Microsoft Word DetaiCT TD trang bìa doc BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Đà Lạt o0o ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT ĐỀ[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Đà Lạt -o0o ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM MÃ SỐ: B2005-29-41-TĐ Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục Đào tạo Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại học Đà Lạt -o0o ĐIỀU TRA VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN CÁC GIỐNG HOA CÚC VÀ HOA LAN CẮT CÀNH HIỆN ĐANG SẢN XUẤT TẠI ĐÀ LẠT ĐỀ TÀI CẤP TRƯỜNG TRỌNG ĐIỂM MÃ SỐ: B2005-29-41-TD Cơ quan quản lý: Bộ Giáo dục Đào tạo Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Đà Lạt Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Kết NHÓM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Cán tham gia thực đề tài: TS Nguyễn Văn Kết Th.S Cao Thị Làn Th.S Nguyễn Thành Sum NCV Đỗ Phương Mai NCV Trương Thị Lan Anh Các đề tài sinh viên báo cáo Khảo sát hiệu ức chế virus ribazole năm giống cúc nuôi cấy in vitro Đinh Thị Hạnh Sinh viên Nơng học khóa 27 Tác động ribazole lên sinh trưởng cúc (Farm trắng, Farm tím, Nữ hoàng tím, Thọ đỏ, Thọ vàng chanh) in vitro Nguyễn Thị Thắm Sinh viên Tại chức Sinh học khóa 13 Tác động ribazole lên sinh trưởng cúc (Chrysanthemum sp.) in vitro Phạm Thị Hằng Hương Sinh viên Sinh học khóa 27 Phục tráng giống hoa cúc (Farm hồng, Pingpong vàng, Nút vàng, Nút tìm, Tia muỗng vàng) ribazole Cao Viết Tuấn Sinh viên Nơng Học Khóa 27 Khảo sát ảnh hưởng biện pháp bổ trợ ribazole việc làm virus lên sinh trưởng phát triển ba giống địa lan (Đỏ Bà Mai, Tím hột, Vàng Ba Râu) Đà Lạt Vũ Thị Phương Thanh Sinh viên Nơng học khóa 27 Khảo sát tình hình sản xuất giống cúc Đà Lạt Nguyễn Thị Như Quỳnh Sinh viên Nơng học khóa 28 TĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tóm tắt Qua điều tra thực tế loại cúc lan cắt cành Thành phố Đà Lạt cho thấy có khoảng 38 giống lan trồng với mục đích cắt cành, có khoảng 14 giống có giá trị nhiều người tiêu dùng ưa chuộng Các giống cúc cắt cành nhập vào Đà Lạt có 72 giống, nhiên nhiều giống bị lãng quên, lại khoảng 54 giống cịn phục hồi Nhằm bảo tồn giống hoa này, tiến hành biện pháp kiểm tra trạng lây nhiễm loại virus, phục tráng thành công 14 giống địa lan, 54 giống cúc in vitro Abstrast Lam Dong Province of Vietnam has an exceptional diversity of cutting flower of Cymbidium and Chrysanthemum with approximately 38 and 72 varieties respectively Plant tissue culture and micropropagation techniques play an important role in conservation programme and management of botanical collection Chrysanthemum and Cymbidium plants collected from farmers were identified the highest virus infection rate among of these species The results obtained by observation samples of 54 varieties Chrysanthemum and 14 varieties Cymbidium Using meristem culture and treated with Virazol in vitro suggest that the possibility could be obtained virus free plants through cultures Mở đầu Tính cấp thiết đề tài Việc du nhập ngày nhiều giống hoa cắt cành xu hương cần thiết đề đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa người dân để xuất khNu Tuy nhiên song song với việc chạy đua thay đổi giống thị trường sản xuất đồng thời có nhiều giống bị lãng qn, khơng phải giống hoa không đảm bảo chất lượng mà thị hiếu người tiêu dùng Việc nghiên cứu biện pháp cơng nghệ lĩnh vực nhân giống lồi hoa cắt cành có giá trị kinh tế địa phương nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen tập đoàn hoa cắt cành biện pháp cần thiết cho xu hướng phát triển đa dạng hoa cắt cành tương lai tránh lãng phí số lớn giống hoa mà thân đất nước chưa thể lai tạo Mục tiêu đề tài Đề tài thực nhằm mục đích sau: - Điều tra tình hình sản xuất hoa cắt cành có Đà lạt - Sưu tập bảo tồn nguồn gen quí hoa cúc, hoa lan cắt cành, v.v có giá trị tình Lâm Đồng kỹ thuật nuôi cấy in vitro - Nghiên cứu điều kiện mơi trường sinh trưởng thích hợp giống bảo tồn điều kiện in vitro - Nghiên cứu điều kiện môi trường giá thể sinh trưởng thích hợp giống vườn ươm - Tạo môi trường thực tập nghiên cứu cho giáo viên sinh viên Phạm vi giới hạn đề tài Đề tài thực nghiên cứu