Luận án Tiến sĩ Đặc tính sinh học phân tử chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN HỒI THU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦNG KLEBSIELLA PNEUMONIAE KHÁNG CARBAPENEM MANG GEN BLAKPC PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN HỒI THU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦNG KLEBSIELLA PNEUMONIAE KHÁNG CARBAPENEM MANG GEN BLAKPC PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bình Minh Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương PGS.TS Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI Hà Nội, 2011 Lời cảm ơn Trong q trình thực đề tài, tơi nhận rất nhiều giúp đỡ, tạo điều kiện thầy cô giáo, tập thể nhà khoa học Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Bình Minh PGS TS Đinh Duy Kháng, người thầy trực tiếp hướng dẫn bảo cho hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS Trần Huy Hoàng, người theo sát, hướng dẫn, nhắc nhở động viên tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, lãnh đạo khoa Vi khuẩn, đồng nghiệp phịng thí nghiệm Kháng sinh, phịng thí nghiệm Vi khuẩn đường ruột phòng Quản lý chất lượng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương tạo điều kiện, đồng hành, chia sẻ giúp đỡ suốt q trình thực luận án Tơi xin bày tỏ biết ơn chân thành tới lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, PGS TS Đồng Văn Quyền anh chị phịng thí nghiệm Vi sinh phân tử, ThS Bùi Thị Hải Hà phòng Quản lý tổng hợp, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tơi q trình học tập Cuối đặc biệt quan trọng, xin dành tất yêu thương lời cảm ơn tới gia đình, nơi hậu phương vững niềm động viên mạnh mẽ giúp tơi hồn thành luận án Nguyễn Hồi Thu Lời cam đoan Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2018 Tác giả Nguyễn Hoài Thu MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Klebsiella pneumoniae gây bệnh người 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Vai trò gây bệnh 1.2 Kháng sinh carbapenem 1.2.1 Giới thiệu chung kháng sinh 1.2.2 Kháng sinh carbapenem 1.3 Klebsiella pneumoniae kháng kháng sinh qua chế sinh KPC 1.3.1 Đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn 1.3.2 Đặc tính kháng carbapenem 11 1.3.3 Đặc điểm dịch tễ học Klebsiella pneumoniae sinh KPC 17 1.3.4 Đặc tính phân tử chủng Klebsiella pneumoniae sinh KPC 23 1.4 Các đường lan truyền gen kháng kháng sinh blaKPC 27 1.4.1 Các yếu tố tiếp hợp (plasmid) 27 1.4.2 Các yếu tố tiếp hợp (hòa nhập) 29 1.5 Kiểm soát nhiễm khuẩn Klebsiella pneumoniae kháng đa kháng sinh 30 1.6 Các kỹ thuật nghiên cứu đặc tính vi khuẩn kháng carbapenem mang gen blaKPC 31 1.6.1 Các thử nghiệm xác định mức độ đề kháng kháng sinh 31 1.6.2 Kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu gen kháng kháng sinh 33 1.6.3 Kỹ thuật dịch tễ học phân tử 35 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Địa điểm nghiên cứu 40 2.2 Đối tượng cỡ mẫu nghiên cứu 40 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 41 2.3 Phương pháp nghiên cứu 41 2.3.1 Quy trình nghiên cứu 41 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 42 2.3.3 Thử nghiệm xác định mức độ đề kháng kháng sinh 42 2.3.4 PCR phát gen blaKPC kháng carbapenem 43 2.3.5 Giải trình tự gen kháng kháng sinh 44 2.3.6 PCR phát gen ESBL 45 2.3.7 Phát plasmid mang gen kháng kháng sinh 46 2.3.8 Thử nghiệm khả truyền plasmid mang gen blaKPC 46 2.3.9 Xác định mối liên hệ kiểu gen chủng Klebsiella pneumoniae kỹ thuật PFGE 47 2.3.10 Xác định mối liên hệ kiểu gen chủng Klebsiella pneumoniae kỹ thuật MLST 48 2.4 Phương pháp phân tích kết 49 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 3.1 Xác định đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC