Nhóm 2 Kiểm Nghiệm Vi Sinh.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SI[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực : NHĨM Niên khóa : 2021 – 2025 Tháng 02 năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực Ts TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG ĐẶNG THỊ HẰNG ThS LÊ PHƯỚC THỌ HỒ CÔNG TÙNG NGUYỄN PHƯƠNG LAN NHI VÕ HỒNG PHẨM LÊ DĂNG DÂNG NGUYỄN THỊ MINH HẠNH Tháng 02 năm 2023 MỤC LỤC Trang DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH SÁCH CÁC BẢNG ii DANH SÁCH CÁC HÌNH iii BÀI ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Vật liệu 1.2.2 Phương pháp nghiên cứu 1.3 Định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc 1.3.1 Quy trình định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc 1.3.2.1 Biện luận 1.3.2.2 Kết 1.4 Quy trình định lượng E coli phương pháp đếm khuẩn lạc 1.4.1 Vật liệu 1.4.3.1 Kết 1.4.3.2 Biện luận 1.5 Định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN 1.5.2.1 Kết 1.5.2.2 Biện luận BÀI ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 2.1 Quy trình kết 2.2 Biện luận BÀI ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 10 3.1 Các bước tiến hành 10 3.2 Kết vi khuẩn hiếu khí 10 3.3 Kết nấm men, nấm mốc 11 3.4 Kết luận 11 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BGBL: Brilliant Green Bile Broth Lactose EC: E coli medium LSB: Lauryl Sulphate Broth TBX: Thạch trypton - mật – glucuronid BPW: Buffered Pepton Water RV: Rappaport - Vassiliadis Soya Peptone HE: Hektoen Entric Agar VP: Voges - Proskauer KIA: Kliger Iron Agar PCA: Plate Agar TSA: Tryptone Soya Agar VRBL: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể BPA: Baird – Parker Agar DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar EMB: Eosin Methylene Blue Agar MPN: Most Probable Number i DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1 Kết đếm khuẩn lạc Coliforms Bảng 2.1 So sánh kết thử nghiệm sinh hóa Salmonella 12 ii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Kết cấy mẫu nồng độ 10-1 môi trường VRBL Hình 1.2 Kết cấy mẫu nồng độ 10-2 môi trường VRBL Hình 1.3 Kết cấy mẫu môi trường TBX Hình 1.5 Mẫu mơi trường BGBL Hình 1.6 Mẫu mơi trường EC Hình 1.7 Mẫu sau cấy lên thạch EMB Hình 2.1 Cân mẫu đồng mẫu Hình 2.2 Phân lập khuẩn lạc đơn môi trường HE Hình 2.3 Kết qua thử nghiệm sinh hóa Hình 3.1 Cấy mẫu mơi trường PCA lần 10 Hình 3.2 Cấy mẫu mơi trường PCA lần 11 Hình 3.3 Cấy mẫu mơi trường DRBC 11 iii Bài ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1.1 Đặt vấn đề Coliforms trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí kị khí có khả lên men lactose sinh acid sinh 37℃ 24 Coliforms xem chất thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay loại mẫu môi trường dung để thị khả diện loài vi sinh vật Nhóm Coliforms gồm giống: E coli, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella 1.