Nghiên cứu nhân giống cây quýt vàng bắc sơn bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRỊNH KHÁNH LÂM Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT VÀNG BẮC SƠN BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Nơng nghiệp cơng nghệ cao Khoa: Nơng học Khố học: 2018 –2022 Thái Ngun, năm 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRỊNH KHÁNH LÂM Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY QUÝT VÀNG BẮC SƠN BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT” KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Ngành: Nơng nghiệp công nghệ cao Lớp: K50 - NNCNC Khoa: Nông học Khoá học: 2018 –2022 Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hồng Thái Nguyên, năm 2022 i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông học, thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống quýt vàng Bắc Sơn kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật” Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông học cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hồng giảng viên Khoa Nông học và đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em thời gian thực hiện đề tài Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và là chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Trong quá trình thực tập, cũng là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn, trình độ và kỹ bản thân còn nhiều hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo nhà trường, Khoa Nông học, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành công cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực tập Trịnh Khánh Lâm ii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzylaminopuri Cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Coefficient variance : Hệ số biến động CĐTST : Chất điều tiết sinh trưởng Đ/C : Đối chứng Đtg : Đồng tác giả ĐST : Đỉnh sinh trưởng Kinetin : 6-Furfurylaminopurine GA3 : Gibberellic acid LSD0.05 : Least significant difference: Giá trị sai khác nhỏ nhất mức độ tin cậy 95% MS : Murashige & Skoog’s, 1962 MT : Môi trường NAA : α-Naphthalene acetic acid TN : Thí nghiệm TB : Trung bình iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ sạch-sống của mẫu hạt làm gốc ghép (sau 20 ngày) 28 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của môi trường đến tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của mẫu hạt gốc ghép (sau 30 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của môi trường đến khả sinh trưởng của gốc ghép (sau 30 ngày nuôi cấy) 32 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ sạch-sống đoạn cành quýt vàng Bắc Sơn chứa đỉnh sinh trưởng (sau 20 ngày) 34 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của Cytokinin (BAP) đến khả tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro (sau 30 ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.6 Ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) Auxin (NAA) đến khả tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của của Cytokinin (BAP) đến khả nhân nhanh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro (sau 30 ngày nuôi cấy) 38 Bảng 4.8 Ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) Auxin (NAA) đến khả nhân nhanh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro (sau 30 ngày nuôi cấy) 40 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của loại gốc ghép đến hiệu quả vi ghép in vitro đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn (sau 20 ngày nuôi cấy) 41 iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii MỤC LỤC .iv Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc điểm thực vật học thành phần dinh dưỡng của quả quýt 2.1.1 Một số đặc điểm thực vật học 2.1.2 Thành phần dinh dưỡng giá trị sử dụng của quả quýt 2.2 Tình hình sản xuất cam, quýt thế giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình sản xuất cam, quýt thế giới 2.2.2 Tình hình sản xuất cam quýt Việt Nam 2.