Luận án Tiến sĩ Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Ngô Đình Bính Viện Cơng nghệ sinh học PGS.TS Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2018 i LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngơ Đình Bính, giáo viên hướng dẫn khoa học, người tạo điều kiện bên truyền dạy kiến thức, kinh nghiệm động viên tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin trân trọng cám ơn người hướng dẫn khoa học - PGS TS Đồng Văn Quyền - Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học hướng cho tơi ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho hồn thành luận án Tơi xin chân thành cám ơn Ban Giám đốc Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học cán thuộc Trung tâm động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin cám ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện làm việc thuận lơi cho hồn thành khóa học luận án Tơi xin cám ơn Bộ phận đào tạo, Viện Công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn tơi hồn thành thủ tục suốt trình học tập, nghiên cứu Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến đồng nghiệp, bạn bè ngồi Viện Cơng nghệ sinh học quan tâm, động viên dẫn cho tơi để tơi hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới người thân gia đình, người ln bên động viện, chia sẻ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày……tháng… năm 2018 Tác giả Trịnh Thị Thu Hà ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn số liệu, nội dung trình bày luận án Hà Nội, ngày … tháng …….năm 2018 Tác giả Trịnh Thị Thu Hà iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………… Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khu n Bacillus thuringiensis………………………………… 1.1.1 S 1.1.2 S phát tri n ng 1.2 Chitinase t nhiên……………………………………………… 10 1.2.1 Ngu n g c c chitin s ……………………………………………… 11 1.2.2 Ph n o i chitin s …………………………………………………… 12 1.2.3 Cấu trúc c 14 1.2.4 C ch ho t ộng c 1.2.5 Các y u t nh h ng n ho t t nh c chitin s ………………… 18 1.2.6 Các y u t nh h ng n tr nh sinh t ng h p chitin s 20 1.3 Chitinase tái tổ h p 22 1.3.1 Hệ i u Esch richi co i 26 1.3.2 Một s y u t cv thuringi nsis…………………………………………… ng c chitin s t thuringi nsis tr n th gi i chitin s ………………………………………………… nh h chitin s ……………………………………… ng n tr nh 16 n m n t ng h p chitin s tái t h p………………………………………………………………… 29 1.3.3 Thu h i tinh s ch chitin s tái t h p…………………………… 30 1.4 Ứng d ng c a chitinase 31 1.4.1 Trong nông nghiệp ng 31 1.4.2 Ứng d ng công nghiệp 33 1.4.3 Ứng d ng y c 34 1.4.4 Ứng d ng c tính sinh kh i nấm 34 1.4.5 Ứng d ng công nghệ sinh học 35 1.5 Sơ lƣ c tình hình sâu bệnh hại trồng…………………… 36 o vệ môi tr iv Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39 2.1.1 Ch ng gi ng p smi ………………………………………………… 39 2.1.2 Thi t bị…………………………………………………………………… 39 2.1.3 Hóa chất…………………………………………………………………… 40 2.1.4 Mơi tr 40 2.1.5 Dung dịch 41 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 41 2.2.1 Ph ng pháp vi sinh 41 2.2.2 Ph ng pháp hó sinh 43 2.2.3 Ph ng pháp sinh học phân tử 45 2.2.4 T i u i u kiện i u th o ph 2.2.5 Nghiên c u tính chất hóa lý c a chitinase tái t h p 52 2.2.6 Ph 54 2.2.7 Xử