Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu đặc điểm và hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật liên kết với rong sụn Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa, định hướng sử dụng trong y dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ………………………………… NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ………………………………… NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Ở VÙNG BIỂN NHA TRANG, KHÁNH HÒA, ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG TRONG Y DƯỢC HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Lê Mai Hương PGS TS Phan Văn Kiệm Hà Nội - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học GS.TS Lê Mai Hương PGS.TS Phan Văn Kiệm Các số liệu kết thu luận án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án ii LỜI CẢM ƠN Lời Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc trân trọng đến GS.TS Lê Mai Hương Viện hóa học hợp chất Thiên nhiên PGS.TS Phan Văn Kiệm Viện Hóa sinh biển- người Thầy ln tận tình giúp đỡ, hướng dẫn khoa học định hướng nghiên cứu suốt trình tơi thực hồn thành luận án Luận án hồn thành Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, với hỗ trợ kinh phí đề tài NĐT11.GER/16 Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện hóa học Hợp chất Thiên nhiên, đồng nghiệp anh chị phòng sinh học thực nghiệm ủng hộ tạo điều kiện thuận lợi để em tập trung nghiên cứu hoàn thành luận án Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học Công nghệ Thầy, Cô anh, chị chuyên viên Học Viện tận tình hướng dẫn giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em thời gian học tập nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học giảng dạy, cung cấp kiến thức để em hoàn thành học phần chuyên đề chương trình đào tạo Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè ln quan tâm, hỗ trợ động viên suốt thời gian qua để em hồn thành tốt nhiệm vụ học tập công tác chuyên môn Em xin trân trọng cảm ơn! Nghiên cứu sinh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan rong biển giới 1.2 Tình hình rong biển Việt nam 1.3 Giới thiệu Rong Sụn 2.1 Vi sinh vật biển cộng sinh chất có hoạt tính sinh học 2.2 Vi sinh vật cộng sinh với rong 10 2.3 Khoa học metagenomics nghiên cứu khu hệ VSV liên kết 13 2.4 Sự đa dạng vi sinh vật cộng sinh với rong biển .18 2.5 Các chất có hoạt tính từ vi sinh vật liên kết với rong biển 22 2.5.1 Các chất có hoạt tính từ vi khuẩn cộng sinh rong 22 2.5.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm cộng sinh rong 27 2.6 Tiềm triển vọng từ vi sinh vật liên kết với rong 32 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .35 Vật liệu môi trường nghiên cứu 35 2.1.1 Thu thập mẫu, chủng vi sinh vật kiểm định dòng tế bào 35 2.1.2 Môi trường nghiên cứu .35 2.1.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu .36 2.2 Phương pháp nghiên cứu 37 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 37 2.2.2 Phân lập vi khuẩn nấm liên kết với rong biển 37 2.2.3 Định danh chủng vi khuẩn vi nấm tiêu biểu 38 2.2.3.1 Định danh chủng vi khuẩn dựa vào trình tự gen 16S rARN 38 2.2.3.2 Định danh chủng nấm dựa vào trình tự gen vùng ITS/28S rDNA 39 2.2.4 Phân tích đa dạng vi khuẩn vi nấm 40 2.2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 40 2.2.4.2 Phân tích meta(taxo)genomic quần thể vi khuẩn 40 2.2.4.3 Phân tích meta(taxo)genomic quần thể Nấm 41 2.2.5 Hoạt tính đối kháng VSVKĐ chủng vi khuẩn nấm phân lập 42 2.2.6 Lên men, thu nhận cao chiết dịch lên men từ chủng lựa chọn 43 iv 2.2.6.1 Thử hoạt tính đối kháng vi sinh vật phiến vi lượng 96 giếng 43 2.2.6.2 Hoạt tính gây độc tế bào 45 2.2.6.3 Hoạt tính chống oxy hố 47 2.2.7 Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng Aspergillus micronesiensis .48 2.2.7.1 Khảo sát động học thời gian lên men 48 2.2.7.2 Khảo sát động học nồng độ muối 49 2.2.7.3 Khảo sát động học pH môi trường 49 2.2.8 Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa q trình lên men 50 2.2.9 Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất hữu 51 2.2.9.1 Phương pháp phân lập hợp chất 51 2.2.9.