ISSN 1859 1531 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 19, NO 9, 2021 17 NGHIÊN CỨU CÁC HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM VI SINH CHỨA VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS TT01 STUDY ON BIOACTIVES[.]
ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 19, NO 9, 2021 17 NGHIÊN CỨU CÁC HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM VI SINH CHỨA VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS TT01 STUDY ON BIOACTIVES OF MICROBIAL FORMULATIONS CONTAINING BACILLUS LICHENIFORMIS TT01 Đoàn Thị Vân1*, Võ Châu Tuấn1, Trần Quang Dần1 Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng Tác giả liên hệ: dtvan@ued.udn.vn (Nhận bài: 12/3/2021; Chấp nhận đăng: 27/8/2021) * Tóm tắt - Với mục đích tạo chế phẩm vi sinh dùng xử lý chất thải từ sở nuôi chim cút, nghiên cứu này, nhóm tác giả tạo 02 cơng thức chứa chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis TT01 (Biopro Biopro1) đánh giá hoạt tính sinh học liên quan đến khả xử lí chất thải Kết nghiên cứu cho thấy, Biopro có số lượng vi sinh vật nhiều Biopro1 10000 lần Khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase, phytase) chế phẩm Biopro cao so với chế phẩm Biopro1 Biopro có khả ức chế tiêu diệt chủng vi sinh vật gây hại có phân chim cút (Salmonella typhi, E coli) Đặc biệt, Biopo có khả sinh enzyme phytase cao, đường kính vịng phân giải đạt 5,31 ± 0,18 cm Đây sở khoa học quan trọng để ứng dụng Biopro xử lý phân chim cút trực tiếp trại chăn nuôi Abstract - With the aim to produce a microbial product used for treating wastes from quail farms (mainly manure and urine), in this study, the authors prepared two microbial formulations containing Bacillus licheniformis TT01, namely Biopro and Biopro1, and evaluated their bioactives that indicate capacity in the waste treatment The results showed that density of B licheniformis TT01 in Biopro was 1000 times higher than that in Biopro1 The synthesis of extracellular enzymes (amylase, protease, cellulase, phytase) of Biopro was higher than that of Biopro1 Also, Biopro showed a higher effectiveness of inhibiting harmfull microorgnaisms than Biopro1 In particular, Biopro was capable of producing a high content of phytase enzyme with inhibition zone diameters of 5.31 ± 0.18 cm These findings suggest that Biopro may be used for the quail waste treatment Từ khóa - Chế phẩm vi sinh; Bacillus licheniformis TT01; phân chim cút; Biopro; Biopro1 Key words - Microbial products; Bacillus licheniformis TT01; quail manure; Biopro; Biopro1 Đặt vấn đề Thân thiện với môi trường, người phát triển bền vững lĩnh vực ứng dụng – ưu điểm chế phẩm vi sinh Vì thế, ngày chế phẩm vi sinh vật nghiên cứu đa dạng ứng dụng vào lĩnh vực khác đời sống, như: Trong nông nghiệp trồng trọt, chăn nuôi, dược liệu, xử lý mơi trường… Điển hình như: Năm 2015, Nguyễn Văn Thao cộng nghiên cứu thành công chế phẩm vi sinh vật để sản xuất phân hữu sinh học từ bã nấm phân gà [1]; Năm 2018, Dương Thị Hương cộng nghiên