lý s liệu……………………………………………………………… 56 2.2.8 S 57 ng nuôi cấy……………………………………………………… ng pháp mặt áp ng ng pháp thử nghiệm nghi n c u Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 52 58 Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả sinh chitinase Việt Nam……………………………………………… 58 3.1.1 Ph n 58 3.1.2 Phân lo i 3.1.3 Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c p vi khu n thuringi nsis…………………………………… i loài ch ng B thuringiensis phân l p………… ch ng thuringi nsis s rov r kurst ki……………………………………………………… 3.1.4 Sàng ọc g n n ochitin s chi c Sàng ọc ho t t nh kháng nấm c ch ng 65 thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 3.2 63 ch ng thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 3.1.5 61 66 Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var kurstaki MSS1.1……………………………… 66 v 3.2.1 Th i gian nuôi cấy……………………………………………………… 67 3.2.2 Nhiệt ộ nuôi cấy……………………………………………………… 67 3.2.3 Ngu n c chất…………………………………………………………… 67 3.2.4 N ng ộ c chất………………………………………………………… 68 3.2.5 pH môi tr ng nuôi cấy……………………………………………… 68 3.2.6 Ngu n c c on…………………………………………………………… 69 3.2.7 Ngu n ni t ……………………………………………………………… 69 3.2.8 Môi tr 70 3.3 Nhân d ng gen chiA mã h a chitinase từ ch ng vi khu n B ng thay th …………………………………………………… thuringiensis var kurstaki MSS1.1 70 3.4 Biểu gen chiA vi khu n E coli BL21………………… 74 3.4.1 Thi t k vector bi u gen chiA vi khu n E.co i L21…… 74 3.4.2 Bi u chiA tái t h p E coli L21 DE3 ………………… 77 3.4.3 Nghiên c u i u kiện bi u gen chiA c a ch ng tái t h p…… 79 3.4.4 T i u kh i u rChi ằng ph ng pháp mặt áp ng……………………………………………………………………… 3.4.5 Ki m tra s t 3.4.6 Tinh s ch xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p…………… 89 3.5 Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 90 3.5.1 Nhiệt ộ t i u ộ b n nhiệt………………………………………… 90 3.5.2 pH t i u ộ b n pH………………………………………………… 91 3.5.3 Ảnh h ng c a ion kim lo i EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 92 3.5.4 Ảnh h ng c a chất t y rử …………………………………………… 92 3.5.5 Ảnh h ng c a dung môi hữu c ……………………………………… 93 3.5.6 Động học c a ph n ng nzym ……………………………………… 93 3.5.7 S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitin s …………………… 95 3.6 Th 3.6.1 ng th ch mơ hình th c nghiệm 84 88 nghiệm khả kháng nấm gây bệnh th c vật tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p……………………… 95 Kh kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p… 95 vi 3.6.2 4.1 Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p…… 97 Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 99 Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả sinh chitinase Việt Nam…………………………………………… 99 4.1.1 Ph n 99 4.1.2 Phân lo i 4.1.3 Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c p vi khu n thuringi nsis…………………………………… i loài kurstaki ch ng B thuringiensis phân l p… ch ng thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 4.1.4 Sàng ọc g n n ochitin s chi c Sàng lọc ho t tính kháng nấm c ch ng 101 thuringi nsis serovar kurst ki……………………………………………………… 4.2 100 ch ng thuringi nsis s rov r kurst ki……………………………………………………… 4.1.5 100 101 Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var