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 52 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .54 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn vi nấm 54 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn 54 3.1.2 Phân lập chủng vi nấm 55 3.2 Sàng lọc hoạt tính đối kháng VSV chủng phân lập 56 3.2.1 Hoạt tính đối kháng VSV chủng vi khuẩn .56 3.2.2 Hoạt tính đối kháng VSVKĐ chủng vi nấm 58 3.2.3 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn vi nấm tuyển chọn 61 3.2.3.1 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 61 3.2.3.2 Hình thái chủng vi nấm lựa chọn 64 3.2.4 Phân loại chủng vi khuẩn vi nấm lựa chọn dựa kỹ thuật sinh học phân tử 65 3.2.5 Đánh giá đa dạng cấu trúc quần thể vi sinh vật rong sụn Kappaphycus alvarezii .68 3.2.5.1 Quần thể vi khuẩn 68 3.2.5.2 Quần thể nấm 72 3.2.6 Hoạt tính sinh học từ cặn chiết thơ chủng 75 3.2.6.1 Hoạt tính đối kháng VSV cặn chiết ethylacetate 75 3.2.6.2 Hoạt tính chống oxy hóa của cặn chiết ethylacetate 80 3.2.6.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cặn chiết ethylaxetat 81 3.2.7 Nghiên cứu điều kiện nuôi tối ưu cho hoạt tính kháng VSVKĐ chủng vi nấm Aspergillus micronesiensis 84 3.2.7.1 Ảnh hưởng thời gian lên men 85 3.2.7.2 Ảnh hưởng nồng độ muối 86 v 3.2.7.3 Ảnh hưởng pH môi trường 87 3.2.8 Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa trình lên men 88 3.2.8.1 Phần thực nghiệm: 88 3.2.8.2 Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm 88 3.2.8.3 Xây dựng mơ hình kế hoạch thực nghiệm tối ưu hóa quy trình 89 3.2.8.4 Tối ưu hóa thơng số cơng nghệ q trình 92 3.3 Phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis 94 3.3.1 Phân tách hợp chất từ chủng Aspergillus micronesiensis .94 3.3.2 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân tách từ chủng Aspergillus micronesiensis VPN1.11 96 3.3.2.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) 96 3.3.2.2 Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) 96 3.3.2.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới) 96 Epicoccone B (5,6,7-trihydroxy-4-methyl-1(3H)isobenzofuranone) 97 epicoccolides B 97 epicoccolide A 97 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ chủng Aspergillus micronesiensis 98 3.4.1 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới) 98 3.4.2 Hợp chất AM8B1: Aspersiensis B (hợp chất mới) .104 3.4.3 Hợp chất AM8B2: Aspersiensis C (hợp chất mới) 110 3.4.4 Hợp chất AM3A1: 4-hydroxybenzaldehyde 117 3.4.5 Hợp chất AM3D: (22E,24R)-5α,8α-epidioxy-24-methyl-cholesta-6,22-dien3β-ol) 118 3.4.6 Hợp chất AM4F1: 2-O-methylbutyrolactone II 122 3.4.7 Hợp chất AM6E1: 1,3-dihydro-4,5,6-trihydroxy-7 methylisobenzofuran .124 3.4.9 Hợp chất AM7H: epicoccolides B 127 3.4.10 Hợp chất AM8D: epicoccolide A .129 3.5.1 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất 132 3.5.2 Kết xác định hoạt tính chống oxi hóa hợp chất 136 3.5.3 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 138 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 141 KẾT LUẬN 141 KIẾN NGHỊ 143 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 144 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh VSVKĐ RYE Diễn giải Vi sinh vật kiểm định Rice yeast extract medium Môi trường gạo dịch chiết nấm men ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic ITS Internal transcribed spacer Vùng phiên mã nội ATCC American Type Culture Bảo tàng giống chuẩn Hoa Collection Kỳ CFU MIC Colony forming units Minimum inhibitory concentration Đơn vị hình thành khuẩn lạc Nồng độ ức chế tối thiểu rDNA Ribosomal DNA AND ribosom CC Chromatography column Sắc ký cột thường COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 13 13C-Nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance spectroscopy carbon 13 C-NRM Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan LU-1 Human lung adenocarcinoma Ung thư biểu mô phổi Vero Vero cell Tế bào biểu mô thận khỉ MEME Minineal