TP Thủ Đức, ngày 13 tháng 05 năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Ngành học CÔNG N[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰCHÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Mơn: KIỂM NGHIỆM VI SINH Mã mơn học: 211220 Nhóm thực hiện: Nhóm TP Thủ Đức, ngày 13 tháng 05 năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰCHÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Giảng viên hướng dẫn ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG ThS LÊ PHƯỚC THỌ KS VÕ TRẦN QUỐC THẮNG Sinh viên thực TRƯƠNG ANH TUẤN MSSV 19126215 NGUYỄN ĐÌNH TÂN NGUYỄN TẤN NGHIỆP NGUYỄN HỒ Ý NHI PHÙNG THỊ HẬU ĐỔNG THỊ NINH THUẬN 19126157 19126112 19126120 19126046 19126276 TP Thủ Đức, ngày 13 tháng 05 năm 2023 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập môn Thực hành Kiểm nghiệm vi sinh, nhóm em nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo nhiệt tình thầy cơ, bạn bè Nhóm em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trương Phước Thiên Hoàng, ThS Lê Phước Thọ anh Võ Trần Quốc Thắng, Khoa khoa học sinh học – trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM tận tình hướng dẫn, bảo suốt trình học làm báo cáo Nhóm em gửi lời cảm ơn chân thành đến giảng viên trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM nói chung, giảng viên khoa Khoa học sinh học nói riêng truyền đạt cho chúng em kiến thức mơn đại cương, giúp chúng em có sở lý thuyết vững vàng tạo điều kiện giúp đỡ chúng em suốt trình học tập Đại học Nông Lâm TP.HCM, tháng năm 2023 i MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ii DANH SÁCH CÁC HÌNH iii BÀI ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1.1 Định lượng Coliforms E coli phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.1 Kết định lượng Coliforms phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.1.1 Kết 1.1.1.2 Biện luận tính tốn kết 1.1.2 Kết định lượng E coli phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.2.1 Kết 1.1.2.2 Biện luận tính tốn kết 1.2 Định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN 1.2.1 Kết định lượng Coliforms phương pháp MPN 1.2.1.1 Kết 1.2.1.2 Biện luận tính tốn kết 1.2.2 Kết định lượng E coli phương pháp MPN BÀI ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 2.1 Kết định tính Salmonella 2.2 Giải thích kết BÀI ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 3.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 3.1.1 Kết định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu bún tươi 3.1.2 Kết định lượng tổng số nấm men – nấm mốc mẫu bún tươi 3.1.3 Tính tốn kết biện luận 3.2 Định lượng tổng nấm men, nấm mốc 3.2.1 Kết định lượng tổng nấm men, nấm mốc 3.2.2 Tính tốn kết biện luận 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO 11 ii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BGBL: Brilliant Green Bile broth Lactose BPW: Buffered Pepton Water CFU: Colony Forming Unit DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar E coli: Escherichia coli EC: E coli medium EMB: Eosin Methylene Blue Agar HE: Hektoen Entric Agar KIA: Kligler Iron Agar LSB: Lauryl Sulphate Water MPN: Most probable number PCA: Plate agar RV: Rappaport Vassiliadis TBX: Tryptone Bile X – glucuronide VP: Voges – Proskauer VRBL: Violet Red Bile Lactose XLD: Xylose Lysine Desoxycholate iii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Đĩa