BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành D420201 Chuyên ngành C[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành : D420201 Chun ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực : NHÓM ( 08/05 – 12/05 ) Niên khóa : 2021 – 2025 TP Thủ Đức, 05/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực TS TRƢƠNG PHƢỚC THIÊN HOÀNG ĐỖ TIẾN ĐẠT ThS LÊ PHƢỚC THỌ VÕ LINH THƢ VŨ ĐÌNH BÌNH VÕ THỊ BÍCH ĐÀO NGUYỄN ĐINH BẢO TRÂN NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH TP Thủ Đức, 05/2023 MỤC LỤC Trang DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH SÁCH CÁC HÌNH ii BÀI ĐỊNH LƢỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1.1 Định lƣợng Coliforms phƣơng pháp CFU 1.1.1 Kết 1.1.2 Thảo luận 1.1.3 Kết luận 1.1.4 Kiến nghị 1.2 Định lƣợng E coli phƣơng pháp CFU 1.2.1 Kết 1.2.2 Thảo luận 1.2.3 Kết luận 1.2.4 Kiến nghị 1.3 Định lƣợng Coliforms phƣơng pháp MPN 1.3.1 Kết 1.3.2 Thảo luận 1.3.3 Kết luận 1.3.4 Kiến nghị 1.4 Định lƣợng E coli phƣơng pháp MPN 1.4.1 Kết 1.4.2 Thảo luận 1.4.3 Kết luận 1.4.4 Kiến nghị BÀI ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 2.1 Kết 2.2 Thảo luận 2.3 Kết luận 2.4 Kiến nghị BÀI ĐỊNH LƢỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC 3.1 Kết 3.1.1 Vi khuẩn hiếu khí 3.1.2 Nấm men – nấm mốc 3.2 Thảo luận 10 3.3 Kết luận 10 3.2.1 Vi khuẩn hiếu khí 10 3.2.2 Nấm men – nấm mốc 11 3.4 Kiến nghị 11 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU : Colony Forming Unit ĐC : Đối chứng DRBC : Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar EC : E coli medium EMB : Eosin Methylene Blue Agar HE : Hektoen Entric Agar iC : Citrate IN : Indole KIA : Kligler Iron Agar LSB : Lauryl Sulphate Broth MPN : Most Probable Number MR : Methyl Red PCA : Plate Conut Agar RV : Rappapost-Vassiliadis Soya Pepton TBX : Tryptone Bile X – glucuronide VP : Voges-Proskauer VRBL : Violet Red Bile Agar i DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Mẫu sữa bắp cấy môi trƣờng VRBL Hình 1.2 Mẫu sữa bắp cấy môi trƣờng TBX Hình 1.3 Mẫu sữa bắp mơi trƣờng LSB Hình 1.4 Dịch cấy mơi trƣờng BGBL Hình 1.5 Dịch cấy môi trƣờng EC Hình 1.6 Cấy ria ống dƣơng tính mơi trƣờng EMB Hình 1.7 Kết thử nghiệm IMViC Hình 2.1 Mẫu thịt heo cấy môi trƣờng HE Hình 2.2 Kết thử nghiệm Hình 3.1 Mẫu gạo sau cấy môi trƣờng PCA Hình 3.2 Mẫu gạo sau cấy mơi trƣờng DRBC 10 ii BÀI ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1.1 Định lượng Coliforms phương pháp CFU 1.1.1 Kết Sau cấy đổ mẫu sữa bắp môi trƣờng VRBL ủ 37℃ 24 