kurstaki MSS1.1……………………………… 102 4.2.1 Th i gi n nuôi cấy……………………………………………………… 102 4.2.2 Nhiệt ộ nuôi cấy………………………………………………………… 103 4.2.3 Ngu n c chất…………………………………………………………… 103 4.2.4 N ng ộ c chất………………………………………………………… 104 4.2.5 pH môi tr ng nuôi cấy………………………………………………… 104 4.2.6 Ngu n on…………………………………………………………… 105 4.2.7 Ngu n ni t ……………………………………………………………… 105 4.2.8 Mơi tr 106 4.3 Phân tích trình t gen chiA cấu trúc mơ c a protein ng thay th …………………………………………………… ChiA ……………………………….……………………………… 107 4.4 Biểu rChiA vi khu n E coli BL21 (DE3)…………… 108 4.4.1 Bi u rChiA vi khu n………………………………………… 108 4.4.2 T i u i u kiện bi u hiện……………………………………………… 109 4.4.3 T i u kh i u rChiA ph ng pháp mặt áp ng……………………………………………………………………… 112 vii 4.4.4 Tinh s ch xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p…………… 113 4.5 Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 114 4.5.1 Nhiệt ộ t i u ộ b n nhiệt………………………………………… 114 4.5.2 pH t i u ộ b n pH………………………………………………… 115 4.5.3 Ảnh h ng c a ion kim lo i EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 115 4.5.4 Ảnh h ng c chất t y rử 116 4.5.5 Ảnh h ng c a dung môi hữu c 117 4.5.6 Động học c a ph n ng enzym 117 4.5.7 S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitinase 118 4.6 Th nghiệm khả kháng nấm gây bệnh th c vật tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p 118 4.6.1 Kh kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p 118 4.6.2 Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 122 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 123 TÓM TẮT KẾT QUẢ LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.……… 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO……….……………………………… 130 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ch viết tắt Bp BSA BT Bt Btk Colloidal chitin cs chiA ĐC dH2O DNA dNTP DNS E coli EDTA EtBr g/l GlcNAc (GlcNAc)2 (GlcNAc)3 (GlcNAc)4 IPTG Ch viết ầy Base pair Bovine serum albumin – albumin huyết bò Chế phẩm Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Chitin dạng keo Cộng Gen mã hóa chitinase Đối chứng Nước khử ion Deoxyribonucleic acid deoxyribo Nucleotide 5‟- Triphosphate 3,5 - dinitrosalicylic Escherichia coli Ethylene diamine tetra- acetic acid Ethidium Bromide Gam/lít N-acetyl-D-glucosamine Diacetyl-chitobiose Triacetyl-chitotriose Tetraacetyl-chitotetraose Isopropyl-β-D-thiogalactoside – chất cảm ứng Kana Kanamycine kb Kilo base kDa LB MTCS OD PCR Kilo Dalton Luria –Bertani – môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường sở Optical density - mật độ quang học Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi 145 control of Varroa destructor, a honey bee parasite J Invert Pathol 104: 75–82 140 Uchiyama T, Katouno F, Nikaidou N, Nonaka T, Sugiyama J, Watanabe T (2001) Roles of the exposed aromatic residues in crystalline chitin hydrolysis by chitinase A from Serratia marcescens 2170 J Biol Chem 276: 41343-41349 141 Usharani TR and Gowda TKS (2011) Cloning of chitinase gene from Bacillus thuringiensis Indian J Biotechnol 10: 264-269 142 Weijers CA, Franssen MC, Visser GM (2008) Glycosyltransferase-catalyzed