thạch mơi trường VRBL nồng độ 10 -2 Hình 1.2 Đĩa thạch môi trường VRBL nồng độ 10 -3 Hình 1.3 Đĩa thạch môi trường VRBL nồng độ 10 -1 Hình 1.4 Đĩa thạch môi trường TBX nồng độ 10 -2 Hình 1.5 Đĩa thạch mơi trường TBX nồng độ 10 Hình 1.6 Đơi chứng với ống LSB theo nồng độ Hình 1.7 Kết ống dương tính mơi trường BGBL Hình 1.8 Kết ống dương tính mơi trường EC Hình 1.9 Đĩa thạch EMB sau cấy từ ống canh EC Hình 1.10 Kết phản ứng sinh hóa Hình 2.1 Mẫu tôm khô sau tăng sinh môi trường tăng sinh Hình 2.2 Đĩa cấy mẫu môi trường chọn lọc HE… Hình 2.3 Kết thử nghiệm sinh hoá với khuẩn lạc đặc trưng Hình 3.1 Đĩa thạch mơi trường PCA nồng độ 10-1 Hình 3.2 Đĩa thạch mơi trường PCA nồng độ 10-2 Hình 3.3 Đĩa thạch mơi trường PCA nồng độ 10-3 Hình 3.4 Đĩa thạch môi trường DRBC nồng độ 10-1 10 Hình 3.5 Đĩa thạch môi trường DRBC nồng độ 10-2 10 Hình 3.6 Đĩa thạch mơi trường DRBC nồng độ 10-3 10 -1 iv BÀI ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1.1 Định lượng Coliforms E coli phương pháp đếm khuẩn lạc Vật liệu: Thực kiểm định mẫu nước mía mua ngồi chợ 1.1.1 Kết định lượng Coliforms phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.1.1 Kết Kết sau ủ Coliforms môi trường VRBL 30 oC – 37 oC 24 với độ pha loãng từ 10-1 đến 10-3 (mỗi nồng độ đĩa) Ở nồng độ 10-1 cho mật độ dày đếm khuẩn lạc, khuẩn lạc mọc đè lên tạo thành dải màu lan mặt đĩa Ở nồng độ 10-2 cho mật số giảm hơn, khuẩn lạc mọc tách đĩa thạch mật độ nhiều Ở nồng độ 10-3 cho mật số giảm hẳn, khuẩn lạc mọc tạo thành dải kéo dài đĩa Nếu lật đĩa lại đếm chấm khuẩn lạc nhỏ mọc li ti đáy Đối với khuẩn mọc đè lên tạo thành cụm tính thao tác cấy trải khơng tốt nên kết mang tính chất tương đối Hình 1.1 Đĩa thạch mơi trường VRBL nồng độ 10-1 Hình 1.2 Đĩa thạch mơi trường VRBL nồng độ 10-2 Hình 1.3 Đĩa thạch môi trường VRBL nồng độ 10-3 1.1.1.2 Biện luận tính tốn kết Để kết có giá trị, thường cần đếm khuẩn lạc đĩa có chứa 10 khuẩn lạc (tổng số khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc phù hợp với tiêu chí xác định) Tính số lượng N vi sinh vật có mẫu thử theo trung bình khối lượng từ hai độ pha lỗng liên tiếp cách sử dụng cơng thức: A= 𝑁 𝑛1 𝑥 𝑉 𝑥 𝑓1+⋯+𝑛𝑖 𝑥 𝑉 𝑥 𝑓𝑖 Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) 1g hay 1ml mẫu (CFU/g CFU/ml) N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng tương ứng Số lượng khuẩn lạc đếm lần lược nồng độ 10-3 72 59 Số lượng khuẩn lạc đếm nồng độ 10-1 10-2 lớn 150 nên sử dụng nồng độ 10-3 để đếm khuẩn lạc A= 𝑁 𝑛1 𝑥 𝑉 𝑥 𝑓1+⋯+𝑛𝑖 𝑥 𝑉 𝑥 𝑓𝑖 = 72+59 2𝑥0.1𝑥10−3 = 6,5𝑥105 (CFU/ml) Ở nồng độ 10-3 khuẩn lạc mọc tạo chùm không mọc riêng rẽ thao tác cấy Khi cấy trải đĩa khơng khơ nên khơng bao phủ tồn mặt đĩa làm vi khuẩn mọc đè lên làm cho việc đếm khơng xác, cần luyện tập thêm 1.1.2 Kết định lượng E coli phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.2.1 Kết Kết sau ủ E coli môi trường TBX 44 oC từ 18 - 24 (không 24 giờ) với độ pha loãng từ 10-1 dến 10-3 (mỗi nồng độ đĩa) Hình 1.4 Đĩa thạch mơi trường TBX nồng độ 10-1 Hình 1.5 Đĩa thạch mơi trường TBX nồng độ 10-2 1.1.2.2 Biện luận tính toán kết Kết cho thấy sau ủ điều kiện thích hợp khuẩn lạc mọc lên với mật độ giảm dần theo hệ số pha loãng mẫu từ 10-1 đến 10-3 Các đĩa cấy trải tương đối khô đều, khuẩn lạc mọc riêng rẽ nên dễ đếm đĩa VRBL Khuẩn lạc mọc giảm dần theo nồng độ từ 10-1 đến 10-3 Qua nồng độ không phát khuẩn lạc đặc trưng (khuẩn