BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOAKHOAHỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM TP Thủ Đức, 05/2023 Ngành học CÔNG NGHỆ SINH HOC Chuyên[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HOC Chuyên Ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Nhóm thực : NHĨM Niên Khóa : 2021-2025 TP.Thủ Đức, 05/2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM Hướng Dẫn Khóa Học Sinh viên thực TS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG HUỲNH THỊ THÙY DUYÊN THS: LÊ PHƯỚC THỌ VÕ TRẦN QUỐC THẮNG NGUYỄN ĐẠT TRỊNH NGỌC KHÁNH NGUYỄN NHÃ LINH VÕ HUỲNH THẢO VY NGUYẾN DƯƠNG PHƯƠNG YẾN Thủ Đức, 05/2023 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .ii DANH SÁCH CÁC HÌNH iii DANH SÁCH CÁC BẢNG v BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ E.COLI 1.1 Định lượng Coliform E.COLI phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.1 Định lượng Coliform phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.1.1 Kết 1.1.2 Định lượng E.COLI phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.2.1 Kết 1.2 Định lượng Coliforms E.Coli phương pháp MPN 1.2.1 Kết thu 1.2.1.1 Định lượng Coliforms phương pháp MPN 1.2.1.2 Định lượng E.Coli phương pháp MPN BÀI 2: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 2.1 Kết 2.1.1 Kết thu BÀI ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN-NẤM MỐC 3.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 3.1.1 Kết .8 3.1.2 Biện luận tính tốn kết 3.2 Định lượng tổng nấm men – nấm mốc 10 3.2.1 kết 10 3.2.2 Biện luận tính tốn 11 i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BPW: Buffered Pepton Waters DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar HE: Hektoen Entric Agar KIA: Kliger Agar PCA: Plate agar RV: Rappaport Vassiliadis Pepton TBX: Thạch trypton- mật- glucuronid VRBL: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể VP: Voges-Proskauer ii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Mơi trường VRBL sau ủ 37oC 24 (a) Nồng độ 10-1 lần 1; (b) Nồng độ 10-1 lần 2; (c) Nồng độ 10-2 lần 1; (d) Nồng độ 10-2 lần .1 Hình 1.2 Mơi trường TBX sau ủ 44oC 24 (a) Nồng độ 10-1 lần 1; (b) Nồng độ 10-1 lần 2; (c) Nồng độ 10-2 lần 1; (d) Nồng độ 10-2 lần .2 Hình 1.3 Các ống nghiệm LSB sau ủ 37oC 48 (DC) Đối chứng;(a) Ống nghiệm nồng độ 10-1; (b) Ống nghiệm nồng độ 10-2; (c) Ống nghiệm nồng độ 10-3 Hình 1.4 Các ống nghiệm BGBL sau ủ 37oC 48 tiếng (a) Ống nồng độ 10-1; (b) Ống nồng độ 10-2; (DC): Ống đối chứng Hình 1.5 Các ống nghiệm EC sau ủ 44,5oC 24 (a) ống nồng độ 10-1; (c) ống nồng độ 10-2 Hình 2.1: Mẫu gan heo môi trường tăng sinh (a) mẫu gan heo môi trường tăng sinh BPW, ( b) Ống nghiệm đối chứng, ( c) Dịch mẫu môi trường tăng sinh chọn lọc RV Hình 2.1: Mẫu gan heo môi trường tăng sinh (A) mẫu gan heo môi trường tăng sinh BPW, ( B) Ống nghiệm đối chứng, ( C) Dịch mẫu môi trường tăng sinh chọn lọc RV Hình 2.2:Đĩa petri chứa khuẩn lạc môi trường HE (a) đĩa cấy lần 1; (b) đĩa cấy lần Hình 2.2:Đĩa petri chứa khuẩn lạc môi trường HE.