bảo tồn giống cúc giống hoa lan cắt cành tồn sản xuất Thành phố Đà Lạt CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP 6-benzyl-aminopurine dSm-1 deciSiemen per meter – Đơn vị biểu thị độ dẫn điện dung dịch EC Độ dẫn điện (Electrical conductivity) IAA Indol-3-acetic acid IBA Indolbutyride acid KC Knudson (1946) Kin Kinetin (6-furfuryl-aminopurine) LM Lindemann(1970) MS Murashige and Skoog (1962) NAA -naphthalene acetic acid NCV Nghiên cứu viên PLB Protocorm like body TDZ Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) VW Vacin and Went (1949) 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid LSD 0.5: Sai khác tối thiểu có ý nghĩa P = 0.5 CV% Hệ số sai dị FrW: Trọng lượng tươi NTL: Đường Nguyên Tử Lực – Đà Lạt Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Sơ lược cấy mô công tác nhân giống trồng 1.1 Tính tồn tế bào thực vật ni cấy mơ Ni cấy mơ thực vật (hay cịn gọi nuôi cấy thực vật in vitro) trình nhân giống vơ tính thực vật ống nghiệm Nuôi cấy mô thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất kỹ thuật nuôi cấy phận khác (tế bào, mô, quan) thực vật môi trường nhân tạo điều kiện vô trùng (15, 22, 29) Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa sở lý luận khoa học tính tồn khả phân hóa, phản phân hóa tế bào thực vật Cuối kỷ 19, nhà bác học người Đức Haberlangt (1902) người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào Theo ông, tế bào thể sinh vật mang toàn lượng thơng tin di truyền sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh (15, 22) Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai lịch sử nuôi cấy mô thực vật, White, người Mỹ, nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) với môi trường lỏng chứa muối khống, glucose nước chiết nấm men Sau White chứng minh thay nước chiết nấm men hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) Nicotinic axit Từ việc ni cấy đầu rễ tiến hành nhiều loại khác Năm 1958, tính tồn tế bào khẳng định cơng trình nghiên cứu Stewart cs (1958) mô rễ cà rốt Các tác giả nuôi cấy mô rễ cà rốt mơi trường đặc có nước dừa thu nhận khối mô sẹo gồm tế bào nhu mô Khi chuyển mô sẹo sang môi trường lỏng có thành phần ni lắc nhận huyền phù gồm tế bào riêng lẽ nhóm tế bào Tiếp tục ni cấy mơi trường lỏng, khơng cấy chuyển thấy hình thành rễ Đến năm 60, đồng thời Stewart (1963), Wetherell Halperin (1963) thông báo tế bào cà rốt tự nuôi cấy môi trường thạch tạo thành hàng ngàn phôi, phôi phát triển qua giai đoạn giống trình tạo phơi bình thường cà rốt, lúc tính toàn tế bào khẳng định Từ khám phá trên, hàng loạt báo cáo tính tồn tế bào thơng báo, tất quan phát triển phôi Phôi soma ghi nhận nhiều giống Atrapoda, Begonia, Citrus, Coffea, Cymbidium, Hordeum, Kalanchoe, Nicotiana, Panax, Ranumculus, Solanum, Oryza Ngày kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta nhân giống phục tráng hàng loạt trồng có giá trị khoai tây, lan, thuốc lá, dứa, lương thực, ăn Việc nhân giống trở thành công nghệ áp dụng nhiều nước giới (10, 11, 15 22, 30) 1.2 Công nghệ sinh học thực vật nhân giống trồng Công nghệ sinh học thực vật hình thành áp lực tự nhiên xã hội theo hai khuynh hướng: áp lực gia tăng suất áp lực giảm suất mùa màng Trước xu hướng đó, địi hỏi ngày phải đưa nhanh kỹ thuật vào công tác lựa chọn, nhân giống trồng Sự phát triển công nghệ sinh học thực vật theo thời gian tóm tắt sau: từ năm 1920 bắt đầu lai chéo, năm 1960 kỹ thuật gây đột biến, năm 1970 phát triển kỹ thuật cấy mô, đến năm 1980 kỹ thuật dung hợp tế bào trần từ năm 1990 đến phát triển kỹ thuật gen (10, 12, 15 22, 30) Nhờ kết hợp nuôi cấy mô thực vật công nghệ gen, người ta tạo thuộc tính cho trồng cách có định hướng hiệu Nhờ thuộc tính totipotent thực vật, người ta hồn tồn tái tạo nên loạt hoàn chỉnh từ tế bào mang đặc tính thời gian ngắn Nhờ kết hợp giúp cho cơng nghệ sinh học thực vật nói chung ni cấy mơ nói riêng có bước tiến mang lại hiệu kinh tế lớn Có thể nói cách khái quát ưu điểm công nghệ là: - Chọn lọc nhanh tính trạng mong muốn, nuôi cấy mô đường nhanh giúp chọn lọc biểu tính trạng - Ni cấy mơ tạo nguồn nguyên liệu thực vật tuyệt vời cho trình chuyển gen thực vật - Ni cấy mơ kết hợp với kỹ thuật dung hợp tế