lạc màu xanh) xuất khuẩn lạc nồng độ 10−2 Khuẩn lạc phát nhiễm từ bên vào mật độ E.coli thấp nên xuất Kết luận mẫu thực phẩm khơng có E.coli Có thể kết luận mẫu nước mía mua chợ an toàn với E.coli 1.2 Định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN Hình 1.6 Ống đối chứng ống LSB theo nồng độ (a) ống đối chứng, (b) ống có nồng độ pha lỗng 10-1, (c) ống có nồng độ pha lỗng 10-2, (d) ống có nồng độ pha lỗng 10-3 Nhận xét: Ở nồng độ xuất hiện tượng đục mơi trường sủi bọt khí Kết định lượng Coliforms phương pháp MPN 1.2.1.1 Kết Hình 1.7 Kết ống dương tính mơi trường BGBL (a) ống đối chứng,(b) ống có nồng độ pha lỗng10-1, (c) ống có nồng độ pha lỗng 10-2, (d) ống có nồng độ pha lỗng 103 1.2.1.2 Biện luận tính tốn kết Trong mơi trường BGBL có tượng đục mơi trường sinh nên mẫu có diện coliforms Để tăng độ tin cậy tính thuyết phục làm thêm nồng độ pha loãng nhỏ 10-4, 10-5, làm thao tác tương tự để đưa kết xác Tính tốn kết quả: ống nghiệm nồng độ pha lỗng có sinh làm đục mơi trường Tra bảng MPN cho kết > 1100MPN / ml 1.2.2 Kết định lượng E coli phương pháp MPN Hình 1.8 Kết ống mơi trường EC dương tính (a) ống đối chứng, (b) ống có nồng độ pha lỗng 10-1, (c) ống có nồng độ pha lỗng 10-2, (d) ống có nồng độ pha lỗng 10-3 Kết cho thấy tất ống đục có bọt khí với ống đối chứng Chứng tỏ mẫu bị nghi ngờ có xuất E.coli Tiếp tục cấy sang môi trường EMB để tìm khuẩn lạc đặc trưng a b ) c -1 -2 Hình 1.9 Đĩa thạch EMB sau cấy từ ống canh EC (a) b nồng độ 10 , (b) nồng độ 10 , -3 (c) nồng độ 10 Sau cấy ria sang đĩa thạch EMB, đĩa nồng độ 10-1 thấy xuất khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ E.coli, khuẩn lạc mọc đĩa có ánh kim xanh Ở nồng độ 10-2 nồng độ 10-3 không xuất khuẩn lạc đặc trưng Không phải xuất khuẩn lạc đặc trưng E.coli tiếp tục sử dụng khuẩn lạc nồng độ 10-1 thực phản ứng sinh hóa, khẳng định xem có phải E.coli hay khơng? a) b) c) d) Hình 1.10 Kết phản ứng sinh hóa (a) ống phản ứng với Indol (+), (b) ống phản ứng với Methyl Red (+), (c) ống phản ứng với VP (+), (d) ống phản ứng với iC (+) Thử nghiệm IMViC sử dụng để thực phản ứng nghi ngờ mẫu có E.coli Kết IMViC dương tính mẫu dương tính với E.coli Kết IMViC âm tính mẫu âm tính với E.coli 1.2.3 Biện luận kết Mẫu có Ecoli mẫu có kết thử nghiệm IMViC: Indole (+), Methyl Red (+), VP (-), Citrate (-) Trong kết phản ứng Indole (+), Methyl Red (+), VP (+), Citrate (+).Từ cho thấy mẫu khơng phải Ecoli Mơi trường EMB xuất màu xanh ánh kim chứa Ecoli, chưa làm nên thử nghiệm IMViC lượng Ecoli nên kết bị sai Nhưng kết phản ứng sinh hóa phù hợp với kết cấy môi trường TBX khơng xuất khuẩn lạc đặc trưng nên khẳng định khơng có E.coli mẫu BÀI ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 2.1 Kết định tính Salmonella Vật liệu: Thực kiểm định mẫu tôm khơ a b Hình 2.1 Mẫu tơm khơ sau tăng sinh môi trường tăng sinh (a) môi trường BPW, (b) môi trường RV Mẫu ủ nhiệt độ 37oC 24 tiếng đồng hồ Salmonella tìm thấy toàn giới động vật máu lạnh động vật máu nóng mơi trường Các chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh thương hàn (do Salmonella typhi), phó thương hàn, nhiễm trùng máu (do Salmonella choleraesuis) ngộ độc thực phẩm (Salmonellosis) Các triệu chứng Salmonella gây chủ yếu tiêu chảy, ói mửa, buồn nơn xuất sau 12 đến 36 sau tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella Chính nguy hiểm Salmonella gây nên việc