essential medium with Eagle’s salts Môi trường nuôi cấy tế bào MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú người FBS Fetal bovine serum Huyết bị DMEM Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium Mơi trường nuôi cấy tế bào vii H-NRM HPLC 1H- Nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân resonance spectroscopy proton High performance liquid chromatography HSQC Sắc ký lỏng cao áp Heteronuclear single quantum Phổ tương tác hai chiều dị coherence hạt nhân MeOH Methanol DMSO Dimethylsulfoxide EtOAc Ethylacetate CS% Cell survival Phần trăm sống sót IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT Spectroscopy HMBC ESI-MS OTU Heteronuclear multiple bond Phổ tương tác đa liên kết correlation hai chiều dị nhân Electron spray ionzation mass Phổ khối lượng phun mù spectroscopy điện tử Operational taxonomic units Đơn vị phân loại loài Shannon_H’ Diversity index Chỉ số đa dạng loài Chao-1 Độ phong phú loài Species richness MỤC LỤC BẢNG Bảng 1 Thành phần hóa học rong sụn[11] Bảng Đường kính vịng kháng khuẩn chủng vi khuẩn vi nấm lựa chọn 61 Bảng 2.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng vi khuẩn lựa chọn .62 Bảng 3 Đặc điểm hình thái hai chủng nấm lựa chọn 64 Bảng Chỉ số đa dạng sinh học số OTU quan sát thơng qua phân tích metagenomic 69 Bảng Chỉ số đa dạng sinh học số OTU quan sát thơng qua phân tích metagenomic 72 Bảng Hoạt tính đối kháng VSV cặn chiết ethylacetate từ chủng vi khuẩn vi nấm 79 Bảng Hoạt tính chống oxy hóa cặn chiết ethylacetate từ chủng vi khuẩn vi nấm lựa chọn 80 Bảng Hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết ethylacetate từ chủng vi khuẩn vi nấm lựa chọn 82 Bảng Biến mã hóa mức thí nghiệm 90 Bảng 10 Ma trận kế hoạch thực nghiệm 90 Bảng 11 Bảng kết phân tích phương sai mơ hình 91 Bảng 12 Phương trình hàm hồi quy .92 Bảng 13 Giá trị tối ưu yếu tố công nghệ 93 Bảng 14 Giá trị dự đoán giá trị thực nghiệm hàm mục tiêu điều kiện tối ưu 93 Bảng 15 Kết tối ưu hóa q trình sử dụng phần mềm design expert 7.0 93 Bảng 16 Thông số vật lý liệu hợp chất từ chủng nấm Aspergillus micronesiensis 97 Bảng 17 Số liệu phổ NMR AM8A1 hợp chất tham khảo 100 Bảng 18 Số liệu phổ NMR AM8B1 hợp chất tham khảo .105 Bảng 19 Số liệu phổ NMR AM8B2 hợp chất tham khảo .111 Bảng 20 Số liệu phổ NMR AM3A1 118 Bảng 21 Số liệu phổ NMR AM3D hợp chất tham khảo 121 Bảng 22 Số liệu phổ NMR AM4F1 hợp chất tham khảo .123 Bảng 23 Số liệu phổ NMR AM6E1 hợp chất tham khảo .125 Bảng 24 Số liệu phổ NMR AM6E2 hợp chất tham khảo .126 Bảng 25 Số liệu phổ NMR AM7H hợp chất tham khảo 129 Bảng 26 Số liệu phổ NMR AM8D hợp chất tham khảo 131 Bảng 27 Kết kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất phân lập từ chủng Aspergillus micronesiensis 135 Bảng 28 Kết thử hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập từ chủng Aspergillus micronesiensis 137 Bảng 29 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập chủng Aspergillus micronesiensis 138 Bảng 30 Kết giá trị IC50 số hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào 139 194 12.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AM6E1 12.3 Phổ 13C-NMR hợp chất AM6E1 195 12.4 Phổ HMBC hợp chất AM6E1 196 12.5 Phổ HSQC hợp chất AM6E1 197 Phụ lục 13 Hợp chất AM6E2: epicoccone B 13 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM6E2 198 13.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AM6E2 13.3 Phổ 13C-NMR hợp chất AM6E2 199 13.4 Phổ HMBC hợp chất AM6E2 200 13.5 Phổ HSQC hợp chất AM6E2 201 Phụ lục 14 Hợp chất AM7H: epicoccolides B 14.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM7H 202 14.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AM7H 14.3 Phổ 13C-NMR hợp chất AM7H 203 14.4 Phổ HMBC hợp chất AM7H 204 14.5 Phổ HSQC hợp chất AM7H 205 Phụ lục 15 Hợp chất AM8D: epicoccolide A 15.1 Phổ HR-ESI-MS hợp chất AM8D 206 15.2 Phổ 1H-NMR hợp chất AM8D 15.3Phổ 13C-NMR hợp chất AM8D 207 15.3 Phổ HMBC hợp AM8D 15.5 Phổ HSQC hợp chất AM8D 208 Phụ lục 16 Hợp chất AM8A1: Aspersiensis A (hợp chất mới)