ta đƣợc kết Hình 1.1 Mẫu sữa bắp cấy mơi trƣờng VRBL (a) Độ pha loãng 10-1 lần 1; (b) Độ pha loãng 10-1 lần 2; (c) Độ pha loãng 10-2 lần 1; (d) Độ pha loãng 10-2 lần 2; (e) Độ pha loãng 10-3 lần 1; (f) Độ pha loãng 10-3 lần 1.1.2 Thảo luận Trên đĩa độ pha lỗng 10-1 có mọc khuẩn lạc, nhƣng chúng khơng có hình dạng đặc trƣng Coliforms (màu đỏ tía có đƣờng kính 0,5 mm trở lên, đơi có vùng mật tủa đỏ bao quanh) Bề mặt nuôi cấy có màu sắc khơng lồi lõm 1.1.3 Kết luận Chƣa đủ cở sở để kết luận mẫu sữa bắp chợ có chứa Coliforms hay khơng 1.1.4 Kiến nghị Lắc ống nghiệm chứa mẫu môi trƣờng nuôi cấy trƣớc đƣa vào đĩa petri Cần trộn mẫu với môi trƣờng nuôi cấy nhằm giúp vi sinh vật phân tán môi trƣờng tránh để xảy tƣợng nhƣ Thao tác cấy nhanh để tránh làm đông đặc môi trƣờng ảnh hƣởng đến kết 1.2 Định lượng E coli phương pháp CFU 1.2.1 Kết Kết thu đƣợc sau cấy trải mẫu sữa bắp môi trƣờng TBX ủ 44℃ 24 đƣợc thể nhƣ Hình 1.2 Hình 1.2 Mẫu sữa bắp cấy mơi trƣờng TBX (a) Độ pha lỗng 10-1 lần 1; (b) Độ pha loãng 10-1 lần 2; (c) Độ pha loãng 10-2 lần 1; (d) Độ pha loãng 10-2 lần 2; (e) Độ pha loãng 10-3 lần 1; (f) Độ pha lỗng 10-3 lần 1.2.2 Thảo luận Mơi trƣờng TBX môi trƣờng chọn lọc không màu, thƣờng đƣợc sử dụng để chọn lọc định lƣợng E coli thực phẩm thức ăn chăn nuôi Trên sáu đĩa mơi trƣờng TBX với nồng độ pha lỗng có xuất khuẩn lạc điển hình (có màu xanh) khuẩn lạc khơng điển hình Ở độ pha lỗng 10−1 ta thấy khuẩn lạc điển hình mọc nhiều cịn 10−3 khuẩn lạc mọc nhất, độ pha lỗng có tổng số khuẩn lạc đặc trƣng nằm giới hạn đếm Số lƣợng khuẩn lạc đĩa có độ pha lỗng 10-2 lần lặp 101 lần lặp 51 Ở độ pha loãng nhƣng số lƣợng khuẩn lạc chênh lệch lớn việc cấy chƣa khô tạo thành vệt gây đếm sai ảnh hƣởng đến kết thao tác lắc mẫu chƣa 1.2.3 Kết luận Mật độ E coli đƣợc tính theo cơng thức: A= Σ 𝑛∗ 𝑉∗ 𝑑 Σ : số lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc đĩa (CFU) n : số lƣợng đĩa độ pha lỗng V : thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml) d : độ pha loãng tƣơng ứng Ở lần lặp lại độ pha loãng 10-2 ta tính đƣợc : 101 + 51 A = (1∗ 0,1∗ 0,01) = 7,6 × 104 (CFU/ml) Từ kết cho thấy mật độ E coli mẫu sữa bắp vƣợt giới hạn cho phép Theo quy định Bộ Y tế mẫu sữa không đƣợc phép xuất E.coli Vì thế cần loại bỏ mẫu sữa bắp 1.2.4 Kiến nghị Cần luyện tập thao tác cấy nhiều để có ảnh cấy đẹp kết xác 1.3 Định lượng Coliforms phương pháp MPN 1.3.1 Kết Mẫu sữa bắp ủ 37℃ 48 môi trƣờng LSB cho kết nhƣ Hình 1.3 Cấy ống dƣơng tính (sinh hơi, đục) sang môi trƣờng BGBL ủ 37℃ 48 ta