định tính Salmonella thực phẩm cần thiết Hình 2.2 Đĩa cấy mẫu mơi trường chọn lọc HE Hình 2.3 Kết thử nghiệm sinh hoá với khuẩn lạc đặc trưng (a) ống thử nghiệm môi trường Indol (+), (b) kết thử nghiệm môi trường VP (-), (c) ống kết thử nghiệm mơi trường KIA (-) Giải thích kết Ở hình 2.2 có xuất khuẩn lạc đặc trưng đĩa cấy môi trường chọn lọc HE (khuẩn lạc có màu thay đổi từ màu xanh dương đến màu xanh lục, có hay khơng có tâm đen) đĩa cấy môi trường chọn lọc HE Nghi ngờ mẫu có chứa Salmonella, để khẳng định cần thêm kiểm tra phản ứng sinh hóa cho Salmonella để xác định mẫu có Salmonella Thử nghiệm môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA sử dụng để thử nghiệm khả sử dụng nguồn carbon khác (glucose, lactose) khả sinh H2S Kết thử nghiệm sinh hóa mơi trường KIA, thử nghiệm Indol VP thể hình 2.3., thử nghiệm Indol dương tính, VP KIA âm tính, khơng với Salmonella Từ kết định tính âm tính với Salmonella 10 g mẫu tôm khô BÀI ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 3.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 3.1.1 Kết định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí mẫu bún tươi Kết định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí mơi trường PCA 30 oC – 37 oC 24 với độ pha loãng từ 10-1 đến 10-3 (mỗi nồng độ đĩa) Hình 3.1 Đĩa thạch mơi trường PCA nồng độ 10-1 Hình 3.2 Đĩa thạch mơi trường PCA nồng độ 10-2 Hình 3.3 Đĩa thạch mơi trường PCA nồng độ 10-3 3.1.2 Kết định lượng tổng số nấm men – nấm mốc mẫu bún tươi Khuẩn lạc mọc đĩa, tạo khuẩn lạc riêng rẽ, cấy trải tốt đĩa PCA, dễ dàng đếm mật số Nấm men tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, tồn dạng khuẩn ty giả, tế bào kết thành chuỗi Đa số khuẩn lạc nấm men có dạng trịn, khuẩn lạc khơ, tâm màu trắng hồng tía Khơng phát nấm mốc dạng sợi, khuẩn lạc có tâm đen Hình 3.4 Đĩa thạch mơi trường DRBC nồng độ 10-1 10 Hình 3.5 Đĩa thạch môi trường DRBC nồng độ 10-2 -3 Hình 3.1.3 Tính tốn kết quả3.6 Đĩa biệnthạch luậnmơi trường DRBC nồng độ 10 Ở môi trường PCA DRBC ta thấy nồng độ 10−1 tổng số khuẩn lạc lớn 250 nên ta sử dụng nồng độ 10−2 10−3 để định tính Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa nồng độ 10−2 10−3 sau ủ Chọn số đĩa có số đếm khoảng 25 – 250 để tính kết Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí tổng số nấm men- nấm mốc tính sau: A= 𝑁 𝑛1 𝑉 𝑓1+ +𝑛𝑖 𝑉 𝑓𝑖 Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) 1g hay 1ml mẫu (CFU/g CFU/ml) N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng tương ứng 11 Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí: Số lượng khuẩn lạc đếm đĩa nồng độ 10−2 : 192; 189 Số lượng khuẩn lạc đếm đĩa nồng độ 10−3 : 31; 43 Tổng số vi khuẩn hiếu khí 1g mẫu = 192+189+31+43 2∗0,1∗10−2 +2∗0∗1∗ 10−3 = 2,1*105 (CFU/g) Đinh lượng tổng số nấm men-nấm mốc: Số lượng khuẩn lạc đếm đĩa nồng độ 10−2 : 234; 112 Số lượng khuẩn lạc đếm đĩa nồng độ 10−3 : 37; 52 Tổng số nấm men-nấm mốc 1g mẫu = 234+112 2∗0,1∗10−2 +2∗0∗1∗ 10−3 = 1,9*105 (CFU/g) Tổng số vi sinh vật hiếu khí = (tổng số vi khuẩn hiếu khí) + (tổng số nấm men – nấm mốc) Tổng số vi sinh vật hiếu khí = 2,1*105 +1,9*105 = 4*105 (CFU/g) 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trương Phước Thiên Hoàng, Lê Phước Thọ 2023 Tài liệu thực hành kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm Trường đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh 13