Đánh giá hàm lượng thuốc trừ sâu clo hữu cơ trong nước, trầm tích, thủy sinh vật tại cửa sông sài gòn đồng nai và thử nghiệm độc tính của ddts lên phối, ấu trùng hàu thái bình dương, cá medaka

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Xuân Tòng ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG THUỐC TRỪ SÂU CLO HỮU CƠ TRONG NƯỚC, TRẦM TÍCH, THỦY SINH VẬT TẠI CỬA SƠNG SÀI GỊN – ĐỒNG NAI VÀ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA DDTs LÊN PHƠI, ẤU TRÙNG HÀU THÁI BÌNH DƯƠNG, CÁ MEDAKA LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Hà Nội – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Xuân Tòng ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG THUỐC TRỪ SÂU CLO HỮU CƠ TRONG NƯỚC, TRẦM TÍCH, THỦY SINH VẬT TẠI CỬA SƠNG SÀI GỊN – ĐỒNG NAI VÀ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA DDTs LÊN PHƠI, ẤU TRÙNG HÀU THÁI BÌNH DƯƠNG, CÁ MEDAKA Chuyên ngành: Kỹ thuật Môi trường Mã số: 52 03 20 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Mai Hương PGS TS Dương Thị Thủy Hà Nội – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung luận án cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS Mai Hương PGS.TS Dương Thị Thủy Các số liệu kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cảm ơn, thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nguyễn Xn Tịng LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới TS Mai Hương, Trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội PGS.TS Dương Thị Thủy, Viện Công nghệ Môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để hồn thành luận án Tác giả xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Thu Hương – Trường Đại học Mỏ Địa Chất Đã tận tình giúp đỡ tác giả từ ngày đầu xây dựng, định hướng nghiên cứu suốt trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn phịng quản lý Đào tạo Viện Công nghệ Môi trường, Học viện Khoa học Công nghệ -Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi hồn thành thủ tục cần thiết trình làm nghiên cứu Trong trình nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình quý báu Viện Khoa học Công nghệ Quản lý Môi trường – Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh Dịch tể Trung ương, Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, Trung Tâm Kiểm Định Và Khảo Nghiệm Thuốc Bảo Vệ Thực Vật Phía Nam, Phịng Độc học Sinh thái - Đại học Liege - Vương Quốc Bỉ Tôi xin trân trọng cảm ơn Tôi xin chân thành cảm ơn nhà khoa học giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu liên quan đến luận án đánh giá chất lượng luận án để luận án hồn thiện Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thân yêu gia đình, đồng nghiệp bạn bè ln quan tâm, động viên, ủng hộ giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Tác giả luận án: Nguyễn Xuân Tòng i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 1.1 Tổng quan hóa chất BVTV 1.1.1 Phân loại hóa chất BVTV 1.1.2 Một số nhóm hóa chất BVTV 1.1.3 Nguồn gốc hóa chất BVTV môi trường 1.2 Tình hình nghiên cứu trạng tồn dư hóa chất BVTV, độc tính mơi trường sinh thái thủy sinh 11 1.2.1 Tình hình nghiên cứu trạng sử dụng hóa chất BVTV giới 11 1.2.2 Tình hình nghiên cứu trạng sử dụng hóa chất BVTV Việt Nam 16 1.2.3 Độc tính hóa chất BVTV 19 1.3 Tổng quan hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas), cá medaka (Oryzias latipes) ứng dụng đánh giá độc học sinh thái 24 1.3.1 Tổng quan hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) .24 1.3.2 Tổng quan cá medaka (Oryzias latipes) .26 1.3.3 Vai trị hàu Thái Bình Dương (Crassostrea giagas) cá medaka (Oryzias latipes) nghiên cứu độc học sinh thái 27 1.4 