bào trần đột biến tạo dịng lai khác lồi - Giúp nhân giống vơ tính với tốc độ số lượng lớn - Giúp tạo bệnh - Thực vật nuôi cấy mô nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất chất quý hiếm, đặc biệt dược chất - Các mô đối tượng tốt hiệu nghiên cứu sinh lý, sinh hóa, di truyền, bệnh lý, sinh học phân tử - Các mô giúp trao đổi quốc tế nguồn giống thực vật dễ dàng - Các mơ cung cấp quanh năm 1.3 Vai trò chất điều tiết sinh trưởng ni cấy mơ Chất điều tiết sinh trưởng hay cịn gọi chất kích thích sinh trưởng thực vật yếu tố hóa học cần thiết cho sinh trưởng phát triển thực vật Chất điều tiết sinh trưởng thực vật chất tự nhiên sản sinh với hàm lượng nhỏ phận cá thể thực vật chất tổng hợp nhân tạo Những chất điều tiết sinh trưởng vận chuyển đến phận khác thể gây nên tác động điều tiết Vai trò điều hòa chất điều tiết sinh trưởng thực vật khởi động cho hình thành phản ứng cá biệt hay trình sinh lý định trì hỗn q trình Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật gồm hai nhóm auxin cytokinin, ngồi gibberelin ethylen có vai trò quan trọng sinh trưởng, phát triển trao đổi chất thực vật 1.3.1 Các auxin Chất auxin tự nhiên tìm thấy nhiều thực vật indol axetic axit (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, điều khiển hình thành rễ Ngồi IAA, cịn có dẫn xuất khác naphtyl axetic axit (NAA) 2,4 – diclophenoxyl axetic axit (2,4-D) Các chất đóng vai trị quan trọng phân chia mô trình tạo rễ (10, 12, 40, 41) NAA, IBA, 2,4-D auxin tổng hợp, có hoạt tính mạnh auxin tự nhiên IAA Chúng có vai trị quan trọng phân chia tế bào tạo rễ Đối với rễ, auxin ức chế phát triển rễ, nồng độ cực thấp (10 -10-12g/ml) có tác dụng kích thích sinh trưởng rễ, vượt qua ngưỡng (10-8mg/l) lại thể tác dụng ức chế -9 IAA kích thích rễ kìm hãm phát triển callus Ngược lại, 2,4-D kích thích hình thành callus kìm hãm hình thành rễ mơi trường ni cấy Mặc dù nhóm chất auxin hai chất lại có tính chất đối kháng NAA Went Thimann (1937) tìm Chất có tác dụng làm tăng hô hấp tế bào mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất nitơ, tăng khả tiếp nhận sử dụng đường môi trường nuôi cấy (10, 12, 40, 41) 1.3.2 Cytokinin Cytokinin chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng làm tăng phân chia tế bào Các cytokinin thường gặp 6-benzyl aminopurin (BAP), Kinetin Kinetin Shoog phát ngẫu nhiên chiết xuất axit nucleic Kinetin dẫn xuất base nitơ adenin BAP cytokinin tổng hợp nhân tạo có hoạt tính mạnh kinetin Kinetin BAP có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động tế bào phân sinh làm hạn chế hóa già tế bào Ngồi chất có tác dụng lên q trình trao đổi chất, trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein tăng cường hoạt động số enzim (10, 40, 41) Benjamin cs (1987) cho nồng độ BA cao (1-5ppm) kích thích phát triển chồi đỉnh đầu rễ Atropa belladona Lat cs (1988) cho sử dụng kinetin để nhân nhanh Picrohiza kurroa phải dùng nồng độ từ 15mg/l Những nghiên cứu Miller Skoog (1963) cho thấy chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với chất điều tiết sinh trưởng nội sinh Tác động phối hợp auxin cytokinin có tác dụng định đến phát triển phát sinh hình thái tế bào mơ Tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho hình thành rễ, tỷ lệ thấp kích thích q trình phát sinh chồi, tỷ lệ cân thuận lợi cho phát triển mô sẹo Barna Wakhlu (1998) tốc độ tái sinh chồi Plantago ovata tăng cao mơi trường sử dụng KIN 4-6 µM phối hợp với NAA 0,05µM Das (1958) Nitsch (1968) khẳng định tác động đồng thời auxin cytokinin kích thích mạnh mẽ tổng hợp ADN, dẫn đến trình mitos cảm ứng cho phân chia tế bào Skoog Miller (1957) khẳng định vai trị cytokinin q trình phân chia tế bào, cụ thể cytokinin điều khiển trình chuyển pha mitos giữ cho trình diễn cách bình thường (10, 12, 40, 41) 1.3.3 Các nhóm chất khác Ngồi nhóm chất điều tiết sinh trưởng kể trên, nuôi cấy in vitro cịn sử dụng số nhóm chất khác Abscicis acid, ethylen, amino acid Abscisis acid sử dụng nồng độ cao chất ức chế sinh trưởng trạng thái nghỉ bắt buộc Ethylen sinh q trình ni cấy thực vật Ethylen kìm hãm sinh trưởng tế bào đNy nhanh lão hóa q trình ni cấy mơ Silver nitrat sử dụng để ngăn chặn ethylen hình thành q trình