synthesis of bioactive oligosaccharides Biotechnol Adv 26: 436–456 143 Wiwat C, Thaithanun S, Pantuwatana S, Bhumiratana A (2000) Toxicity of Chitinase - Producing Bacillus thuringiensis ssp kurstaki HD-1(G) toward Plutella xylostella J Invertebr Pathol 76(4): 270-277 144 Yamabhai M, Emrat S, Sukasem S, Pesatcha P, Jaruseranee N, Buranabanyat B (2008) Secretion of recombinant Bacillus hydrolytic enzyms using Escherichia coli expression systems J Biotechnol 133: 50–57 145 Yan R, Hou J, Ding D, Guan W, Wang C, Wu Z, Li M (2008) In vitro antifungal activity and mechanism of action of chitinase against four plant pathogenic fungi J Basic Microbiol 48(4): 293–301 146 Yan JW, Qian Y (2009) Cloning and expression of a novel chitinase chi58 from Chaetomium cupreum in Pichia pastoris Biochem Genet 47: 547–558 147 Yang CY, Ho YC, Pang JC, Huang SS, Schen SM (2009) Cloning and expression of an antifungal chitinase gene of a novel Bacillus subtilis isolate from Taiwan potato field Bioresource Technol 100(3): 1454-1458 148 Young JM, Chilcott CN, Broadwell A, Wigley PJ, Lecadet MM (1998) Identification of serovars of Bacillus thuringiensis Berliner 1915 in NewZealand New Zeal J Crop Hort 26: 63-68 149 Zarei M, Aminzadeh S, Zolgharnein H, Safahieh A, Daliri M, Noghabi KA, Ghoroghi A, Motallebi A (2011) Characterization of a chitinase with antifungal activity from a native Serratia marcescens B4A Braz J Microbiol 146 42: 1017-1029 150 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 151 http://www.cazy.org/GH18_structure.html 152 http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/factsheets/Potato_Rhizoctonia.htm PHỤ LỤC Ph l c Trình t so sánh Ngân hàng gen MSS1_1_ChiF EF581163.2 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | ATGGCTATGA GGTCTCAAAA ATTCACACTG CTATTACTAT CCCTACTACT TTTCTTACCT MSS1_1_ChiF EF581163.2 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | CTTTTTCTCA CAAATTTTAT TACTCCAAAT CTCGCATTAG CAGATTCACC AAAGCAAAGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | CAAAAAATTG TTGGGTACCT TCCTTCGTGG GGCGTTTACG GACGTAATTA TCAAGTTGCT T MSS1_1_ChiF EF581163.2 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | GACATTGATG CATCAAAACT TACTCACCTT AACTATGCTT TCGCGGATAT TTGTTGGAAT MSS1_1_ChiF EF581163.2 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | GGAAAACATG GAAACCCTTC TACTCATCCT GATAATCCAA ATAAACAAAC GTGGAACTGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | AAAGAATCTG GTGTACCATT GCAAAATAAA GAGGTTCCTA ATGGTACTCT CGTACTCGGG .G MSS1_1_ChiF EF581163.2 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | GAACCATGGG CTGATGTTAC CAAATCGTAT CCTGGCTCAG GGACAACTTG GGAAGATTGC MSS1_1_ChiF EF581163.2 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | GATAAATATG CCCGTTGCGG AAATTTCGGG GAACTAAAAC GATTAAAAGC TAAATATCCT MSS1_1_ChiF EF581163.2 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | CACTTAAAAA CAATTATTTC CGTTGGTGGC TGGACTTGGT CTAACCGCTT TTCTGATATG MSS1_1_ChiF EF581163.2 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | GCCGCTGATG AAAAAACAAG AAAAGTATTT GCTGAATCTA CAGTAGCTTT TCTTCGCGCA MSS1_1_ChiF EF581163.2 