Tổng quan khu vực nghiên cứu 29 1.4.1 Đặc điểm tự nhiên 29 ii 1.4.2 Đặc điểm kinh tế xã hội 30 1.4.3 Đặc điểm môi trường 31 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Vật liệu nghiên cứu 33 2.1.1 Vật liệu 33 2.1.2 Hóa chất 34 2.1.3 Thiết bị 35 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 2.2.1 Phương pháp phân tích mẫu .36 2.2.2 Các phương pháp thử nghiệm phôi, ấu trùng hàu Thái Bình Dương cá medaka .38 2.2.3 Các phương pháp đánh giá độc tính 42 2.3 Địa điểm lấy mẫu 46 2.4 Xử lý thống kê số liệu 50 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 53 3.1 Phân nhóm địa điểm lấy mẫu 53 3.2 Hiện trạng OCPs nước trầm tích 54 3.2.1 Các thơng số hóa lý nước mặt trầm tích 54 3.2.2 Nồng độ OCPs nước 55 3.2.3 Nồng độ OCPs trầm tích 62 3.2.4 Mối liên hệ nồng độ OCPs nước trầm tích 69 3.2.5 Đánh giá nguồn gốc nhiễm OCPs phân tích thành phần 73 3.3 OCPs cá nhuyễn thể hai mảnh vỏ 76 3.3.1 Nồng độ OCPs sinh vật theo loài 77 3.3.2 Nồng độ OCPs sinh vật theo khơng gian (vị trí) .89 3.3.3 Nguồn nhiễm OCPs sinh vật 91 iii 3.4 Đánh giá độc tính DDTs 94 3.4.1 Độc tính DDTs đến sinh trưởng phơi, ấu trùng hàu Thái Bình Dương 94 3.4.2 Độc tính DDT đến sinh trưởng phôi cá medaka 112 3.4.3 Kết đánh giá hình thái, cấu trúc gan cá medaka .120 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .124 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ .126 TÀI LIỆU THAM KHẢO .127 PHỤ LỤC I iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh Tiếng việt ADN Deoxyribonucleic Acid ANOVA Analysis of Variance Phân tích phương sai BAF Bioaccumulation factor Hệ số tích lũy sinh học BDL Below Detectable Level Dưới mức phát BR-VT Bà Rịa – Vũng Tàu BVTV Bảo vệ thực vật CA Cluster analysis Phân tích cụm DCM Dichloromethane Diclometan DDD DDE DDTs Dichloro-DiphenylDichloroethane Dichloro-DiphenylDichloroethylene Dichloro-DiphenylTrichloroethane Dichlorodiphenyldichloroetan Dichlorodiphenyldichloroetylen Dichlorodiphenyltrichloroetan DMSO Dimethyl sulfoxit Dimetyl sunfoxit EC Electrical Conductivity Độ dẫn điện EC50 Effective Concentration GC/MS GC/ECD HCH Gas chromatography–mass spectrometry Gas chromatography-electron capture detector Nồng độ ảnh hưởng đến 50% sinh vật phơi nhiễm Sắc ký khí – khối phổ Sắc ký khí – đầu dị bẫy điện tử Hexachlorocyclohexane KCN Khu cơng nghiệp KPH Không phát LC50 LOEC Lethal Concentration Nồng độ gây chết 50% sinh vật bị phơi nhiễm Lowest Observed Effect Nồng độ thấp có ảnh Concentration hưởng v LOQ NOEC OCPs Limit of Quantitation Giới hạn định lượng No Observed Effect Nồng độ cao khơng có ảnh Concentration hưởng Organochlorine Pesticides Hóa chất Bảo vệ thực vật nhóm clo hữu Principal Component Phân tích thành phần Analysis/Factor Analysis chính/Phân tích nhân tố PE Polyetylen Polietilen POPs Persistant Organic Pollutant PCA/FA QCVN Chất nhiễm hữu khó phân hủy Quy chuẩn Việt Nam Real-Time Polymerase Chain Phản ứng tổng hợp chuỗi Reaction polymerase thời gian thực SE Standard error Sai số chuẩn SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét RT-PCR TB Trung bình TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TDS TEM Total Dissolved Solids Transmission Electron Microscope Tổng chất rắn hịa tan Kính hiển vi điện tử truyền qua TLTK Tài liệu tham khảo TN&MT Tài nguyên Môi trường TOC Total Organic Carbon TP HCM Tổng cacbon hữu Thành phố Hồ Chí Minh TSS Total Suspended Solids Tổng chất rắn lơ lững WHO World Health Organization Tổ chức Tổ chức tế Thế giới vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Phân loại loại hóa chất BVTV Bảng Phân loại hóa chất BVTV nhóm clo hữu Bảng Ảnh hưởng số loại hóa chất BVTV