cứu sản xuất chế phẩm Aspergillus oryzae KZ13 kết hợp Aspergillus awamori HK1 có khả sinh protease cao môi trường bán rắn (ngô mảnh-bột mỳ) [2]; Năm 2016, Nguyễn Thiết nhóm tác giả nghiên cứu ảnh hưởng nguyên liệu đệm lót men Balasa 01 lên sinh trưởng môi trường chuồng nuôi gà tàu vàng [3] Tuy nhiên, phần lớn công bố chưa nghiên cứu sâu phương pháp sản xuất chế phẩm vi sinh vật Mặt khác, nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để xử lý phân chim cút cịn hạn chế Trong đó, nghề nuôi chim cút phát triển nước ta Theo thống kê tính riêng xã Hịa Phước, huyện Hịa Vang, thành phố Đà Nẵng có 60 hộ hợp tác xã chăn nuôi chim cút với tổng số đàn lớn 130.000 Lượng phân chim cút thải lớn, gây mùi hôi chuồng trại Đây nguồn tiềm ẩn gây dịch bệnh, ảnh hưởng đến sức khỏe chim cút, gây ô nhiễm môi trường người Từ phân chim cút ủ thơ, nhóm tác giả phân lập định danh thành công chủng Bacillus licheniformis TT01 từ phân chim cút, huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Bacillus licheniformis TT01 có hoạt tính sinh học cao, sinh trưởng phù hợp với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Quảng Nam - Đà Nẵng nói riêng, địa bàn Duyên Hải Nam Trung nói chung [4] Việc nghiên cứu sâu ảnh hưởng điều kiện ni cấy đến hoạt tính sinh học chủng Bacillus licheniformis TT01, nhằm xây dựng quy trình tạo chế phẩm vi sinh hồn thiện điều cần thiết Nhóm tác giả hướng đến sản xuất chế phẩm vi sinh từ chủng vi sinh vật ứng dụng để xử lý phân chim cút trực tiếp trại chăn nuôi để phát triển nghề chăn nuôi chim cút cách bền vững Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis TT01 phân lập từ phân chim cút bảo quản phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh thuộc Khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp hoạt hóa chủng Bacillus licheniformis TT01 Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis TT01 cung cấp phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh thuộc Khoa Sinh – Môi Trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng dạng ống eppendorf, bảo The University of Danang - University of Science and Education (Thi Van Doan, Vo Chau Tuan, Tran Quang Dan) Đoàn Thị Vân, Võ Châu Tuấn, Trần Quang Dần 18 quản lạnh sâu -23 C Bacillus licheniformis TT01 hoạt hóa môi trường LB (Luria Bertani Broth), pH từ 7,0 đến 7,5, nhiệt độ từ 35oC đến 40oC, vịng từ 15-24h ni cấy [4] 2.2.2 Phương pháp tạo chế phẩm vi sinh từ chủng Bacillus licheniformis TT01 Cho 200ml mơi trường LB chuẩn bị bình thủy tinh trịn có dung tích 500ml Hấp tiệt trùng nồi hấp nhiệt độ 121oC, vòng 20 phút Để nguội môi trường tủ cấy Tiếp giống Bacillus licheniformis TT01 theo tỷ lệ 3% (với mật độ tế bào đạt 10 CFU/ml) Khử trùng nút miệng bình thủy tinh đèn cồn Đóng nút bơng bình thủy tinh, quấn chặt miệng cổ bình thủy tinh parafilm Tiến hành tạo chế phẩm vi sinh theo cơng thức (CT): CT1: Đặt bình tủ ấm, nhiệt độ từ 35 oC đến o 40 C, vòng 48h Đặt tên cho chế phẩm Biopro CT2: Cho bình vào lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ từ 35oC đến 40oC, vòng 48h Đặt tên cho chế phẩm Biopro1 2.2.