chủng Klebsiella pneumoniae 50 3.1.1 Phát Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem 50 3.1.2 Phát Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 52 3.1.3 Kết giải trình tự gen blaKPC 54 3.1.4 Mức độ đề kháng kháng sinh Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC 55 3.1.4.1 Thử nghiệm khoanh giấy kháng sinh 55 3.1.4.2 Thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu 57 3.1.5 Phát vi khuẩn mang gen ESBL chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 62 3.1.6 Một số đặc điểm bệnh nhân nhiễm khuẩn Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 65 3.2 Xác định khả truyền gen kháng kháng sinh chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 68 3.2.1 Phát plasmid mang gen blaKPC 68 3.2.2 Thử nghiệm khả truyền plasmid mang gen blaKPC 70 3.3 Xác định đặc tính dịch tễ học phân tử chủng Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC 72 3.3.1 Kết PFGE 72 3.3.2 Kết MLST 76 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ 80 4.1 Đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC chủng Klebsiella pneumoniae phân lập ba bệnh viện địa bàn Hà Nội 80 4.1.1 Phát Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 80 4.1.2 Kết giải trình tự gen blaKPC 83 4.1.3 Mức độ đề kháng kháng sinh Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC 83 4.1.4 Phát vi khuẩn mang gen ESBL chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 87 4.2 Khả lan truyền gen kháng kháng sinh chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 89 4.2.1 Phát plasmid mang gen blaKPC 89 4.2.2 Thử nghiệm khả truyền plasmid mang gen blaKPC 90 4.3 Đặc tính dịch tễ học phân tử Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC 93 4.3.1 Khảo sát mối liên hệ kiểu gen chủng kỹ thuật PFGE 93 4.3.2 Khảo sát mối liên hệ kiểu gen chủng kỹ thuật MLST 96 4.4 Bàn luận hướng nghiên cứu 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 100 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 PHẦN PHỤ LỤC PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN TRONG NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC QUY TRÌNH CHẠY PFGE VÀ SOUTHERN BLOT PHỤ LỤC HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA GEN BLAKPC 11 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA CÁC GEN GIỮ NHÀ 13 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PFGE 17 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích ADN Axit deoxyribonucleic ADH Arginine Dihydrolase AM Ampicillin AMC Amoxicillin + clavunalate AMY amygdalin ATCC American Type Culture Collection (Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ) ATM Aztreonam ARA Arabinose bp Base pair (đơn vị đo trọng lượng ADN) CAZ Ceftazidime CDC Centre for Disease for Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát phòng ngừa dịch bệnh Mỹ) CEF Cefixime CF Cephalothin CIP Ciprofloxacin CLSI Clinical laboratory standards institute (Viện chuẩn thức Lâm sàng phòng xét nghiệm Mỹ) CRKP Carbapenem resistant K pneumoniae (K pneumoniae kháng carbapenem) CRO Ceftriaxone CTX Cefotaxim CTX Cefotaxime CTX-M Cefotaximase CXM Cefuroxim CIT Citrate utilization DCA deoxycholate citrate agar ESBL Extended-spectrum beta lactamase FEP Cefepime gapA Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GEL Gelatinase GM Gentamicin GLU Glucose ICE Intergrative conjugative element (Yếu tố tiếp hợp hòa nhập) IND Indole INO Inosito infB translation initiation factor IPM Imipenem KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase (Enzym kháng carbapenem phát chủng Klebsiella pneumoniae) LB Luria-Bertani LDC Lysine Decarboxylase MAN Mannito MBLs Metallo-beta-lactamase mdh