phổ biến đến số sinh vật thủy sinh 27 Bảng Các sơng khu vực hạ lưu hệ thống sông Đồng Nai 29 Bảng Các cặp mồi phân tích Real-time PCR 34 Bảng 2 Hỗn hợp chuẩn gốc OCPs 34 Bảng Các hóa chất dùng phân tích 35 Bảng Kỹ thuật phân tích thơng số hóa lý mẫu nước mặt trầm tích .36 Bảng Bảng quy đổi hệ số Probit 43 Bảng Quy trình phản ứng Real-time PCR .44 Bảng Đặc điểm vị trí lấy mẫu cửa sơng Sài Gòn – Đồng Nai .48 Bảng Chỉ tiêu lý – hóa nước thủy vực nghiên cứu .54 Bảng Chỉ tiêu lý – hóa trầm tích thủy vực nghiên cứu .55 Bảng 3 Nồng độ OCPs (µg/L) nước hai mùa 56 Bảng Thành phần DDT (%) nước theo mùa .57 Bảng Thành phần HCHs (%) nước theo mùa 58 Bảng Nồng độ OCPs (µg/L) mẫu nước mặt thu thập từ nghiên cứu khu vực khác giới 59 Bảng Nồng độ OCPs (µg/L) nước hai nhóm 59 Bảng Thành phần tổng DDTs (%) nước theo nhóm 60 Bảng Thành phần HCHs (%) nước theo nhóm 61 Bảng 10 Nồng độ OCPs (µg/kg) trầm tích theo hai mùa .62 Bảng 11 Thành phần tổng DDTs (%) trầm tích theo mùa 63 Bảng 12 Thành phần tổng HCHs (%) trầm tích theo mùa 65 Bảng 3.13 Nồng độ OCPs (µg/kg) mẫu trầm tích thu thập từ khu vực khác giới 66 Bảng 14 Nồng độ OCPs (µg/kg) trầm tích hai nhóm .67 Bảng 15 Thành phần tổng DDTs (%) trầm tích theo nhóm 67 Bảng 16 Thành phần tổng HCHs (%) trầm tích theo nhóm 68 39 Phơi ấu trùng hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) ni Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam Bộ (BR-VT) môi trường nước biển nhân tạo, thành phần mơi trường pha theo quy trình BS ISO 17244 Chất lượng nước - Chỉ thị sinh học độc tính tiềm ẩn mơi trường nước - Xác định [76] Bố trí thí nghiệm bổ sung tách chiết DDTs trầm tích: Mẫu trầm tích lấy cửa sơng Sồi Rạp có toạ độ 10°25'56,2"N 106°46'48,1"E, sau thu thập phịng thí nghiệm rửa nước biển nhân tạo nhằm loại bỏ bớt số tạp chất trước sử dụng để bổ sung tách chiết Các bước bổ sung tách chiết DDTs trầm tích chuẩn bị theo quy trình Fathallah [77] DDTs bổ sung vào trầm tích với hàm lượng 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; (mg/kg) tương đương với thể tích DDTs 100 ppm bổ sung 2; 10; 20; 50; 200; 1000 (µg/L) Quy trình thực nghiệm thể Hình 2.2 đây: Hình 2 Sơ đồ tổng hợp bước bổ sung rửa giải trầm tích Phương pháp thực nghiệm sinh học: Thử nghiệm sinh học phôi, ấu trùng hàu Thái Bình Dương tiến hành đánh giá EC50 nhằm phát ngưỡng 50% cá thể chưa phân bào; LC50 nhằm phát ngưỡng nồng độ gây tử vong 50% cá thể hàu thử nghiệm Thí nghiệm sinh học hàu Thái Bình Dương ni Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam Bộ (BR-VT) thực theo quy trình Levertt Thain [78] tham khảo thêm số quy trình trước số loài nhuyễn thể hai mảnh 40 vỏ nhím biển Chung cộng [79] Lindsay cộng [80] Quy trình thể sơ đồ (Hình 2.3 2.4) Hình Sơ đồ tách trứng tinh trùng từ hàu bố mẹ Hình Sơ đồ thử nghiệm sinh học hàu Thái Bình Dương 41 2.2.2.2 Phơi, ấu trùng cá medaka Chuẩn bị cá phôi cá: Trong phạm vi luận án, cá medaka (O latipes) lấy giống từ Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam sử dụng để đánh giá độc tính DDTs đến phát triển phơi cá Cá medaka ni trì điều kiện nhiệt độ 28oC ± 10oC, pH: 6,5, độ cứng tổng: 13 mgCaCO3/L, độ kiềm tổng: 0,1 (mgCaCO3/L) chu kỳ chiếu sáng 14 sáng:10 tối với cường độ 500 lux Nước bể nuôi lọc liên tục để đảm bảo độ Cá cho ăn sản phẩm thương mại bán sẵn cho cá cảnh 1-2 lần/ngày bổ sung thức ăn tươi bobo Ngừng cho cá ăn khoảng nửa ngày trước tiến hành ghép đôi để phối cá Sau đó, tạo vách ngăn bể phối để tách riêng cá đực cá theo tỷ lệ 1:1 vào cuối chu kỳ sáng tháo vách ngăn để cá phối với Sau 30 phút cho phối, tồn phơi thu sang cốc thủy tinh 1000 mL tiến hành loại bỏ phôi không thụ tinh