ni cấy mơ (40, 41) Amino acid nâng cao tăng trưởng tế bào tái sinh L Glutamine xem nguồn nitơ Enzim hydrolyzed protein N-Z amin Type A casein hydrolyzate sử dụng hiệu đến 2g/l Thêm vào malate, citrate, pyruvate acid vơ tương tự có hiệu mơi trường ni cấy protoplast làm giảm bớt độc hại muối amonium (Gamborg & Shyluk, 1970; Gamborg, 1986) Ngoài ra, chất chiết coconut milk hạch xanh hiệu việc cung cấp phức hợp chất dinh dưỡng vô không xác định nhân tố sinh trưởng 1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation) Trong thập kỷ qua có nhiều báo cáo kỹ thuật vi nhân giống (Arditi Krikorian, 1996; Chakrabarty cs., 2001; Rasai cs., 1995; Rout cs., 2000) Vi nhân giống nhân giống vơ tính với số lượng trồng thông qua nuôi cấy mô in vitro Kỹ thuật nuôi cấy ứng dụng rộng rãi việc nhân giống loài cảnh loài khác toàn giới (Chu 1992; Huetteman Preece 1993; Mantell cs., 1985; Prerik, 1987) Một dạng thú vị quan trọng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro khả tái sinh sinh sản từ nuôi cấy tế bào mô Dạng đơn giản tái sinh in vitro kích thích phát triển chồi Kỹ thuật tận dụng phát triển cá thể cho phát triển chồi đỉnh sinh trưởng chồi bên Trạng thái ngủ chồi bị phá hũy phát triển chồi non kích Qui trình đề nghị sử dụng nhân giống địa lan Qui trình nhân giống địa lan bệnh trở thành phổ biến với thành công định không sai khác nhiều nhiều phịng thí nghiệm nhân giống Trong việc áp dụng biện pháp bổ trợ việc loại bỏ virus địa lan thường sử dụng xử lý nhiệt Trong điều kiện Việt Nam, chưa thấy có tài liệu sử dụng hóa chất bổ trợ, qui trình này, nét khác biệt áp dụng hóa chất (ribazole) việc tạo bệnh Đỉnh chồi (1) Đỉnh sinh trưởng (2) Tạo thể protocorme (3) Tạo cụm chồi (4) Tách chồi (5) Cây trưởng thành (8) Trồng lan vĩ xốp (7) Cây (6) Qui trình nhân giống in vitro Địa Lan (1) Lấy chồi từ lan trưởng thành (Khử trùng theo phương pháp thường qui vào mẫu môi trường MS + 0.1mg/l BA + 1gAC + 75mg virazole), mẫu phục hồi xử lý nhiệt độ tăng dần từ 25 đến 37oC giữ nhiệt độ vòng 3-5 tuần (2) Tách lại mô phân sinh (0,25-0,5mm) cấy lại vào môi trường bước khơng có virazole (3) Và (4) Protocorm hình thành bước (2) tiếp tục cấy chuyền sang môi trường (3 tháng/lần) (4) Cấy chuyền tiếp tục để tăng số lượng protocorm chồi (5) Tách chồi từ cụm chồi cấy sang môi trường Knudson C + 0,5-1mg/l BA + 0,5-1mg/l NAA + 1mg AC (6) Bước chuyển vườn ươm – mở nắp bình cấy để điều kiện vườn ươm từ 5-7 ngày để thích nghi với điều kiện tự nhiên (7) Trồng vào khay hay vĩ xốp Sử dụng giá thể dớn mút hay dớn xay + xơ dừa (1:1), xử lý qua thuốc diệt nấm (Mancozeb) sau ngâm vào nước sau cho giá thể vào khay hay vĩ Rút khỏi bình cây, rửa nhẹ nhàng qua nước máy để loại bỏ thạch khỏi rễ, sau trồng vào khay với mật độ 5×5cm Để khay điều kiện độ Nm cao (≥ 90%), che sáng (≥ 70%) phun sương từ 3-4 lần ngày 72 QUI TRÌNH CHUYỂN CÂY LAN CON IN VITRO RA VƯỜN ƯƠM Cây sau rút khỏi môi trường in vitro cần rửa agar bám vào rễ, nhúng rễ với Mancozeb trồng vào giá thể Khay trồng: Khay kích thước 30 × 45 × 5cm Giá thể: Dớn mút; 3T/dớn xay (1:1) Dớn xay/Xơ dừa (2/1) Số lượng con/ khay: 100 Độ Nm giá thể: 70 – 80% Độ Nm khơng khí: 90 – 95% Nhiệt độ ni trồng: 20-25oC Ánh sáng: Độ che sáng > 70% Số lần tưới/ngày: 3-5 lần Bón phân: N-P-K tỉ lệ 3:1:1 pha lỗng có EC = 1,0ds/m phun tuần lần (trừ tuần sau Phòng trừ sâu bệnh hại lan: Nhện: Kasuarane (mỗi tuần phun lần) Nấm: Mancozeb (mỗi tuần phun lần) Sâu xanh: Semi-alpha (mỗi tuần phun lần) 73 Qui trình đề nghị sử dụng nhân giống cúc Qui trình nhân giống cúc bệnh trở thành phổ biến với thành công định không sai khác nhiều nhiều phịng thí nghiệm nhân giống Trong việc áp dụng biện pháp bổ trợ việc loại bỏ virus cúc thường sử dụng xử lý nhiệt Trong điều kiện Việt Nam, chưa thấy có tài liệu sử dụng hóa chất bổ trợ, qui trình này, nét khác biệt áp dụng hóa chất (ribazole) việc tạo bệnh Đỉnh chồi Đế hoa (1) Cây trưởng thành (7) Đỉnh sinh trưởng (2) Tạo (3) Cấy chuyền (4) Trồng vĩ xốp (6) Cây (5) Qui trình nhân giống in vitro Cúc (1) Lấy chồi từ cúc trưởng thành đế hoa (Khử trùng theo phương pháp thường qui vào mẫu môi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA + 5075mg virazole), mẫu