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Bacillus licheniformis TT01 chế phẩm Mật độ Bacillus licheniformis TT01 chế phẩm xác định phương pháp cảm quan pha loãng, đếm số lượng vi sinh vật đĩa Petri, môi trường LB, nhiệt độ từ 35oC đến 40oC, ni cấy vịng 18-24h theo TCVN 4884: 2001 Phương pháp pha loãng chế phẩm: Đối với Biopro cần lắc sinh khối tay Sau đó, bước pha loãng chế phẩm Biopro Biopro giống nhau, sau: Sử dụng máy vortex để lắc sinh khối tế bào chế độ 800 vòng/phút Tiến hành hút dịch trung tâm bình giống để pha loãng Ở bước pha loãng sử dụng máy vortex để lắc sinh khối vi khuẩn 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào chế phẩm Xác định khả sinh enzyme ngoại bào chế phẩm Biopro Biopro1 tiến hành qua bước sau: Lấy 5ml chế phẩm vào ống nghiệm, mang ly tâm 13000 vòng/ phút vịng 10 phút, sau tiến hành xác định hoạt tính enzyme amylase, cellulase, protease phytase phương pháp khuếch tán đĩa thạch [5] Đường kính vịng phân giải tính theo cơng thức: X=D-d Chú thích: X - đường kính vịng phân giải (cm); D - đường kính vịng phân giải lớn (cm); d - đường kính lỗ thạch (cm) 2.2.5 Phương pháp xác định khả đối kháng chế phẩm với chủng vi sinh vật có hại Sử dụng phương pháp cấy vng góc để xác định hoạt tính đối kháng chế phẩm vi sinh vật tạo từ chủng Bacillus licheniformis TT01 với chủng vi sinh vật gây hại, thường xuất phân gia súc, gia cầm: Salmonella typhi, E coli 2.2.6 Phương pháp phân tích thống kê Tất số liệu thu thập sau thí nghiệm tính tốn xử lý thống kê theo phương pháp phân tích o phương sai chiều (ANOVA) phần mềm Excel Tất thí nghiệm làm lặp lại 03 lần Kết nghiên cứu khảo sát 3.1 Chế phẩm vi sinh vật từ chủng Bacillus licheniformis TT01 Để tạo chế phẩm vi sinh vật, tiến hành cho 6ml chủng Bacillus licheniformis TT01 vào 200ml mơi trường LB tiệt trùng Cho bình vào lắc nhiệt độ từ 35oC đến 40oC, 150 vòng/phút, vòng 48h, thu chế phẩm lỏng, thể Hình a) b) c) Hình Chế phẩm vi sinh vật chứa chủng Bacillus licheniformis TT01: A- Biopro sau 24 nuôi cấy; B- Biopro sau lắc nhẹ; C- Biopro1 Qua Hình cho thấy, chế phẩm Biopro Biopro1 chứa chủng Bacillus licheniformis TT01 dạng lỏng, có màu vàng, đáy lắng nhiều sinh khối vi khuẩn Bacillus licheniformis TT01 – có màu trắng Tuy nhiên, chế phẩm vi sinh vật tạo điều kiện không lắc, sau 01 ngày để tủ ấm có xuất lớp sinh khối màu trắng bề mặt dung dịch Dùng tay lắc nhẹ bình, lớp sinh khối tan có phần lắng xuống đáy bình Sau 48h, Biopro có màu vàng sáng Qua cảm quan, nhận thấy sinh khối bình Biopro nhiều so với Biopro1 Biopro1 có màu vàng đục Biopro Khảo sát đĩa Petri cho thấy, số lượng vi khuẩn Bacillus licheniformis TT01 Biopro1 dao động khoảng 3.108 CFU/ml, Biopro lớn 1012 CFU/ml Như vậy, tạo chế phẩm vi sinh vật từ vi khuẩn Bacillus licheniformis TT01 theo chế độ khơng lắc, đặt bình tủ ấm, nhiệt độ từ 35oC đến 40oC, vịng 48h số lượng vi sinh vật hữu hiệu cao so với chế độ lắc, 35oC đến 40oC Biopro Biopro1 có số lượng vi