malate dehydrogenase MEL Melibiose MEM Meropenem PHỤ LỤC QUY TRÌNH CHẠY PFGE VÀ SOUTHERN BLOT Ngày 1: KỸ THUẬT PFGE: Cấy chủng vi khuẩn mang gen blaKPC vào đĩa thạch Muller-Hinton (Biorad) có chứa 2µg/ml imipenem Ủ 37oC 24 Lấy 4-5 khuẩn lạc đĩa thạch Muller-Hinton trộn vào 200 µl dung dịch đệm TE Nhỏ 200 µl dung dịch thạch Seakem gold 1%, trộn Nhỏ hỗn dịch vào khuôn tạo gel để tao plug đợi thạch đông Chuyển plug sang tube ml có chứa 2ml dung dịch lysis buffer (1mg/ml protein K, 1% N-Lauroryl sarcosin 0.5M EDTA pH 8.0) Ủ qua đêm tube 550C bể ủ nhiệt, lắc nhẹ nhàng SOUTHERN BLOT: Đánh dấu đoạn dò gen blaKPC - Khuếch đại gen blaKPC phản ứng PCR (Applied Biosystem) (tương tự mục 2.2.4) - Tinh sản phẩm PCR blaKPC kit tinh QIAGEN - Biến tính 100 ng sản phẩm PCR (10µl) cách đun sơi bể ủ nhiệt phút Làm lạnh ADN cách cho vào hộp đá bào phút - Nhỏ 10µl dung dịch hóa chất đánh dấu ADN (ECLTM Amersham) - Nhỏ 10µl dung dịch glutaraldehyde, lắc tập trung hỗn dịch cách ly tâm nhẹ Ủ 20 phút 37oC - Sản phẩm blaKPC sau đánh dấu không sử dụng giữ 30% glycerol (-15) đến (-30)oC tháng Thực kỹ thuật S1-PFGE • Cấy chủng vi khuẩn mang gen blaKPC vào đĩa thạch Muller-Hinton có chứa 2µg/ml imipenem Ủ 37oC 24 • Lấy khuẩn lạc đĩa thạch Muller-Hinton cấy vào 5ml môi trường canh thang LB ủ qua đêm có chứa 1µg IMP/ml • Lấy 50µl dịch ni cấy qua đêm cho vào 5ml canh thang LB lắc 37 oC trong • Ly tâm 2100 vịng/10 phút loại dịch • Rửa cặn tế bào ml dung dịch TE • Hồn ngun cặn tế bào vi khuẩn 500 àl dung dch m TE ã Nh 500àl dung dịch thạch Seakem gold 1%, trộn • Nhỏ hỗn dịch vào khuôn tạo gel để tao plug đợi thạch đơng • Chuyển plug sang tube 2ml có chứa 2ml dụng dịch lysis buffer (1mg/ml protein K, 1% N-lauroylsarcosin 0.5M EDTA pH 8.0) • Ủ qua đêm tube 55oC bể ủ nhiệt, lắc nhẹ nhàng Ngày 2: Cắt miếng thạch có chiều dày khoảng mm từ miếng plug Cho miếng thạch cắt vào ml microtube Rửa miếng thạch 1ml nước siêu (đã ủ ấm 55oC) 10-15 phút x lần Rửa miếng thạch 1ml dung dịch TE (đã ủ ấm 55oC) 1015 phút x lần Rửa miếng thạch 200 µl dung dich đệm emzyme S1, ủ ấm 37oC 10-15 phút Thành phần H2O µl/Plug Slide 12 Plug slide 180 2160 10X S1 buffer 20 240 Total Volume 200 2400 Rửa miếng thạch chủng S braenderup 200 µl dung dich đệm emzyme XbaI, ủ ấm 370C 10-15 phút Thành phần µl/Plug Slide Plug slide H2O 180 360 10X XbaI buffer 20 40 Total Volume 200 400 Loại bỏ dung dịch đệm enzyme S1 XbaI pipet Cắt loại bỏ ADN nhiễm sắc thể vi khuẩn enzyme S1 nồng độ 20 UI/200 µl dung dịch đệm emzyme S1, ủ 37oC vòng 1-2 Thành phần µl/Plug Slide 12 Plug slide H2O 177 2124 10X Buffer 20 240 BSA 10mg/ml 24 S1 Enzyme (Promega) 12 200 2400 Total Volume Loại bỏ hỗn dịch enzyme rửa miếng plug lần sau cắt dung dịch TE 1X lạnh (trong vòng 20-30 phút) 10 Chủng S braenderup rửa đệm cắt enzyme XbaI, 40UI/phản ứng cắt 37oC 6-8 Thành phần µl/Plug Slide Plug slide H2O 172 344 10X Buffer 20 40 BSA 10mg/ml XbaI Enzyme (10U/µl) 12 200 400 Total Volume 11 Chuẩn bị thạch điện di 1%: Cân 0.5 g thạch Seakem gold cho vào 50ml dung dịch đệm TBE 0,5X chai có nắp xốy, đun sơi microwave cho thạch tan hoàn toàn Giữ chai thạch water-bath nhiệt độ 55-60oC 12 Rửa miếng thạch sau cắt enzyme 13 Loại bỏ toàn hỗn hợp cắt enzyme pipeting: Rửa miếng thạch dung dịch TE làm lạnh 30 phút X lần ngâm miếng thạch 200 µl TBE 0,5X 14 Đặt miếng thạch vào đầu lược theo bước sau 15 Đặt miếng thạch S braenderup vào đậu lược vị trí 1, 5, 10 15 16 đặt các thạch mẫu thí nghiệm vào vị trí lược cịn lại 17 Thấm dung dịch đệm thừa giấy thấm Để khô tự nhiên nhiệt độ phịng phút 18 Đặt lược vào khn đổ thạch 19 Đổ thạch vào khuôn đợi thạch đông 20 Làm lạnh hệ thống điện di (14oC), bật nguồn