(A) đĩa cấy lần 1, (B) đĩa cấy lần Hình 2.3: Thủ nghiệm sinh hóa (a) thử nghiệm KIA; (b) thử nghiệm VP; (c) thủ nghiệm Indol Hình 3.1.1 Đĩa petri mơi trường PCA với nồng độ 10-2 (A) Nồng độ 10-2 lần 1; (B) nồng độ 10-2 lần Hình 3.1.2 Đĩa petri mơi trường PCA với nồng độ 10-3 (C) Nồng độ 10-3 lần 1; (D) Nồng độ 10-3 lặp lại lần iii Hình 3.1.3 Đĩa petri môi trường PCA với nồng độ 10-4 (e) Nồng độ 10-4 lần 1; (f) Nồng độ 10-4 lần Hình 3.2.1 Đĩa petri chứa môi trường DRBC với nồng độ 10-1 (a) Nồng độ 10-1 lần1; (b) Nồng độ 10-1 lần 10 Hình 3.2.2 Đĩa petri chứa mơi trường DRBC với nồng độ 10-2 (c) Nồng độ 10-2 lần 1; (d) Nồng độ 10-2 lần .10 Hình 3.2.3 Đĩa petri chứa môi trường DRBC với nồng độ 10-3 (e) Nồng độ10-3 lần1; (f) Nồng độ 10-3 lần 11 iv DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1.2 nồng độ số lần lặp đĩa petri môi trường PCA Bảng 3.1.3 Nồng độ số lần lặp đĩa petri chứa mơi trường DRBC 11 v BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM VÀ E.COLI 1.1 Định lượng Coliform E.COLI phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.1 Định lượng Coliform phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.1.1 Kết Sau ủ mẫu trà sữa môi trường VRBL 37oC 24 b a d c Hình 1.1 Môi trường VRBL sau ủ 37oC 24 (a) Nồng độ 10-1 lần 1; (b) Nồng độ 10-1 lần 2; (c) Nồng độ 10-2 lần 1; (d) Nồng độ 10-2 lần Nhận xét qua hình 1.1 không xuất khuẩn lạc đặc trưng Coliform môi trường VRBL nồng độ 10-1 10-2 nên không cần đề cập đến nồng độ 10-3 Suy dừng thí nghiệm Kết luận mẫu khơng có diện Coliform mẫu trà sữa 1.1.2 Định lượng E.COLI phương pháp đếm khuẩn lạc 1.1.2.1 Kết a b c d Hình 1.2 Mơi trường TBX sau ủ 44oC 24 (a) Nồng độ 10-1 lần 1; (b) Nồng độ 10-1 lần 2; (c) Nồng độ 10-2 lần 1; (d) Nồng độ 10-2 lần Nhận xét: Môi trường TBX môi trường chọn lọc sừ dụng chọn lọc E.COLI thực phẩm Qua hình 2.1 khơng có xuất khuẩn lạc đặc trưng E.COLI môi trường TBX nồng độ 10-1 10-2 nên không cần đề cập đến ảnh 10-3 Suy dừng thí nghiệm Kết luận mẫu có diện E.COLI trà sữa 1.2 Định lượng Coliforms E.Coli phương pháp MPN 1.2.1 Kết thu DC a b c Hình 1.3 Các ống nghiệm LSB sau ủ 37oC 48 (DC) Đối chứng; (a) Ống nghiệm nồng độ 10-1; (b) Ống nghiệm nồng độ 10-2; (c) Ống nghiệm nồng độ 10-3 Nhận xét: So với ống đối chứng ống nồng độ 10-1 ống nồng độ 10-2 xuất bọt khí bị đục ống nồng độ 10-2 khơng có tượng sinh bọt khí bị đục nhẹ cho thấy nghi ngờ có diện vi khuẩn Ở ống nồng độ 10-3 xảy tượng giống ống đối chứng, nên khơng có diện vi khuẩn Sau ghi nhận ống LSB(+) ống nghi ngờ hình 1.3 ta tiếp tục cấy vào ống canh chứa môi trường BGBL nhiệt độ 37oC 48 tiếng môi trường EC nhiệt độ 44,5oC 24 tiếng 1.2.1.1 Định lượng Coliforms phương pháp MPN Các ống canh BGBL sau ủ nhiệt độ 37oC 48 tiếng Nhận xét: Theo hình 1.4 số ống sinh sau ủ ống canh BGBL nhiệt độ 37oC 48 tiếng, với nồng độ 10-1 có sinh có bọt khí , cịn ống với nồng độ 10-2 có ống sinh so với ống đối chứng ống cịn lại khơng có tượng xảy a b DC Hình 1.4 Các ống nghiệm BGBL sau ủ 37oC 48 tiếng (a) Ống nồng độ 10-1; (b) Ống nồng độ 10-2; (DC): Ống đối chứng Các ống nghiệm BGBL sau ủ 37oC 24 tất độ pha loãng (+) (sinh hơi) Tra bảng MPN với số lượng kết ống dương tính theo nồng độ pha lỗng 10-1 10-2 10-3 – – thu kết số lượng Coliform tổng số 93 MPN/ml 1.2.1.2 Định lượng E.Coli phương pháp MPN Ghi nhận ống LSD(+) có nồng độ pha lỗng hình 1.3, tiếp tục trình cấy vào ống canh EC ủ 44 độ C 24 Biện luận ống nghiệm EC sau ủ 37oC 24 với nồng độ pha loãng 10-1 10-2 (+) (sinh đục màu môi trường) Tiếp tục cấy ria từ ống EC(+) vào đĩa thạch EMB, ủ 37oC 24 Nếu đĩa xuất khuẩn lạc đặc trưng ánh kim xanh thực thử nghiệm sinh hóa Indol – MR – VP – SC Ghi nhận tính kết Hình 1.6 cho thấy khơng tồn E coli mẫu trà sữa khuẩn lạc phát triển môi trường thạch EMB sau ủ 370C 24 khơng có màu ánh kim xanh đặc trưng khơng tiến hành thử nghiệm IMViC Kết luận khơng có diện E.Coli mẫu trà sữa DC b a Hình 1.5 Các ống