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro công nghệ tế bào thực vật 2.3.1 Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 2.3.2 Quy trình nhân giớng in vitro 2.3.3 Chất điều hòa sinh trưởng tḥc nhóm auxin cytokinin sử dụng nuôi cấy mô thực vật 11 2.3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống trồng ống nghiệm .15 2.4 Một số thành tựu nhân giớng ăn quả có múi kỹ tḥt nuôi cấy in vitro 16 v Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 18 3.1.1 Vật liệu thực vật 18 3.1.2 Hoá chất sử dụng .18 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 18 3.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu .19 3.3.1 Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất gốc ghép in vitro sạch bệnh 19 3.3.2 Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất đỉnh sinh trưởng sạch bệnh in vitro .21 3.3.3 Nghiên cứu kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn in vitro 24 3.4 Chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp theo dõi 25 3.5 Phương pháp xử lí sớ liệu 27 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật sản xuất gốc ghép in vitro sạch bệnh 28 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu hạt gốc ghép 28 4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến tỷ lệ nảy mầm sinh trưởng của mẫu hạt gốc ghép in vitro .31 4.2 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật sản xuất đỉnh sinh trưởng sạch bệnh in vitro 34 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ sạch-sống của đoạn cành quýt vàng Bắc Sơn chứa đỉnh sinh trưởng 34 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Cytokinin (BAP) đến khả tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro .35 4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) Auxin (NAA) đến khả tái sinh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro .37 vi 4.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của Cytokinin (BAP) đến khả nhân nhanh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro 38 4.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Cytokinin (BAP 2,0 ppm) Auxin (NAA) đến khả nhân nhanh chồi quýt vàng Bắc Sơn in vitro 40 4.3 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng quýt vàng Bắc Sơn in vitro 41 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị .43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHẦN PHỤ LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) được nhiều người biết đến loại ăn quả có vị ngọt, mùi thơm riêng đặc trưng, ngoài còn chứa nhiều chất dinh dưỡng Quýt không chỉ nguồn cung cấp dưỡng chất mà còn đóng vai trị tích cực việc phát triển kinh tế nhiều địa phương Do có hương vị riêng, chất lượng tốt nên mức độ tiêu thụ thị trường dần tăng lên Với mức giá tốt, quýt mang lại nguồn lợi kinh tế đáng kể cho nhà vườn Giúp nhiều hộ gia đình thoát nghèo, vươn lên làm giàu từ quýt Trồng quýt không những giúp phủ xanh những khoảng đất trớng mà cịn có vai trị cải tạo cảnh quan bảo vệ mơi trường tự nhiên Phù hợp với khí hậu vùng trung du miền núi nên quýt dễ dàng thích nghi với điều kiện sống khô hạn, xanh bao phủ quanh năm Để chớng xói mịn vùng đời núi, trồng quýt cũng là giải pháp hiệu quả, vừa đem lại hiệu quả kinh tế vừa có thể bảo vệ môi trường sinh thái Không chỉ vậy, quýt cũng là thú chơi với những người đam mê cảnh, quýt có tán rộng, xanh quanh năm, hoa quả màu sắc đẹp Cây quýt Bắc Sơn được trồng chủ yếu huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn Có vị đậm, hương thơm đặc trưng, là loại quả quý cần được bảo tồn Tồn tỉnh Lạng Sơn hiện có 1.400 sản xuất quýt, sản lượng thu hoạch hàng năm khoảng 3.000-3.500 tấn, giá trị mang lại cho người dân 100 tỷ đồng (Minh Thu, 2022) Với lợi