điện hệ thống bơm (đặt chế độ 70 để chạy tốc độ lít/1 phút) 21 Tháo lược sau thạch đơng hồn toàn (khoảng 30-40 phút sau đổ thạch 22 Sử dụng thạch Seakem gold 1% chưa đông 55-60oC để lấp kín lỗ lược 23 Sản phẩm cắt ADN điện di điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif) thạch horizontal 1%, hiệu điện 6V/cm 19 nhiệt độ 14oC, thời gian xung từ 25 đến 60s và góc điện trường 120o Ngày 3: Sau điện di nhuộm dung dịch ethidium bromide 30 phút Rửa thạch điện di nước 60-90 phút, thay nước rửa 20 phút/ lần Chụp ảnh gel máy chụp ảnh Gel-doc Chuyển DNA plasmid sang màng lai Hybond-N, Amersham Hóa chất: - Dung dịch depurination: HCL 0,25 M - Dung dịch - Biến tính: 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH - Dung dịch trung hòa:1.0 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5 - Dung dịch SSC 20x Tiến hành: Rửa gel 250 ml dung dịch HCL 0,25 M 30 phút (depurination solution) Rửa gel 250 ml dung dịch biến tính (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) Rửa gel 300 ml dung dịch trung hòa (1.0 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5) Nhúng ướt miếng đệm (porous) hộp chuyển màng vào H2O sau đặt trở lại hộp chuyển màng Cắt miếng giấy lọc màng lai kích thước miếng thạch điện di PFGE Cắt khung plastic có kích thước ngắn miếng thạch khoảng 3-10mm tất hướng Đặt khung plastic lên miếng đệm (porous) để tạo vị trí để đặt giấy lọc, màng lai miếng thạch PFGE Nhúng ướt miếng giấy lọc số H2O vô trùng đặt lên khung plastic sau nhấc khung plastic 8 Đặt màng lai (màng lai Hybond-N, Amersham) sau nhúng ướt với H2O vô trùng lên miếng giấy lọc số sau đặt lên miếng giấy lọc số (loại bỏ bọt khí) Đặt trở lại khung plastic lên miếng giấy lọc màng lai 10 Đặt miếng thạch lên khung plastic (loại bỏ bọt khí) 11 Sử dung thạch Seakem gold 1% pha TBE 1X để hàn xung quanh miếng thạch đổ lên khung plastic để hàn kín chỗ dò rỉ 12 Phủ miếng thạch PFGE dung dịch chuyển màng SSC 20X (3 M NaCl, 300 mM NaCitrate, pH 7.0) 13 Đặt ấp lực hút chân không 50 mbar hút chân khơng vịng 90 phút 14 Tắt bơm hút chân không loại bỏ miếng thạch PFGE 15 Lấy màng lai khỏi hộp chuyển màng rửa dung dịch chuyển màng SSC 20X 10 phút sau làm khơ vịng 15 phút nhiệt độ phịng thí nghiệm 16 Màng lai sau xử lý tia cực tím (UV-cross linking) cường độ 150 mJ phút (nếu chưa sử dụng mang lai rửa H2O làm khơ khơng khí sau gói giấy bạc giữ 4oC 17 Hiệu xuất chuyển màng đánh giá cách nhuộm lại miếng thạch PFGE chụp lại ảnh máy chụp Gel-Doc Ngày 4: Kỹ thuật Southern blot Hóa chất: Dung dịch tiền lai (prehybridization): 100ml • • - Hóa chất phủ màng blocking reagent (5%w/v) - NaCl (Nồng độ cuối 0.5 M) - Hybridization buffer Dung dịch lai (hybridization): Nhỏ 60 μl Sản phẩm PCR blaKPC đánh dấu kít ECL vào 20 ml dung dịch tiền lai (pre-hybridization) • Dung dịch rửa màng: - Dung dịch rửa khơng có Urea (primary buffer): SDS g 20 x SSC 25 ml Cho thêm nước vào cho đủ 1000 ml , giữ 2-80C sử dụng tháng - Dung dịch rửa màng 2: 2x SSC (100 ml 20x SSC 900 ml H2O) Hiện màng (sử dụng Kit ECl) - Trộn dung dịch A dung dịch B với tỷ lệ 40:1 - Nhỏ dung dịch lên màng ủ nhiệt độ phòng phút - Sử dụng Hyper film để phát Phân tích kết quả: Sử dụng ảnh chụp gen plasmid trước ảnh plasmid sau lai để phát số lượng kích thước plasmid mang gen blaKPC 10 PHỤ LỤC KẾT QUẢ HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA GEN BLAKPC 847/XP/2012 1202/TN/2013 11 1555/VĐ/2014 12 PHỤ LỤC KẾT QUẢ HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA CÁC GEN GIỮ NHÀ Trình tự gen gapA Trình tự gen infB 13 Trình tự gen gen mdh Trình tự gen pgi 14 Trình tự gen phoE Trình tự gen rpoB 15 Trình tự gen tonB 16 PHỤ LỤC KẾT QUẢ PFGE 17 18