đƣợc kết nhƣ Hình 1.4 Hình 1.3 Mẫu sữa bắp mơi trƣờng LSB (a) ống đối chứng; (b),(c),(d) Độ pha loãng 10-1; (e), (f), (g) Độ pha loãng 10-2; (h), (i), (j) Độ pha lỗng 10-3 Hình 1.4 Dịch cấy mơi trƣờng BGBL (a) ống đối chứng; (b),(c),(d) Độ pha loãng 10-1; (e), (f), (g) Độ pha loãng 10-2; (h), (i), (j) Độ pha lỗng 10-3 1.3.2 Thảo luận Từ Hình 1.3 Hình 1.4 cho thấy ống xảy tƣợng sinh đục so với ống đối chứng 1.3.3 Kết luận Mẫu sữa bắp có chứa Coliforms Do nồng độ có ống dƣơng tính,sau tra bảng MPN ta thấy số MPN lớn 110, vƣợt mức quy định Bộ Y tế cho phép bé MPN 1.3.4 Kiến nghị Cần pha loãng mẫu nồng độ tiếp theo để xác định mật độ Coliforms 1.4 Định lượng E coli phương pháp MPN 1.4.1 Kết Mẫu sữa bắp ủ 37℃ 48 môi trƣờng LSB cho kết nhƣ Hình 1.3 Cấy ống dƣơng tính (sinh hơi, đục) vào môi trƣờng EC ta thu đƣợc kết nhƣ Hình 1.5 Tiếp tục cấy ria ống dƣơng tính (sinh hơi, đục) môi trƣờng EMB thu đƣợc khuẩn lạc đặc trƣng (tròn, dẹt, xanh ánh kim) nhƣ Hình 1.6 tiến hành thử nghiệm sinh hóa thu đƣợc kết nhƣ Hình 1.7 Hình 1.5 Dịch cấy môi trƣờng EC (a) ống đối chứng; (b),(c),(d) Độ pha loãng 10-1; (e), (f), (g) Độ pha loãng 10-2; (h), (i), (j) Độ pha lỗng 10-3 Hình 1.6 Cấy ria ống dƣơng tính mơi trƣờng EMB (a) Độ pha loãng 10-1; (b) Độ pha loãng 10-2; (c) Độ pha lỗng 10-3 Hình 1.7 Kết thử nghiệm IMViC (a) Thử nghiệm Indole; (b) Thử nghiệm Methyl red; (c) Thử nghiệm VP; (d) Thử nghiệm Citrate 1.4.2 Thảo luận Dựa vào Hình 1.6 ta thấy mơi trƣờng EMB có xuất khuẩn lạc đặc trƣng E coli Tuy nhiên khuẩn lạc đặc trƣng xuất độ pha lỗng 10-2 Ngun nhân sai sót q trình ghi pha lỗng mẫu chƣa kỹ, lắc mẫu khơng Tiếp tục tiến hành thử nghiệm IMViC cho kết quả: IN (+), MR (+), VP (-), iC.(+) 1.4.3 Kết luận Cần tiến hành kiểm định mẫu lại 1.4.4 Kiến nghị Khi cấy mẫu mơi trƣờng EMB có xuất khuẩn lạc đặc trƣng Tuy nhiên tiến hành thử nghiệm lại cho kết âm tính Ngun nhân thao tác làm chƣa chuẩn Vì thế cần tập luyện thao tác cấy nhiều kết xác Đồng thời bảo quản mẫu tốt để tránh tạp nhiễm từ vi sinh vật khác dẫn đến sai kết BÀI ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 2.1 Kết Mẫu thịt heo tăng sinh môi trƣờng tăng sinh chọn lọc RV, tiếp tục cấy ria môi trƣờng chọn lọc đặc biệt HE ủ 37℃ 24 ta đƣợc kết nhƣ Hình 2.1 Tiếp tục tiến hành thử nghiệm sinh hóa ta đƣợc kết nhƣ Hình 2.2 Hình 2.1 Mẫu thịt heo cấy môi trƣờng HE (a) Lặp 1; (b) Lặp 2; (c) Lặp 3; (d) Lặp Hình 2.2 Kết thử nghiệm (a) Thử nghiệm Indonle; (b) Thử nghiệm VP; (c) Thử nghiệm KIA 2.2 Thảo luận Dựa vào Hình 2.1 ta thấy mơi