phục hồi xử lý nhiệt độ tăng dần từ 25 đến 37oC giữ nhiệt độ vòng 3-4 tuần (2) Tách lại mô phân sinh (0,25-0,5mm) cấy lại vào môi trường bước khơng có virazole (3) Cây hình thành bước (2) tiếp tục cấy chuyền sang môi trường (mỗi tháng/lần) (4) Cấy chuyền tiếp tục môi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA để tăng số lượng in vitro (5) Tách đốt từ cấy sang môi trường MS+0.2mg/l IBA+0.5mg/l BA khoảng tuần trước đưa vườn ươm (6) Trồng vào khay hay vĩ xốp Sử dụng giá thể peatmoss, xử lý qua thuốc diệt nấm (Mancozeb) cho giá thể vào khay hay vĩ Rút khỏi bình cây, rửa nhẹ nhàng qua nước máy để loại bỏ thạch khỏi rễ, sau trồng vào khay với mật độ 3×3cm Để khay điều kiện độ Nm cao (≥ 90%) – ngày, che sáng (≥ 70%) phun sương từ 3-4 lần ngày 74 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHN KẾT LUẬN: - Các giống lan cắt cành Đà Lạt có khoảng 38 giống, có khoảng 14 giống có giá trị nhiều người tiêu dùng ưa chuộng - Các giống cúc cắt cành nhập vào Đà Lạt có 70 giống, nhiên nhiều giống bị lãng quên Qua điều tra thu thập khoảng 54 giống số có số giống sản xuất với số lượng lớn là: Cúc nút, cúc đại đóa, thọ vàng, pha lê, cúc vàng, tuapin hồng, nút nghệ, tiger đồng, pha lê xanh, pha lê cam Các thí nghiệm khảo sát mơi trường nhân giống lan cho thấy, môi trường MS + g/l than + ml/l BA + 1ml/l NAA chúng tơi thấy phát triển chồi theo chiều hướng thuận lợi, tạo lượng protocorm nhiều - Ribazole gây ức chế trình sinh trưởng phát triển điều kiện nuôi cấy in-vitro Cây sinh trưởng kém, chiều cao chồi nhỏ, phát triển Và nồng độ cao dẫn đến bị chết - Sự ức chế gây ribazole lên cúc theo mức độ khác nhau, tùy theo giống khác Nồng độ xử lý ribazole tương đối thích hợp năm giống cúc thí nghiệm khoảng 75-100mg/l - Cây giống lan giống cúc nghiên cứu sau qua xử lý ribazole kết hợp việc tách đỉnh sinh trưởng cho kết tốt KIẾN NGHN: - Tiếp tục kiểm tra giống cúc lan khác - Ngoài virus TMV, ta cần phải test loại virus khác gây hại cho cúc hoa - Nhà nước cần có hổ trợ kinh phí hàng năm để trì bảo tồn giống hoa cắt cành Đà Lạt, nguồn giống có giá trị việc phát triển nông nghiệp rau hoa Tỉnh nhà nói riêng nước nói chung 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Võ Văn Chi Dương Tiến Đức, 1978 Phân loại thực vật (thực vật bậc cao) Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp Nguyễn Duy Hạng Cs., 2006 Nghiên cứu sản xuất giá thể tổng hợp phục vụ trồng hoa lan loại hoa cảnh có giá trị kinh tế Lâm Đồng Thuộc dự án sản sản xuất thử nghiệm Sở Khoa học Công Nghệ Lâm Đồng Dương Công Kiên, 2002 Nuôi cấy mô thực vật Nhà xuất Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Trần Hợp, 1993 Cây hoa cảnh Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp Trần Văn Minh, 1997 Công nghệ tế bào thực vật Giáo trình cao học Viện sinh học nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh Hồng Thị Sản Phan Nguyên Hồng, 1986 Thực vật học phần phân loại Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Quang Thạch Đặng Văn Đông, 2002 Cây hoa cúc kỹ thuật trồng, Nhà xuất Nơng Nghiệp, Hà Nội Đồn Huy Tràng Cs., 2008 Nghiên cứu sản xuất giá thể trồng địa lan đa thành phần theo công nghệ nhiệt hóa lị quay Sở Khoa học Cơng Nghệ Lâm Đồng Nguyễn Văn Uyển, 1999 Các chất sinh trưởng nơng nghiệp Nhà xuất Thành phố Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Văn Uyển cs., 1984 Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng Nhà xuất Thành phố Hồ Chí Minh 11 Vũ Văn Vụ cs., 2003 Sinh lý học thực vật Nhà xuất giáo dục 12 Vũ Văn Vụ, 1999 Sinh lý thực vật ứng dụng Nhà xuất giáo dục TÀI LIỆU TIẾNG ANH 13 Arditti, J., 1992 Fundamentals of Orchid Biology John Wiley & Sons, Canada 14 Arditti, J and R Ernst, 1993 Micropropagation of orchids John Wiley & Sons, Canada, pp 467-520 15 Belitsky, I and V.N.A Bersenev, 1999 Jewel Orchids In: Orchids Magazine Am Orcchid Soc pp 33-37 16 Bhojwani, S.S and M.K Razdan, 1996 Plant tissue culture: Theory and practice, a revised edition Elsevier Science B.V The Netherlands 17 Boase MR, Miller R, Deroles SC 1997 Chrysanthemum systematics, genetics, and breeding In : Jamick J, editor Plant breeding reviews, vol 14 New York: Wiley; p 321-61 18 Plants