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Vật liệu Mẫu thí nghiệm: sữa đậu nành chợ Thiết bị: Tủ cấy, dụng cụ thí nghiệm Hóa chất: Mơi trường cấy VRBL (Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể) 1.2.2 Phương pháp nghiên cứu Nhóm thực theo hai phương pháp đếm khuẩn lạc phương pháp MPN 1.3 Định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc 1.3.1 Quy trình định lượng Coliforms theo phương pháp đếm khuẩn lạc Bước 1: Chuẩn bị mẫu đồng pha lỗng mẫu có nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Bước 2: Chuyển ml nồng độ vào đĩa petri, nồng độ thực lần Bước 3: Rót mơi trường VRBL vào đĩa petri có mẫu đổ mơi trường đĩa trộn với dịch cấy Bước 4: Sau trộn mẫu đợi cho đông đặc đem ủ nhiệt độ 37℃ 24 Bước 5: Chọn đĩa petri có số lượng khuẩn lạc từ 10 - 150, đếm khuẩn lạc điển hình có màu đỏ tía có đường kính 0,5 mm trở lên (đơi vùng có mật độ tủa đỏ bao quanh) Bước 6: Xác định mật số Coliforms Lưu ý: Nếu có khuẩn lạc có hình thái khơng điển hình đếm chọn khuẩn lạc cấy vào ống nghiệm chứa môi trường canh thang mật 1.3.2 Kết biện luận Sau ủ qua 24 37℃ b) a) Hình 1.1 Kết cấy mẫu nồng độ 10-1 môi trường VRBL a) b) Hình 1.2 Kết cấy mẫu nồng độ 10-2 môi trường VRBL 1.3.2.1 Biện luận Vi khuẩn Coliforms Hình 1.1a Hình 1.1b có nồng độ pha lỗng 10-1 nhìn khuẩn lạc hai hình ta thấy Hình 1.1a nhìn rõ khuẩn lạc so với Hình 1.1b Vi khuẩn Coliforms Hình 1.2a Hình 1.2b có nồng độ pha loãng 10-2 37℃ 24 khuẩn lạc khơng có Hình 1.2a Hình 1.2b vùng mật tủa đỏ bao quanh Khi nhìn vào hình ta thấy mẫu Hình 1.1, thấy chung nồng độ pha lỗng có đĩa petri thấy rõ có đĩa khơng thấy Hình 1.2, không xuất khuẩn lạc đặc trưng 1.3.2.2 Kết Bảng 1.1 Kết đếm khuẩn lạc Coliforms Nồng độ pha loãng N= ∑𝑎 𝑉∗(𝑛1 +0,1 𝑛2 Số lượng khuẩn lạc Lần Lần 10-2 120 118 10-3 18 27 = )∗𝑑 18+27+120+118 1∗(2+0,1∗2)∗10−2 = 1,3 ∗ 104 (CFU/ml) 1.4 Quy trình định lượng E coli phương pháp đếm khuẩn lạc 1.4.1 Vật liệu Mẫu thí nghiệm: Sữa đậu nành chợ Thiết bị: Tủ cấy dụng cụ thí nghiệm Hóa chất: Mơi trường TBX hóa chất khác 1.4.2 Quy trình định lượng E coli phương pháp đếm khuẩn lạc Bước 1: Đồng pha lỗng mẫu có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Bước 2: Chuyển 0,1 ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào đĩa petri môi trường thạch TBX, nồng độ lặp lại hai lần Bước 3: Cấy trải khơ ủ vịng 24 44℃ Bước 4: Chọn đĩa petri có số lượng khuẩn lạc điển hình (có màu xanh) nhỏ 150 tổng số khuẩn lạc nhỏ 300 (gồm điển hình khơng điển hình) Bước 5: Tính tốn kết mật độ E coli 1.4.3 Kết biện luận 1.4.3.1 Kết a) b) c) Hình 1.3 Kết cấy mẫu mơi trường TBX (a) mẫu nồng độ 10-1, (b) mẫu nồng độ 10-2, (c) mẫu nồng độ 10-3 1.4.3.2 Biện luận Khi nhìn vào hình ta thấy qua Hình 1.3a, nồng độ 10-3 có khuẩn lạc so sánh với mật độ khác mật độ khuẩn lạc khác Hình 1.3b, mật độ khuẩn lạc thấp lại dính vào khó để đếm khuẩn lạc Hình 1.3c, số lượng khuẩn lạc thấp khuẩn lạc hình khơng có khuẩn lạc đặc trưng nên khơng có E coli mẫu 1.5 Định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN 1.5.1 Quy trình định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN Bước 1: Chuẩn bị mẫu đồng pha lỗng mẫu để có nồng độ 10−1 , 10−2 , 10−3 Bước 2: Chuyển ml nồng độ 10-1, 10-2,10-3 vào vào ống 10 ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 37℃, 48 Bước 3: Định lượng Coliforms: cấy vào ống môi trường BGBL, ủ 37℃, 48 Định lượng E coli: cấy vào ống môi trường EC, ủ 44,5℃, 24 Bước 4: Sau ủ thấy có ống