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | TATGGGTTTG ATGGCGTAGA TTTAGACTGG GAATGTCCGG GCGTTGAAAC GATTCCTGGT C A MSS1_1_ChiF EF581163.2 670 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | GGTAGTTATC GTCCTGAAGA TAAACAAAAT TTCACTCTCC TTCTTCAAGA CGTCCGAAAT G MSS1_1_ChiF EF581163.2 730 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | GCTTTGAATA AAGCAGGTGC TGAAGATGGC AAACAATATT TACTAACAAT CGCTTCAGGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | GCAAGCCAAC GCTACGCTGA TCATACAGAA CTAAAGAAAA TTTCTCAAAT ACTCGATTGG MSS1_1_ChiF EF581163.2 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | ATTAATATTA TGACATATGA TTTCCACGGC GGATGGGAAG CTACTTCTAA TCATAATGCA MSS1_1_ChiF EF581163.2 910 920 930 940 950 960 | | | | | | | | | | | | GCTCTATATA AGGATCCAAA TGATCCAGCA GCAAATACGA ATTTTTACGT AGATGGTGCT C MSS1_1_ChiF EF581163.2 970 980 990 1000 1010 1020 | | | | | | | | | | | | ATAAATGTTT ATACAAATGA AGGTGTTCCA GTCGATAAAC TAGTATTAGG CGTACCCTTT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1030 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | | | | | | | TACGGACGTG GCTGGAAAAG TTGTGGCAAA GAAAATAACG GACAATATCA ACCTTGCAAA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1090 1100 1110 1120 1130 1140 | | | | | | | | | | | | CCAGGTAGTG ATGGGAAACT TGCTTCTAAA GGTACTTGGG ATGATTACTC TACCGGTGAC MSS1_1_ChiF EF581163.2 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | ACAGGTGTCT ATGATTACGG TGATTTAGCA GCCAATTACG TTAATAAAAA TGGTTTTGTA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1210 1220 1230 1240 1250 1260 | | | | | | | | | | | | CGCTACTGGA ATGACACAGC TAAAGTACCT TACTTATATA ATGCAACTAC AGGCACATTT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1270 1280 1290 1300 1310 1320 | | | | | | | | | | | | ATTAGCTACG ATGACAATGA ATCTATGAAA TACAAAACAG ACTATATAAA GACGAAAGGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1330 1340 1350 1360 1370 1380 | | | | | | | | | | | | TTAAGTGGAG CAATGTTTTG GGAACTAAGC GGAGATTGCC GTACAAGTCC AAAATATAGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1390 1400 1410 1420 1430 1440 | | | | | | | | | | | | TGCAGTGGTC CAAAATTACT TGATACGCTA GTAAAAGAAT TACTTGGTGG ACCTATTAAT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1450 1460 1470 1480 1490 1500 | | | | | | | | | | | | CAAAAAGATA CTGAGCCACC AACGAATGTT AAAAACATTG TAGTTACGAA TAAAAATTCA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1510 1520 1530 1540 1550 1560 | | | | | | | | | | | | AACTCAGTTC AATTAAACTG GACTGCATCT ACTGATAACG TAGGAGTTAC GGAATATGAA MSS1_1_ChiF kurstaki 1570 1580 1590 1600 1610 1620 | | | | | | | | | | | | ATTACTGCTG GAGAAGAGAA ATGGAGTACA ACAACAAATA GCATTACAAT TAAAAACTTA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1630 1640 1650 1660 1670 1680 | | | | | | | | | | | | AAACCTAATA CGGAATACAA ATTTTCAATA ATTGCCAAAG ATGCTGCTGG AAATAAATCG .A MSS1_1_ChiF EF581163.2 1690 1700 1710 1720 1730 1740 | | | | | | | | | | | | CAACCTACCG CTCTTACTGT CAAAACGGAT GAAGCTAATA CGACACCTCC TGATGGAAAT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1750 1760 1770 1780 1790 1800 | | | | | | | | | | | | GGTACTGCTA CATTTTCAGT CACTTCGAAT TGGGGCAGCG GTTATAACTT