through Tissue Culture Hughes, K.W., Henker, R and Constantin, M (Eds.) Conf 7804111 Technical Inf Center, U.S Dep Energy, Springfield, VA p 44-58 19 Cieslinska M., 2002 Elimination of apple chlorotic leaf spot virus (aclsv) from pear by in vitro thermotherapy and chemotherapy Electronic Jounal of Biotechnology Vol.1 No.3, p 343-350 20 Cockshull, K., 1985 Chrysanthemun morifolium In: HALEVY, A.H CRC handbook of flowering Boca Raton: CRC Press, v.2, p 238-257 21 D'Angelo, G and P Titone 1988 Determination of the water and air capacity of 25 substrates employed for the cultivation of Dieffenbachia amoena and Euphorbia pulcherrima Acta Hort 221:175-182 22 Ernst, R., 1974 The use of activated charcoal in asymbiotic seedling culture of Paphiopedilum Am Orhid Soc Bull 43:35-38 23 Evans, M.R and H.S Robert, 1996 Growth of bedding plants in sphagnum peat and coir dust-based substrates J Env Hort 14:187-190 24 Gamborg, O.L., T Murashige, T.A Thorpe, and I K Vasil, 1976 Plant tissue culture media In Vitro 12:473–8 25 George, E.F and P.D Sherrington, 1984 In: Plant Propagation by Tissue Culture Exegetics Ltd., Eversley, England, pp 324-366 26 Gisler¢d, H.R., L.M Mortensen, and A.R Selmer-Olsen, 1986 The effect of air humidity on growth and nutrient content of some greenhouse plants Acta Hort 178:181-184 27 Heo, J.W., C Kubota, and T Kozai, 1996 Effect of CO2 concentration, PPFD and sucrose concentration on Cymbidium plantlet growth in vitro Acta Hort 440: 560-565 28 Jaime A Teixeira da Silva, 2003 Chrysanthemum: advances in tissue culture, cryopreservation, postharvest technology, genetics and transgenic biotechnology, biotechnology advances 21: 715-766 29 Jones, E.D and Mullin, J.M 1974 The effect of potato virus X on susceptibility of potato tubers to Fusarium roseum “Avenaceum” Am Potato J.51: 209-251 30 Kassanis B 1949 Potato tubers freed from leaf roll virus by heat Nature 164:881 31 Kenneth L Brown, Janette M Hakimi, Debra M Nuss, Yolanda D Montejano, and Donald W Jacobsen, 1983 Acid-Base Properties of αRibazole and the thermodynamics of Dimethylbenzimidazole Association in Alkylcobalamibs, Inorg Chem 1984, 23, 1463-1471 32 Kano, K., 1965 Studies on the media for orchid seed germination Mem Fac Agric Kagawa University 20:1-68 77 33 Ket, N V, E., J Hahn, S Y Park, D Chakrabarty and K Y Paek., 2004 Micropropagation of an endangered orchid Anoectochilus formosanus Biologia Plantarum 48.,3: 339-344 34 Knudson, L., 1946 A new nutrient solution for germination of orchid seed Am Orhid Soc Bull 15:214-217 35 Linda Naeve, and Diane Nelson, 2005, Growing Chrysanthemum in the garden, plant new divition lowa State University o Science and Techonology, Ames, lowa 36 Margit Nothnagl, 2006, Interaction between greenhouse grown Chrysanthemum and Frankliniella occidentalis, Doctoral thesis Swedish University of Agricultural Sciences 37 Michael N Dana and B Roise Lerner, 1996, Chrysanthemums, Press of Department of Horticuture, Purdue University, West Lafayette, IN 38 Morel, G and Martin, C 1952 Virus-free Dahlia through meristem culture C.R Hebd Seances Acad Sci Paris 235: 1324-1325 39 Murashige, T 1980 Plant growth substances in commercial uses of tissue culture In: Plant Growth Substances 1979 Skoog, F (Ed.) Springer-Verlag, Berlin Pp 426-434 40 Murat Top and Bill Tatura, 2002, Growing Chrysanthemum, Agriculture Note Farm Diversiffication Service (Bendigo) March, 2002 41 Nayak, N.R., S.N Patnaik, and S.P Rath 1997a Direct shoot regeneration from foliar explants of an epiphytic orchid, Acampe praemorsa (Roxb.) Blatter and McCann Plant Cell Reports 16:583-586 42 Nayak, N.R., S.P Rath, and S.N Patnaik 1997b In vitro propagation of three epiphytic orchids, Cymbidium aloifolium (L.) Sw., Dendrobidium aphyllum (Roxb.) Fisch and Dendrobidium moschatum (Buch-Ham) Sw through thidiazuron-induced high frequency proliferation Scientia Hort 71:243-250 43 Nyland G and Gohen AC., 1969 Heat therapy of virus disease of perennial plants Annual Review of Phytopathology 7: 331-354 44 Oka S, Muraoka O, Abe T, Nakajima S., 1999 Adventitious bud and embroid formation in garland chrysanthemum leaf culture J Jpn Soc