sinh mơi trường EC đem cấy ria lên thạch EMB, ủ 37℃, 24 Bước 5: Sau ủ có xuất khuẩn lạc đặc trưng (có ánh kim xanh) đem cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate ủ 44,5℃, 24 Làm thử nghiệm IMViC, đếm số ống EC dương tính tra bảng MPN 1.5.2 Kết biện luận 1.5.2.1 Kết Mẫu pha loãng tăng sinh môi trường LSB sau ủ 37℃, 48 Hình 1.4 Mẫu mơi trường LSB Tất ống nghiệm có tượng sinh nên dương tính Lấy ống nghiệm nồng độ pha loãng 10−1 , 10−2 , 10−3 cấy vào môi trường BGBL để xem diện Coliforms môi trường EC để xem sử diện E coli Hình 1.5 Mẫu môi trường BGBL (sau ủ 37℃, 48 giờ) Quan sát Hình 1.5 ta thấy mẫu sau ủ mơi trường BGBL có xuất bọt khí chứng tỏ mẫu có Coliforms Tất ống nồng độ pha loãng 10−1 , 10−2 , 10−3 bọt khí Từ đó, ta tra bảng số MPN có kết 1,1*103 MPN/100 ml Hình 1.6 Mẫu mơi trường EC (sau ủ 44,5℃, 24 giờ) Quan sát Hình 1.6, mẫu sau ủ mơi trường EC có xuất bọt khí ống độ pha loãng 10−1 , ống độ pha loãng 10−2 ống độ pha loãng 10−3 Vì vậy, ta nghi ngờ có xuất E coli Khi nghi ngờ có xuất E coli, ta đem ống bọt khí nồng độ pha lỗng đem cấy lên đĩa chứa môi trường EMB ủ 37℃, 24 Hình 1.7 Mẫu sau cấy lên thạch EMB Quan sát Hình 1.7 ta thấy mẫu khơng có xuất khuẩn lạc đặc trưng chứng tỏ không E coli 1.5.2.2 Biện luận Sau cấy vào ống mơi trường BGBL tất ống xuất bọt khí nên tra bảng ta có số MPN lớn 110 Từ ta có kết 1,1*103 MPN/100 ml Trên thực tế ta cần phải pha lỗng thêm nồng độ 10−4 , 10−5 , 10−6 , để tính kết học thực hành nên cần pha loãng nồng độ 10−1 , 10−2 , 10−3 Sau cấy mẫu đĩa EMB ta quan sát khơng thấy có khuẩn lạc đặc trưng chứng tỏ khơng có E coli nên không cần thực phản ứng sinh hóa để đinh lượng E coli Đĩa cấy nhóm cấy khơng nên khơng xuất rõ khuẩn lạc ba đường cấy BÀI ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 2.1 Quy trình kết Giai đoạn 1: Đồng mẫu môi trường tăng sinh BPW (tăng sinh) Chuẩn bị: Mẫu: cá biển tươi Môi trường tăng sinh: Dung dịch Buffered Pepton Water (BPW) Bước tiến hành: Tiến hành cân 10 g mẫu túi PE vô trùng, bổ sung 90 ml dung dịch BPW đồng mẫu Stomacher 15 30 giây Ủ 37oC, 18 – 24 Giai đoạn 2: Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV (tăng sinh chọn lọc) Hình 2.1 Cân mẫu đồng mẫu Chuẩn bị: Dịch tăng sinh: mẫu BPW ủ Môi trường tăng sinh: Rappaport - Vassiliadis Soya Pepton (RV) Bước tiến hành: Lắc để trộn dịch tăng sinh, chuyển 0,1 ml sang 10 ml môi trường tăng sinh RV ủ ấm 42oC Ủ 42oC, 18 – 24 Khi cần thiết kéo dài thời gian ủ thêm 24 Giai đoạn 3: Phân lập khuẩn lạc đơn môi trường chọn lọc đặc biệt (Phân lập nhận diện) Chuẩn bị: Dịch tăng sinh chọn lọc Môi trường: Hektoen Entric Agar.(HE) Bước tiến hành: Dùng que cấy vòng thực kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella, sử dụng môi trường HE Hình 2.2 Phân lập khuẩn lạc đơn mơi trường HE Kết quả: (+) Khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay khơng có tâm đen Một số dịng Salmonella có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc Giai đoạn 4: Thử nghiệm sinh hóa Chuẩn bị: Đĩa mơi trường HE chứa khuẩn lạc Môi trường: Indol, Voges-Proskauer (VP), Kligler Iron Agar (KIA) Bước tiến hành: Dùng que cấy vòng cấy khuẩn lạc nghi ngờ từ đĩa