sinh vật hữu hiệu ≥108 CFU/ml - điều phù hợp với yêu cầu chất lượng chế phẩm vi sinh vật theo TCVN 6168:2002 [6] TCVN 7304-1:2003 [7] 3.2 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào chế phẩm Sau xác định số lượng vi sinh vật hữu hiệu, tiến hành khảo sát khả sinh enzyme bào dạng chế phẩm phương pháp đục lỗ thạch môi trường đặc trưng Kết khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào chế phẩm thể Hình Từ Hình cho thấy, chế phẩm Biopro Biopro1 tạo từ chủng Bacillus licheniformis TT01 xuất vòng phân giải enzyme amylase, protease, cellulose, phytase Tiến hành đo đường kính vịng phân giải enzyme thu kết thể Bảng ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 19, NO 9, 2021 Hình Khả sinh enzym ngoại bào: amylase (A-Biopro1, B-Biopro); protease (C-Biopro1, D- Biopro); cellulase (E- Biopro1, F- Biopro); phytase (G- Biopro1, H- Biopro) Bảng Đường kinh vòng phân giải Enzyme ngoại bào 19 Đường kính vịng phân giải chế phẩm Biopro cao Biopro1, điều cho thấy, tạo chế phẩm vi sinh từ chủng Bacillus licheniformis TT01, nhiệt độ từ 35oC đến 40oC, khơng lắc bình, sau 48 thu chế phẩm tốt so với chế phẩm thu từ bình lắc Đặc biệt, chế phẩm Biopro có khả sinh enzyme phytase cao, đường kính vịng phân giải đạt 5,31 ± 0,18 cm Điều phù hợp với nghiên cứu Elsorra E Idriss, et al [11] Nguyễn Văn Giang cộng [9] Enzyme phytase giúp phân giải acid phytic, dẫn tới giảm ô nhiễm phosphophytate, mà giúp cho phân giải hợp chất chứa K+, Ca2+, Cu2+, Zn2+, Mg2+ số dạng phức hợp protein, góp phần làm giảm mùi hôi từ phân chim cút, giảm ô nhiễm môi trường [10, 11, 12] Riêng khả sinh enzyme protease ngoại bào cơng thức khơng có sai khác rõ rệt Điều giải thích rằng, chế độ lắc ảnh hưởng tới khả sinh enzyme Theo nhiều nghiên cứu trước cho thấy, khả sinh enzyme protease ngoại bào chịu ảnh hưởng nhiều vào thời gian, nhiệt độ, pH, hàm lượng thành phần chất nuôi cấy chủng vi sinh vật [10, 16] Qua nghiên cứu cảm quan, đếm số lượng vi sinh vật hữu hiệu đĩa Petri khả sinh 04 loại enzyme ngoại bào Biopro Biopro cho thấy, Biopro có số lượng vi sinh vật hữu hiệu nhiều khả sinh enzyme ngoại bào amylase, protease, cellulose phytase cao so với Biopro1 Với mục đích nghiên cứu phương pháp tạo chế phẩm vi sinh từ chủng Bacillus licheniformis TT01 đơn giản, để ứng dụng vào xử lý phân chim cút tạo phân hữu vi sinh, nhóm tác giả chọn Biopro để nghiên cứu bước 3.3 Xác định khả đối kháng chế phẩm vi sinh với chủng vi sinh vật gây hại Chế phẩm Biopro tạo sau 48 nuôi cấy Bacillus licheniformis TT01 môi trường LB lỏng, nhiệt độ từ 35oC đến 40oC, không lắc Sử dụng phương pháp cấy vng góc để xác định khả đối kháng chế phẩm Biopro với chủng vi sinh vật có hại phân chim cút E coli Salmonella typhi Kết thể Hình Đường kính vịng phân giải (cm) Biopro Biopro1 P-value Amylase 3,46 ± 0,18 2,74 ± 0,13 0,00 Protease 2,55 ± 0,28 2,42 ± 0,18 0,02 Cellulase 3,60 ± 0,17 2,77 ± 0,25 0,01 Phytase 5,31 ± 0,18 3,45 ± 0,09 0,00 Chú thích: P-value xác định theo phân tích ANOVA yếu tố với n=3 Các giá trị P