Hortic Sci 68:70 – 45 Pan, M.J and J van Staden, 1999 Effect of activated charcoal, autoclaving and culture media on sucrose hydrosis Plant Growth Reg 29:135-141 46 Paek, K.Y and Yeung, E.C., 1991 The effects of 1-naphthaleneacetic acid and N6-benzyladenin on the growth of Cymbidium forrestii rhizomes in vitro Plant Cell Tiss Org Cult 24:65–71 47 Pierik, R.L.M., 1987 In vitro culture of higher plants Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht The Netherlands 78 48 Powell, W and Uhrig, H., 1987 Anther culture of Solanum genotypes Plant Cell Tissue Organ Culture 11: 13-24 49 Prakash S., M.I Hoque, T Brinks, 2002, culture media and containers, Proceedings of a Technical Meeting organized by the Joint FAO/IAEA Division of Nuclear Techniques in Food and Agricultureand held in Vienna, 26 -30 August 2002 p.29-40 50 Rajapakse, N.C and Kelly, 1995 Spectral filters and growing season influence growth and carbohydrate status of Chrysanthemum J Amer Soc Hort Sci 120:78-83 51 Rout GR, Das P., 1997 Recent trends in the biotechnology of Chrysanthemum: a critical review Sci Hortic; 69:239-56 52 Schmidt J., E Wihem, V.A Savangikar, 2002, Disease detection and elimination, Low cost options for tissue culture technology in developing countries, Proceedings of a Techniques in Food and Agricultureand held in Vienna, 26-30 August 2002 p 55-62 53 Van Huylenbroeck, J.M and P.C Debergh 1996 Physiological aspects in acclimatization of micropropagated plantlets Plant Tiss Cult Biotech 2:136–141 54 Verdonck, O., D Vleeschauwer, and M De Boodt 1981 The influence of the substrates on plant growth Acta Hort 126:251-258 55 Yogesh Parmessur and Asha Saumtally, 2001 Elimination of sugarcane yellow leaf virus and sugarcane bacilliform virus by tissue culture, Food and Agriculture Research Council, Reùduit, Mauritiu p 127-134 56 Zapata, C., Miller Jr., J.C and Smith, R.H 1995 In vitro eradication of viruses from potato In vitro Cell Dev Biol Plant 31:153-159 79 Phụ lục hình ảnh minh họa (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình (a, b, c, d, e, f) Minh họa lan nuôi cấy in vitro 80 (g) (h) (i) (j) (k) (l) Hình (g, h, I, j, k, l) Minh họa lan trồng vườn ươm 81 Hoa BGH Hoa Xanh chiểu Hoa Miretta xanh Hoa Trắng bệch Cành hoa Tím hột Cành hoaTrắng bệch i MỤC LỤC Mở đầu Các từ viết tắt Chương Tổng quan tài liệu Sơ lược cấy mô công tác nhân giống trồng 1.1 Tính tồn tế bào thực vật nuôi cấy mô 1.2 Công nghệ sinh học thực vật nhân giống trồng 1.3 Vai trò chất điều tiết sinh trưởng nuôi cấy mô 1.4 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation) Sơ lược lịch sử nghiên cứu họ lan (Orchidaceae) chi địa lan (Cymbidium sw.)11 2.1 Khái quát chung 11 2.2 Một vài nét địa lan Đà Lạt 12 2.3 Hình thái bên ngồi địa lan 13 2.4 Phân loại địa lan 14 2.5 Virus hại thực vật 15 2.6 Virus hại địa lan 19 Sơ lược lịch sử nghiên cứu, đặc điểm chung phân loại họ cúc 24 3.1 Tình hình sản xuất hoa cúc 24 3.2 Đặc điểm sinh học họ cúc (Asteraceae hay Compositae) : 25 Virus phương pháp ELISA 28 Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 30 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 Chương Kết thảo luận 39 A Kết nghiên cứu giống địa lan 39 3.1 Kết điều tra lồi địa lan có Đà lạt 39 3.2 Khảo sát môi trường nhân giống 39 3.3 Khảo sát tác động Ribazole (Ribazole) lên sinh trưởng protocorm 44 3.4 Ảnh hưởng loại giá thể EC giai đoạn vườn ươm 49 B Kết nghiên cứu giống cúc 54 3.5 Ảnh hưởng Ribazole lên sinh trưởng phát triển in vitro, giống khác 54 3.6 Sự phục hồi sau xử lý Ribazole 58 Kết luận kiến nghị 72 Tài liệu tham khảo 76 Phụ lục hình ảnh minh họa 80 ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Danh mục loài địa lan cắt cành sản xuất Đà Lạt 39 Bảng 3.2 Ảnh hưởng mơi trường lên q trình phát sinh chồi ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng than hoạt tính lên q trình phát sinh chồi ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh 41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BA lên trình phát sinh chồi ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh 42 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BA + NAA lên trình phát sinh chồi ba giống