trƣờng ni cấy có xuất khuẩn lạc đặc trƣng Salmonella (tâm đen) Số lƣợng khuẩn lạc đĩa có chênh lệch lớn dù nồng độ Hình 2.2 kết thử nghiệm cho thấy IN (+), VP (-), KIA (+) 2.3 Kết luận Mẫu không chứa Salmonella 2.4 Kiến nghị Lắc mẫu trƣớc cấy vào đĩa petri Cần tập luyện nhiều để đƣờng cấy thẳng BÀI ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC 3.1 Kết 3.1.1 Vi khuẩn hiếu khí Mẫu gạo sau pha lỗng cấy mơi trƣờng PCA đem ủ 30℃ 24 ta thu đƣợc kết Hình 3.1 Mẫu gạo sau cấy mơi trƣờng PCA (a) Độ pha loãng 10-1 lần 1; (b) Độ pha loãng 10-1 lần 2; (c) Độ pha loãng 10-2 lần 1; (d) Độ pha loãng 10-2 lần 2; (e) Độ pha loãng 10-3 lần 1; (f) Độ pha loãng 10-3 lần 3.1.2 Nấm men – nấm mốc Dịch cấy sau cấy môi trƣờng DRBC ủ ngửa đĩa 25℃ 3-5 ngày ta đƣợc kết nhƣ Hình 3.2 Hình 3.2 Mẫu gạo sau cấy mơi trƣờng DRBC (a) Độ pha lỗng 10-1 lần 1; (b) Độ pha loãng 10-1 lần 2; (c) Độ pha loãng 10-2 lần 1; (d) Độ pha loãng 10-2 lần 2; (e) Độ pha loãng 10-3 lần 1; (f) Độ pha loãng 10-3 lần 3.2 Thảo luận Môi trƣờng PCA môi trƣờng tăng trƣởng vi sinh vật dùng để đánh giá tăng trƣởng theo dõi phát triển tổng số vi sinh vật hiếu khí mẫu Đếm số khuẩn lạc nồng độ: Ở nồng độ 10-1 đĩa lần không xác định đƣợc khuẩn lạc, đĩa lần có 38 khuẩn lạc Ở nồng độ 10-2 đĩa lần có khuẩn lạc, đĩa lần có khuẩn lạc Ở nồng độ 10-3 đĩa lần khơng có khuẩn lạc, đĩa lần khơng xác định đƣợc vi khuẩn hiếu khí ngun nhân q trình thao tác cấy chƣa khơ Mơi trƣờng DRBC đƣợc sử dụng phân lập nấm men, nấm mốc mẫu thực phẩm Ở nồng độ pha loãng khác 10-1, 10-2, 10-3 khơng có xuất khuẩn lạc 3.3 Kết luận 3.2.1 Vi khuẩn hiếu khí Số khuẩn lạc đếm đƣợc nồng độ pha loãng 10-1 đĩa lặp lại lần 38 khuẩn lạc (>25) nên nồng độ tổng vi khuẩn hiếu khí đƣợc tính theo cơng thức : 10 A= Σ 𝑛∗𝑑∗𝑉 Σ : số khuẩn lạc đếm đƣợc đĩa n : số lƣợng đĩa nồng độ pha lỗng V : thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml) d : độ pha loãng tƣơng ứng Từ đĩa lặp lần nồng độ pha lỗng 10-1 ta tính đƣợc: A = 38 1∗0,1∗0,1 = 3,8.103 (CFU/ml) Số lƣợng vi khuẩn hiếu khí có mẫu 3,8.103 khơng vƣợt tiêu chuẩn 106 Từ kết cho thấy đƣợc gạo an toàn, đảm bảo chất lƣợng.Tuy nhiên, q trình thao tác xử lí kiểm tra mẫu cịn nhiều sai sót dẫn đến kết sai lệch, nên cần kiểm tra mẫu thêm vài lần nhằm xác định có kết để sử dụng sản phẩm an toàn chất lƣợng 3.2.2 Nấm men – nấm mốc Trong mẫu gạo khơng có xuất khuẩn lạc nấm men - nấm mốc nên gạo an toàn, đảm bảo chất lƣợng đƣợc bảo quản cách 3.4 Kiến nghị Tiếp tục bảo quản mẫu gạo điều kiện nhƣ để đảm bảo chất lƣợng gạo 11