thế của giống quýt bản địa, những năm qua, quýt vàng Bắc Sơn đã và được đẩy mạnh phát triển Tuy nhiên, quýt vàng Bắc Sơn hiện cũng đứng trước thực tế bị giảm cả diện tích phẩm cấp hàng hố Giớng qt vàng Bắc Sơn được nhân dân trồng chủ yếu quảng canh nên tỷ lệ đờng thấp, có biểu hiện suy thối mạnh giống Nguyên nhân dẫn đến việc quýt bị thối hóa giớng qt trờng lâu năm không được tuyển chọn, đa phần được trồng quảng canh, các đối tượng sâu bệnh hại ngày càng đa dạng sâu vẽ bùa (Phyllosnis Citrella), sâu đục thân đục cành (Anoplophora chinensis), nhện đỏ (Paratetranychus Citri), ruồi vàng đục quả, bệnh vàng Greening Tristeza…Đặc biệt bệnh nguy hiểm như: bệnh Greening, bệnh Tristeza nguyên nhân gây suy giảm nghiêm trọng diện tích trờng, suất chất lượng của vùng trồng quýt Bắc Sơn (Nguyễn Hữu Đống, 2003) Để giải quyết kho khăn trên, tăng suất, sản lượng nâng cao chất lượng quả cần có biện pháp tạo được giớng quýt vàng Bắc Sơn đúng giống, sạch bệnh cải tạo diện tích đất trờng bị thối hóa, chứa mầm bệnh Phương pháp nhân giớng in vitro có thể tạo lượng lớn giống quýt vàng Bắc Sơn đúng giống (cây nhân từ giống gốc), đồng hoàn toàn sạch bệnh Thực hiện nhiệm vụ cấp nhà nước “Khai thác và phát triển nguồn gen quýt vàng Bắc Sơn, Lạng Sơn và cam Mường Pồn, Điện Biên”, mã sớ: NVQG2020/ĐT.10, nhóm nghiên cứu đã tiến hành tủn chọn đầu dòng sử dụng làm vật liệu cho sản xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào Để thực hiện được điều này, nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “"Nghiên cứu nhân giống quýt vàng Bắc Sơn kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật" Đề tài thành công là sở cho sản xuất quýt vàng Bắc Sơn đem trồng điều kiện nhà lưu giữ cung cấp vật liệu cho sản xuất giống quýt vàng Bắc Sơn chất lượng cao (đồng đều, sạch bệnh) phục vụ phát triển vùng trồng nguồn gen 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu số phương pháp nhân giống quýt vàng Bắc Sơn kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật tạo tiền đề sản xuất giống chất lượng cao đáp ứng nhu cầu phát triển nguồn quýt vàng Bắc Sơn trt 12345 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The SAS System 10:38 Thursday, June 7, 2022 The GLM Procedure Dependent Variable: ty le nhiem DST Sum of Source DF Model Error Squares 66.66667 Source Source ty le nhiem DSTMean 2.886751 15343.33333 41.66667 Type III SS 15343.33333 F Value 5.00 3835.83333 83.33333 The SAS System 42.33333 Mean Square 83.33333 trt F 15493.33333 Coeff Var 0.995697 F Value 15426.66667 Corrected Total 14 R-Square Mean Square 41.66667 0.0390 460.30 Mean Square 3835.83333 F Pr > F 0.0390 460.30 F 0.0731 384.31 F 0.3455 123.22 Mean Square 11.666667 4723.333333 F Value 1.22 1180.833333 Type III SS 23.333333 F 9.583333 Root MSE DF F Value 791.111111 76.666667 Corrected Total 14 R-Square Mean Square F 0.3455 123.22 F 28.99 F 0.8404 38.59 F ty le tai sinh choi voi BAP+NAAMean 4.346135 74.44444 Type I SS Mean Square F Value Pr > F rep trt 544.444444 Source 1511.111111 DF rep trt 272.222222 302.222222 Type III SS 544.444444 The SAS System 0.0011 16.00 0.0002 Mean Square 272.222222 1511.111111 14.41 F Value 14.41 302.222222 16.00 Pr > F 0.0011 0.0002 17:28 Thursday, June 16, 2022 The GLM Procedure t Tests (LSD) for ty le tai sinh choi voi BAP+NAA NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 10 18.88889 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 7.9068 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A 90.000 Mean N trt B 80.000 3 B C B C B C B 73.333 73.333 C C D 70.000 60.000 2.6.Dependent Variable: Thi nghiem tim CDTST thich hop-he so tai sinh voi BAP The SAS System 17:25 Thursday, June 16, 2022 The GLM Procedure Class Level Information Class Levels rep Values 123 trt 1234567 Number of Observations Read 21 Number