Trắng bệt, Tím hột, Miretta xanh 43 Bảng 3.6 Ảnh hưởng ribazole lên sinh trưởng phát sinh protocorm Trắng 44 Bảng 3.7 Ảnh hưởng ribazole lên sinh trưởng phát sinh protocorm Tím hột 45 Bảng 3.8 Ảnh hưởng ribazole lên sinh trưởng phát sinh protocorm giống Miretta xanh 46 Bảng 3.9 Ảnh hưởng ribazole tích lũy lên sinh trưởng phát sinh protocorm Trắng 47 Bảng 3.10: Ảnh hưởng ribazole tích lũy lên sinh trưởng phát sinh protocorm Tím hột 47 Bảng 3.11 Ảnh hưởng ribazole tích lũy lên sinh trưởng phát sinh protocorm Miretta xanh 48 Bảng 3.12 Sự sinh trưởng giống Trắng bệch sau xử lý ribazole 48 Bảng 3.13 Sự sinh trưởng giống Tím hột sau xử lý ribazole 48 Bảng 3.14 Sự sinh trưởng giống Miretta xanh sau xử lý ribazole 48 Bảng 3.15 Tỉ lệ sống lan Cymbidium sp trêm loại giá thể khác sau tháng chuyển vườn ươm 49 Bảng 3.16 Sự sinh trưởng giống Trắng bệch loại giá thể khác sau 12 tháng chuyển vườn ươm 50 Bảng 3.17 Sự sinh trưởng giốngTím hột loại giá thể khác sau 12 tháng chuyển vườn ươm 50 Bảng 3.18 Sự sinh trưởng giống Miretta xanh loại giá thể khác sau 12 tháng chuyển vườn ươm 50 Bảng 3.19 Ảnh hưởng EC lên sinh trưởng lan giống Trắng bệch giá thể khác sau 12 tháng 52 Bảng 3.20 Ảnh hưởng EC lên sinh trưởng lan giốngTím hột giá thể khác sau 12 tháng 52 Bảng 3.21 Ảnh hưởng EC lên sinh trưởng lan giống Miretta xanh giá thể khác sau 12 tháng 523 Bảng 3.22 Các giống địa lan thu thập phục tráng 524 Bảng 3.23 Ảnh hưởng ribazole giống pingpong vàng 54 Bảng 3.24 Ảnh hưởng ribazole giống tia muỗng vàng 55 Bảng 3.25 Ảnh hưởng ribazole giống farm hồng 56 Bảng 3.26 Ảnh hưởng ribazole giống nút vàng 57 iii Bảng 3.27 Ảnh hưởng ribazole giống nút tím 58 Bảng 3.28 Sự sinh trưởng giống tia muỗng vàng môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 59 Bảng 3.29 Sự sinh trưởng giống farm hồng môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 60 Bảng 3.30 Sự sinh trưởng giống pingpong vàng môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 60 Bảng 3.31 Sự sinh trưởng giông nút vàng môi trường nhân nhanh, sau 30 nuôi cấy 61 Bảng 3.32 Sự sinh trưởng nút tím mơi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 61 Bảng 3.33 Sự sinh trưởng giống tuapin hồng môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 62 Bảng 3.34 Sự sinh trưởng giống nút nghệ môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 63 Bảng 3.35 Sự sinh trưởng giống tiger đồng môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 64 Bảng 3.36 Sự sinh trýởng giống pha lê xanh môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 65 Bảng 3.37 Sự sinh trưởng giống pha lê cam môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 66 Bảng 3.38 Sự sinh trưởng giống tuapin hồng môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 66 Bảng 3.39 Sự sinh trưởng giống nút nghệ môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 67 Bảng 3.40 Sự sinh trưởng giống tiger đồng môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 67 Bảng 3.41 Sự sinh trưởng giống pha lê xanh môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 68 Bảng 3.42 Sự sinh trưởng giống pha lê cam môi trường nhân nhanh, sau 30 ngày nuôi cấy 68 Bảng 3.43: Kết test ELISA giống cúc 69 iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Các giống pingpong vàng sau xử lý ribazole 30 ngày 55 Hình 3.2 Các giống tia muỗng vàng sau xử lý ribazole 30 ngày 56 Hình 3.3 Các giống tia farm hồng sau xử lý ribazole 30 ngày 57 Hình 3.4 Các giống nút vàng sau xử lý ribazole 30 ngày 57 Hình 3.5 Ảnh hưởng Ribazole giống nút tím 58 Hình 3.6: Các giống tia muỗng vàng 30 ngày sau cấy trở lại môi trường nhân nhanh 59 Hình 3.7 Giống pingpong vàng nghiệm thức R0 R2 30 ngày sau cấy môi trường nhân nhanh 60 Hình 3.8 Giống nút vàng nghiệm thức R0 R2 30 ngày sau cấy môi trường nhân nhanh 61 Hình 3.9 Giống nút tím nghiệm thức R0 R2 30 ngày sau cấy môi trường nhân nhanh 62 Hình 3.10 Các giống tuapin hồng sau xử lý ribazole 60 ngày 63 Hình 3.11 Các giống nút nghệ sau xử lý ribazole 60 ngày 63 Hình 3.12 Các giống tiger đồng sau xử lý Ribazole 60 ngày 64 Hình 3.13 Các giống pha lê xanh sau xử lý ribazole 60 ngày 65 Hình 3.14 Các giống pha lê cam sau xử lý ribazole 60 ngày 66 v