nghiệm EC sau ủ 44,5oC 24 (a) ống nồng độ 10-1; (c) ống nồng độ 10-2 b a Hình 1.6 Đĩa petri chứa môi trường EMB sau ủ 37oC 24 (A) Nồng độ 10-1 lần 1; (B) Nồng độ 10-1 lần BÀI 2: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA 2.1 Kết 2.1.1 Kết thu b a c Hình 2.1: Mẫu gan heo môi trường tăng sinh (a) mẫu gan heo môi trường tăng sinh BPW, ( b) Ống nghiệm đối chứng, ( c) Dịch mẫu môi trường tăng sinh chọn lọc RV a b Cho mẫu gan heo chuẩn bị vào môi trường tăng sinh BPW ủ nhiệt độ 37°C 18-24 giờ( Hình 2.1A) Ta tiếp tục tăng sinh vi khuẩn cách hút 0,1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV ủ 42°C 18-24 giờ( Hình 2.1C) Sau tiến hành phân lập khuẩn lạc môi trường chọn lọc đặc biệt HE Nhận xét: Sau ủ đĩa cấy môi trường HE xuất khuẩn lạc màu xanh dương, chứng tỏ có phát triển salmonella để hình thành khuẩn lạc nghi ngờ có diện salmonella mẫu gan (Hình 2.2) Kết quả: Sau tiến hành phản ứng sinh hố để kiểm a b c định diện Salmonella Trong nghiệm A, salmonella phản ứng sinh H2S tạo màu đen cho kết dương tính Trong ống nghiệm B, cho kết âm tính khơng có thay đổi màu sắc thị sau Trong ống nghiệm C, cho kết âm tính khơng có thay đổi màu sắc Hình 2.3: Thủ nghiệm sinh hóa (a) thử nghiệm KIA; (b) thử nghiệm VP; (c) thủ nghiệm Indol thị Kết luận: qua bước kiểm định, cho kết dương tính với Salmonella mẫu .gan BÀI ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN-NẤM MỐC 3.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 3.1.1 Kết Kết định lượng vi khuẩn hiếu khí mơi trường PCA sau ủ 37oC 24 giờ, ( nồng độ lặp lại lần) b a Hình 3.1.1 Đĩa petri môi trường PCA với nồng độ 10-2 (a) Nồng độ 10-2 lần 1; (b) nồng độ 10-2 lần c d Hình 3.1.2 Đĩa petri mơi trường PCA với nồng độ 10-3 (c) Nồng độ 10-3 lần 1; (d) Nồng độ 10-3 lặp lại lần e f Hình 3.1.3 Đĩa petri mơi trường PCA với nồng độ 10-4 (e) Nồng độ 10-4 lần 1; (f) Nồng độ 10-4 lần Nhận xét Có khuẩn lạc xuất mơi trường PCA 3.1.2 Biện luận tính tốn kết Trong q trình cấy cịn có số thao tác chưa tốt xuất sai xót q trình cấy Ở hình đĩa chưa cấy đều, cấy bị nhiễm, cấy chưa khô dẫn đến việc số đĩa xác định số lượng khuẩn lạc có mơi trường PCA Tính tốn kết Số lần lặp Lần Lần 10-2 > 250 > 250 10-3 196 182 10-4 26 < 25 Nồng độ Bảng 3.1.2 nồng độ số lần lặp đĩa petri mơi trường PCA Ta có cơng thức A= = N n1.V f1 ni V f i 196 185 26 1,9.10 CFU/ml 3 4 2.0,1.10 1.0,1.10 Vây mật độ pha loãng định lượng môi trường PCA 1,9.106 CFU/g 3.2 Định lượng tổng nấm men – nấm mốc 3.2.1 kết Kết tổng nấm men – nấm mốc thu môi trường DRBC sau ủ 25oC từ 3-5 ngày a B b Hình 3.2.1 Đĩa petri chứa môi trường DRBC với nồng độ 10-1 (a) Nồng độ 10-1 lần1; (b) Nồng độ 10-1 lần d c Hình 3.2.2 Đĩa petri chứa mơi trường DRBC với nồng độ 10-2 (c) Nồng độ 10-2 lần 1; (d) Nồng độ 10-2 lần Nhận xét nồng độ 10-1 10-2 ta thấy đĩa có xuất nấm mốc 10 f e Hình 3.2.3 Đĩa petri chứa mơi trường DRBC với nồng độ 10-3 (e) Nồng độ10-3 lần1; (f) Nồng độ 10-3 lần Nhận xét hình 3.2.3 ta thấy xuất nấm mốc hình 3.2.3(f) cịn hình cịn lại ta kh thấy tượng 3.2.2 Biện luận tính tốn Biện luận Do trình cấy vẫy xảy thao tác chưa xác hơ que cấy cịn nóng dẫn đến làm cho nấm mốc bị chết Các đĩa cấy có sai xót nên xảy việc số liệu chưa xác Tính tốn kết Lần lặp lại Lần Lần 10-1 10-2 10-3 Nồng độ Bảng 3.1.3 Nồng độ số lần lặp đĩa petri chứa mơi trường DRBC Ta có cơng thức A= 1 N 4,5.102 = 1 2 3 n1.V f1 ni V f i 2.0,1.10 2.0,1.10 1.0,1.10 Vậy mật độ pha loãng định lượng môi trường PRBC 4,5.10-2CFU/g 11