phải gửi đến phòng xét nghiệm vòng 24 Khảo sát trực tiếp Dịch âm đạo, mảng trắng miệng, đàm, cặn lắng nước tiểu,… khảo sát với NaCl 0.85% làm phết lam nhuộm Gram Da, móng, sinh thiết khảo sát với KOH 20% Các mẫu sinh thiết: sau lấy bỏ vào dung dịch cố định Khi khảo sát loại bệnh phẩm KHV thấy nhiều tế bào hạt men sợi tơ nấm giả 103 Mầm bệnh: Do loại vi nấm Aspergillus sp: A fumigatus, A nidulans, A flavus, A niger, A terreus Bệnh phẩm Tùy thể bệnh ta có nhiều dạng bệnh phẩm: đàm, giác mạc, da tai, mủ tai, sinh thiết phổi sinh thiết quan… Khảo sát trực tiếp Đàm: nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, soi tươi với KOH 20% Mủ: soi tươi với NaCl 0.85%, nhuộm Gram Giác mạc: soi tươi với NaCl 0.85% Da tai: soi tươi với KOH 20% Sinh thiết quan: xử lý theo phương pháp mô học nhuộm Hematoxyline Eosin (HE), Perodic Acid Schiff (PAS) Gomori Trên tất loại bệnh phẩm thấy có nhiều sợi tơ nấm đường kính 4-5 µm, phân nhánh, phân vách, phân nhánh, nhánh phụ tạo với nhánh góc 45 0, đơi thấy đầu bào dài bào tử 104