of Observations Used 21 The SAS System 17:25 Thursday, June 16, 2022 The GLM Procedure Dependent Variable: he so tai sinh choi voi BAP Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model Error 7.93466667 0.99183333 12 0.12756190 0.01063016 Corrected Total 20 Coeff Var 0.984178 7.710669 DF rep trt Root MSE 0.103103 Type I SS he so tai sinh choi voi BAP Mean 1.337143 Mean Square 0.11917143 F 0.0191 122.54 F rep 0.04361111 0.02180556 3.63 0.0651 trt 1.02237778 0.20447556 34.09 F 0.0651 34.09 F 0.1176 138.57 F 0.0011 F 0.59684762 0.07460595 239.80 F rep 0.00726667 0.00363333 11.68 0.0015 trt 0.58958095 0.09826349 315.85 F rep 0.00726667 0.00363333 11.68 0.0015 trt 0.58958095 0.09826349 315.85 F 0.07002778 R-Square Coeff Var 0.719901 3.265848 Root MSE 0.044289 chieu cao TB choi voi BAP+NAA Mean 1.356111 Source rep trt DF 0.02155778 DF rep Mean Square 0.01077889 0.02885526 Source trt Type I SS 0.02205193 Mean Square 0.0689 F Value 5.62 0.00577105 Pr > F 0.0245 2.94 0.01102596 0.02885526 The SAS System 5.50 0.00577105 Type III SS F Value 2.94 Pr > F 0.0231 0.0689 17:51 Thursday, June 16, 2022 The GLM Procedure t Tests (LSD) for chieu cao TB choi voi BAP+NAA NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 10 0.001961 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.0806 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean 1.42333 N trt A B A 1.39000 B A B A C B C B C B C B C 1.35333 3 1.34000 1.32333 C C 1.30667 3.Thí nghiệm vi ghép 3.1.Dependent Variable: Thi nghiem vi ghep-ty le ghep cong The SAS System 15:57 Thursday, June 7, 2022 The GLM Procedure Class Level Information Class rep trt Levels 3 Values 123 123 Number of Observations Read Number of Observations Used The SAS System 15:57 Thursday, June 7, 2022 The GLM Procedure Dependent Variable: vi ghep-ty le ghep cong Sum of Source DF Model Error Squares Mean Square 1733.333333 Pr > F 26.00 0.0040 433.333333 66.666667 Corrected Total F Value 16.666667 1800.000000 R-Square Coeff Var Root MSE vi ghep-ty le ghep cong Mean 0.962963 7.204382 4.082483 56.66667 Source rep DF trt Source Type I SS Mean Square 66.666667 1666.666667 DF 66.666667 trt 1666.666667 2.00 0.2500 833.333333 50.00 Mean Square 33.333333 833.333333 The SAS System Pr > F 33.333333 Type III SS rep F Value 0.0015 F Value Pr > F 2.00 0.2500 50.00 0.0015 15:57 Thursday, June 7, 2022 The GLM Procedure t Tests (LSD) for vi ghep-ty le ghep cong NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 16.66667 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 9.2548 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N trt A 73.333 B 56.667 C 40.000 3 3.2.Dependent Variable: Thi nghiem vi ghep-chieu cao DST The SAS System 16:02 Thursday, June 7, 2022 The GLM Procedure Class Level Information Class rep trt Levels 3 Values 123 123 Number of Observations Read Number of Observations Used The SAS System 16:02 Thursday, June 7, 2022 The GLM Procedure Dependent Variable: vi ghep-chieu cao tb DST Sum of Source DF Model Error 0.947192 6.406563 rep trt 2 Source rep 2 17.94 0.0081 0.00028536 Root MSE vi ghep-chieu cao tb DST Mean 0.016893 Type I SS 0.00018417 0.02010530 0.01005265 Type III SS F Value 35.23 0.0029 0.00018417 0.01005265 The SAS System Pr > F 0.65 0.5716 Mean Square 0.00036834 0.02010530 0.263677 Mean Square 0.00036834 DF Pr > F 0.02161509 Coeff Var DF F Value 0.00511841 0.00114145 R-Square Source Mean Square 0.02047365 Corrected Total trt Squares F Value Pr > F 0.65 0.5716 35.23 0.0029 16:02 Thursday, June 7, 2022 The GLM Procedure t Tests (LSD) for vi ghep-chieu cao tb DST NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.000285 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.0383 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N trt A 0.32381 B 0.25889 C 0.20833 3