cấy ria vào ống nghiệm chứa môi trường Indol VP Cho – giọt Kovacs vào ống chứa Indol Cho 10 giọt alpha – naphthol 5% giọt KOH 40% vào ống chứa VP Dùng que cấy thẳng cấy khuẩn lạc nghi ngờ từ đĩa cấy ria vào ống nghiệm chứa môi trường KIA Kết quả: a) b) KIA (+) màu đen xuất → có q trình c) khử lưu huỳnh sinh H2S VP (-) không đổi màu môi trường Indol (+) xuất lớp màu đỏ bề mặt mơi trường Hình 2.3 Kết qua thử nghiệm sinh hóa a) Thử nghiệm Indol; b) Thử nghiệm VP; c) Thử nghiệm KIA 2.2 Biện luận Bảng 2.1 So sánh kết thử nghiệm sinh hóa Salmonella Thử nghiệm Indol VP KIA Dự đoán - - + Thực tế + - + (+): dương tính, có tượng sảy ra, (-): âm tính, khơng có tượng sảy Thử nghiệm sinh hóa bị sai kết so với dự đốn q trình làm bị tạp nhiễm có nhiều nguyên nhân xảy như: Nguyên nhân khách quan: Do thuốc thử bị hư hỏng có vấn đề từ trước, nồi hấp có vấn đề Nguyên nhân chủ quan: Do thao tác cấy chưa kỹ thuật, để nút bịt kín ống bị nhiễm khuẩn, chưa khử trùng kĩ tủ cấy, chưa hơ kĩ đầu ống nghiệm, chưa lấy khuẩn lạc điển hình Chính có ngun nhân chủ quan lẫn khách quan nên chưa thể khẳng định mẫu thử có Salmonella Cần thực lại phản ứng sinh hóa để có kết xác BÀI ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 3.1 Các bước tiến hành Bước 1: Chuẩn bị 10 g mẫu mì tươi Bước 2: Đồng pha lỗng mẫu để có độ pha lỗng 10-1; 10-2; 10-3 Bước 3: Kiểm tra diện vi khuẩn hiếu khí Cấy trang 0,1 ml lên đĩa chứa môi trường thạch PCA, nồng độ lặp lại đĩa Ủ 30oC 24 Chọn đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25 - 250 để đếm Ghi nhận kết Bước 4: Kiểm tra diện nấm men, nấm mốc Cấy trang 0.1 ml mẫu lên đĩa DRBC, ủ ngữa đĩa 25℃, - ngày, nồng độ lặp lại đĩa Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men Ghi nhận kết Bước 5: Tính kết tổng số vi khuẩn hiếu khí tổng nấm men, nấm mốc mẫu (CFU/g CFU/ml) 3.2 Kết vi khuẩn hiếu Sau ủ 30℃, 24 Hình 3.1 Cấy mẫu môi trường PCA lần (a) Chụp mẫu nồng độ pha loãng 10-1; (b) Chụp mẫu nồng độ pha loãng 10-2; (c) Chụp mẫu nồng độ pha lỗng 10-3 10 Hình 3.2 Cấy mẫu mơi trường PCA lần (a) Chụp mẫu nồng độ pha loãng 10-1; (b) Chụp mẫu nồng độ pha loãng 10-2; (c) Chụp mẫu nồng độ pha loãng 10-3 Dựa vào Hình 3.1 cho thấy nồng độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3 có xuất vi khuẩn hiếu khí Biện luận Nồng độ 10-1, 10-2 ta thấy mật số vi khuẩn xuất cao 250 khuẩn lạc Ở nồng độ không đếm mật số vi khuẩn Nồng độ 10-3 ta đếm đuợc mật số vi khuẩn khuẩn lạc xuất với mật số thấp dao động từ 25 - 250 Dựa vào phương pháp CFU, ta đếm mật số vi khuẩn hiếu khí nồng độ pha lỗng 10-3 có 90 khuẩn lạc Áp dụng công thức: 𝐴= ∑ n∗V∗d = 90 1∗0.1∗10−3 = ∗ 105 (CFU/g) Ở Hình 3.2 trình cấy, thao tác cấy trang chưa khô nên không tạo khuẩn lạc 3.3 Kết nấm men, nấm mốc Mẫu sau ủ 250C sau – ngày a) b) c) Hình 3.3 Cấy mẫu mơi trường DRBC a), b) nồng dộ pha loãng 10-1; c) mẫu cấy nồng độ pha loãng 10-3 Biện luận: dựa vào Hình 3.3a, Hình 3.3b cho thấy mẫu nồng độ pha lỗng 10-1 khơng có diện nấm men, nấm mốc Ở Hình 3.3c đĩa cấy bị lỗi nguyên nhân thạch bị đổ mỏng cấy khô 3.4 Kết luận Trong 10 g mì tươi mật số xuất vi sinh vật hiếu khí 9*105 CFU/g (nhỏ 106) nằm giới hạn cho phép sử dụng 11