CTCGATTATA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1810 1820 1830 1840 1850 1860 | | | | | | | | | | | | ATCAAAAATA ATGGAACGAA CCCCATTAAA AATTGGAAAT TAGAATTTGA TTATAGCGGC G T MSS1_1_ChiF EF581163.2 1870 1880 1890 1900 1910 1920 | | | | | | | | | | | | AATTTAACAC AAGTTTGGGA TTCTAAAATT AGTAGTAAAA CAAATAATCA TTATGTAATT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1930 1940 1950 1960 1970 1980 | | | | | | | | | | | | ACGAACGCAG GATGGGATGG TGAAATTCCT CCTGGTGGAT CTATTACAAT TGGCGGTGCA A MSS1_1_ChiF EF581163.2 1990 2000 2010 2020 2030 | | | | | | | | | | GGAACAGGTA ATCCTGCCGA ACTTTTAAAT GCCGTCATTA GCGAAAACTA G Hình So sánh trình tự nucleotide đoạn gen chiA chủng MSS1.1 với trình tự EF581163.2 GenBank 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa MAMRSQKFTL LLLSLLLFLP LFLTNFITPN LALADSPKQS QKIVGYLPSW GVYGRNYQVA ABQ65137.2 F 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa DIDASKLTHL NYAFADICWN GKHGNPSTHP DNPNKQTWNC KESGVPLQNK EVPNGTLVLG ABQ65137.2 E 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa EPWADVTKSY PGSGTTWEDC DKYARCGNFG ELKRLKAKYP HLKTIISVGG WTWSNRFSDM ABQ65137.2 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa AADEKTRKVF AESTVAFLRA YGFDGVDLDW ECPGVETIPG GSYRPEDKQN FTLLLQDVRN ABQ65137.2 .Y .S 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa ALNKAGAEDG KQYLLTIASG ASQRYADHTE LKKISQILDW INIMTYDFHG GWEATSNHNA ABQ65137.2 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa ALYKDPNDPA ANTNFYVDGA INVYTNEGVP VDKLVLGVPF YGRGWKSCGK ENNGQYQPCK ABQ65137.2 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa PGSDGKLASK GTWDDYSTGD TGVYDYGDLA ANYVNKNGFV RYWNDTAKVP YLYN ATTGTF ABQ65137.2 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa ISYDDNESMK YKTDYIKTKG LSGAMFWELS GDCRTSPKYS CSGPKLLDTL VKELLGGPIN ABQ65137.2 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa QKDTEPPTNV KNIVVTNKNS NSVQLNWTAS TDNVGVTEYE ITAGEEKWST TTNSITIKNL ABQ65137.2 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa KPNTEYKFSI IAKDAAGNKS QPTALTVKTD EANTTPPDGN GTATFSVTSN WGSGYNFSII ABQ65137.2 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa IKNNGTNPIK NWKLEFDYSG NLTQVWDSKI SSKTNNHYVI TNAGWDGEIP PGGSITIGGA ABQ65137.2 .N 670 | | | MSS1.1_aa GTGNPAELLN AVISEN ABQ65137.2 Hình So sánh trình tự amino acid protein ChiA t chủng MSS1.1 với trình tự chủng HD73 có mã số ABQ65137.2 ngân hàng liệu Ph l c Trình tự nucleotide gen chiA amino acid Chitinase có nguồn gốc t chủng B thuringiensis var kurstaki MSS1.1 đăng ký Ngân hàng sở liệu GenBank Ph l c3 Bản vector biểu pET28b(+) Ph l c Bản đồ vector biểu pET28b(+) Ph l c Kết chạy kiểm tra mơ hình thuật tốn tối ưu Bảng Kết theo mơ hình Số TT Lactose (mM) Thời gian (giờ) Mật ộ TB (OD 600 nm ) Hoạt ộ (U/ml) 6,00 9,00 0,80 7,36 7,00 6,00 1,00 5,14 5,00 6,00 0,60 1,99 7,00 12,00 1,00 4,88 7,00 6,00 0,60 5,59 5,00 12,00 1,00 3,17 5,00 12,00 0,60 1,14 5,00 6,00 1,00 4,02 7,00 12,00 0,60 5,34 10 5,81 6,41 0,75 6,39 11 6,44 12,00 0,62 5,51 12 6,86 6,07 0,80 6,71 13 5,15 6,08 0,85 4,87 14 6,16 9,61 0,65 6,61 15 6,86 11,82 0,94 5,82 16 6,66 6,57 0,69 6,83 17 5,48 8,14 1,00 5,95 18 5,01 9,34 0,67 3,54 19 5,91 9,20 0,88 7,22 20 5,18 9,90 0,65 3,88 21 5,23 9,04 0,74 5,18 22 6,83 11,37 0,88 6,55 23 6,45 7,30 0,75 7,39 24 5,37 10,94 0,71 4,76 25 5,36 6,67 0,88 5,78 26 6,67 7,71 0,70 7,26 27 5,44 11,29 0,91 5,41 28 5,62 11,44 0,66 4,70 29 6,30 6,47 0,87 7,09 30 5,16 8,71 0,83 5,43 31 5,66 7,47 0,95 6,50 32 5,11 9,05 0,93 5,23 33 6,63 6,72 0,92 6,85 34 6,93 10,69 0,63 6,40 35 6,19 9,78 0,93 7,17 36 5,24 9,08 0,92 5,66 37 6,69 6,37 0,94 6,43 38 5,55 6,97 0,88 6,37 39 6,71 9,91 0,66 6,97 40 5,23 10,18 0,82 5,30 41 5,29 7,33 0,91 5,77 42 6,71 10,08 1,00 6,31 43 5,63 11,97 0,99 5,00 44 5,32 6,35 0,79 5,38 45 5,99 9,16 0,95 6,98 46 5,11 6,47 0,74 4,35 47 5,05 11,99 0,63 1,88 48 5,66 10,33 0,60 4,76 49 5,35 11,78 0,84 4,85 50 6,76 9,12 0,91 7,18 51 5,45 11,45 0,69 4,56 52 6,85 6,53 0,72 6,85 53 5,24 11,01 0,73 4,41 54 6,44 6,41 0,89 6,98 55 5,76 11,97 0,94 5,52 56 5,68 8,76 0,93 6,74 57 5,42 9,14 0,98 5,92 58 6,72 9,84 0,78 7,48 59 5,96 7,18 0,92 6,98 60 5,57 6,75 0,98 5,96 61 6,58 9,43 0,65 6,94 62 5,40 8,45 0,65 4,95 63 5,16 9,09 0,73 4,78 64 6,85 11,59 0,89 6,35 65 6,93 7,01 0,98 6,07 66 5,35 7,86 0,76 5,73 67 5,09 11,01 0,95 4,40 68 5,57 7,12 0,89 6,46 69 6,35 9,81 0,92 7,24 70 5,91 11,89 0,96 5,66 71 5,84 9,95 0,86 6,97 72 6,09 10,02 0,80 7,27 73 6,71 7,07 0,64 6,69 74 6,90 8,52 0,64 6,91 75 6,83 7,98 0,70 7,26 76 6,63 11,03 0,70 6,79 77 6,42 10,72 0,70 6,90 78 6,04 8,02 0,99 6,72 79 5,85 8,14 0,89 7,13 80 5,60 6,81 0,91 6,34 81 6,75 6,60 0,79 7,10 82 5,95 7,94 0,76 7,16 83 5,20 8,77 0,80 5,47 84 6,88 6,13 0,97 5,83 85 6,15 8,12 0,87 7,49 86 6,53 11,38 0,99 6,01 87 5,60 6,52 0,96 6,03 88 6,19 9,37 0,91 7,35 89 5,82 6,64 0,93 6,59 90 5,74 7,12 0,65 5,70 10 91 6,61 11,14 0,97 6,20 92 5,86 7,31 0,80 7,00 93 5,18 10,59 0,77 4,73 94 5,62 6,77 0,93 6,29 95 6,06 8,56 0,66 6,68 96 6,35 11,00 0,83 7,08 97 5,81 10,06 0,70 6,28 98 5,15 11,34 0,74 3,96 99 5,78 10,02 0,89 6,80 100 6,46 6,71 0,66 6,68 Bảng Các phương án lựa chọn nằm vùng tối ưu Số TT Lactose (mM) Thời gian (giờ) Mật ộ TB (OD600 nm ) Hoạt ộ (U/ml) 6,00 9,00 0,80 7,36 19 5,91 9,20 0,88 7,22 23 6,45 7,30 0,75 7,39 26 6,67 7,71 0,70 7,26 29 6,30 6,47 0,87 7,09 35 6,19 9,78 0,93 7,17 50 6,76 9,12 0,91 7,18 58 6,72 9,84 0,78 7,48 69 6,35 9,81 0,92 7,24 72 6,09 10,02 0,80 7,27 75 6,83 7,98 0,70 7,26 79 5,85 8,14 0,89 7,13 81 6,75 6,60 0,79 7,10 82 5,95 7,94 0,76 7,16 85 6,15 8,12 0,87 7,49 88 6,19 9,37 0,91 7,35 92 5,86 7,31 0,80 7,00 96 6,35 11,00 0,83 7,08 11 Ph l c 5: Kết thử nghiệm enzyme tái tổ hợp Bảng T lệ sâu tơ chết (%) sau khoảng thời gian thử nghiệm khác Mẫu thí nghiệm Thời gian th nghiệm (giờ) 24 36 48 60 72 SP10.6 26,67 63,33 82,22 93,33 100 rChiA 0 3,33 6,67 7,78 8,89 51,11 81,10 100 - - SP10.6 rChiA + Bảng T lệ sâu khoang chết (%) sau khoảng thời gian thử nghiệm khác Mẫu thí nghiệm Thời gian th nghiệm (giờ) 24 36 48 60 72 SP10.6 27,78 53,33 69,99 78,89 83,33 rChiA 0 3,33 4,44 5,56 6,67 33,33 67,78 84,44 85,56 87,78 SP10.6 rChiA + Chú thích: SP10.6: Protein tinh thể t chủng B thuringiensis SP10.6 rChiA: Enzyme chitinase tái tổ hợp SP10.6 + rChiA: Hỗn hợp protein tinh thể t chủng SP10.6 chitinase tái tổ hợp 12 13