Các phôi tốt thu nhận vào đĩa petri thủy tinh có đường kính 35 mm để ni phơi Bố trí thí nghiệm bổ sung DDTs: Quy trình thí nghiệm luận án xây dựng theo hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất phôi cá Tổ chức hợp tác phát triển kinh tế (OECD 236 công bố ngày 26/7/2013) Nồng độ gốc DDTs 1235ppm (p = 97,8%) pha lỗng dung mơi hữu DMSO (dimethyl sulfoxide) 0,1% Chọn phơi khỏe mạnh (những phơi có cấu trúc suốt, màng phơi cịn ngun vẹn, khối nỗn hồng đặc đều) chuyển vào giếng thí nghiệm theo nồng độ tương ứng DDTs là: 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,2; 0,24; 0,28 µg/L đối chứng (0 µg/L) Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần, giếng có 10 phôi/nồng độ Phương pháp thực nghiệm sinh học: Thử nghiệm sinh học phôi, ấu trùng cá medaka tiến hành đánh giá LC50 nhằm phát ngưỡng nồng độ DDTs gây tử vong 50% phôi cá; quan sát thay đổi hình thái phơi, cá medaka sau phơi nhiễm nhằm xác định mức độ ảnh hưởng hóa chất phân tích biểu gen phơi cá thử nghiệm Nghiên cứu thực phòng Thủy sản Trung tâm sinh học TP HCM Quy trình thí nghiệm thể theo sơ đồ (Hình 2.5): 42 Hình Quy trình thực đánh giá độc tính DDTs với cá medaka 2.2.3 Các phương pháp đánh giá độc tính 2.2.3.1 Xác định LC50, EC50 tỷ lệ sống chết Tỷ lệ phôi, ấu trùng hàu cá tử vong thực tế nồng độ thử nghiệm sau 24, 48, 72 96 thí nghiệm tính theo cơng thức Abbott WHO sau: Tỷ lệ tử vong thực tế = ( tỷ lệ sống mẫu đối chứng−tỷ lệ sống mẫu thử nghiệm tỷ lệ sống mẫu đối chứng )×100 Hồi quy Probit, cịn gọi mơ hình probit, sử dụng để mơ hình biến kết nhị phân Trong mơ hình probit, phân bố chuẩn bình thường xác suất mơ hình hóa kết hợp tuyến tính yếu tố dự báo Phương pháp hồi quy sử dụng để xác định thông số EC50, LC50, NOEC, LOEC EC50 LC50 tính theo phương pháp Probit thơng qua phương trình hồi quy Y = y0 + ax phần mềm Sigmaplot, Excel phần mềm SPSS, SAS thực theo quy trình Yu cộng [81] Bảng hồi quy Probit (Bảng 2.5) 43 Bảng Bảng quy đổi hệ số Probit % ̶ 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45 30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72 40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 50 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33 ̶ 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99 7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09 2.2.3.2 Phương pháp phân tích qRT-PCR để đánh giá ảnh hưởng hóa chất BVTV đến cá medaka mức độ sinh học phân tử RT-PCR kỹ thuật thực phản ứng chuỗi polymerase định lượng (RTPCR) để khuếch đại trình tự nucleotide ngắn từ lượng nhỏ mơ tạo hàng ngàn đến hàng triệu trình tự ADN đặc hiệu Kỹ thuật RTPCR xác định biểu kiểu gen khác động vật thủy sinh mức độ gen thông thường nên ngày sử dụng rộng rãi việc giám sát môi trường ô nhiễm Kết đánh giá ảnh hưởng hóa chất BVTV DDTs lên hệ gen cá medaka luận án kiểm tra phương pháp phân tích RT-PCR (LightCycler® 96 System- Roche Life Science) Mẫu sau phơi nhiễm với DDTs thực hiện: phân tách RNA, tổng hợp cDNA, phân tích RT-PCR Qui trình cụ thể thực Hình 2.6 đây: 44 Hình Quy trình tóm tắt chuẩn bị mẫu phân tích Real-time PCR Trình tự mã hóa gen lựa chọn lấy từ sở liệu GenBank (PubMed-NCBI) HGNC (Ensembl, EMBL–EBI) Trình tự cặp mồi mã hóa trình bày theo cơng bố Barjhoux cộng [82] Phân tích biểu gen thực mẫu phôi cá medaka trưởng thành theo quy trình thời gian nhiệt độ (Bảng 2.6) Bảng Quy trình phản ứng Real-time PCR Thứ tự Số chu kỳ lập lại Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Bước 1X 95 94 0,5 50 0,5 72 0,5 Bước 40X Bước 1X 72 Bước 81X 65 – 95 0,5 45 Để có kết xác độc tính DDTs cá medaka, phân tích RT-PCR xác định thay đổi mức độ sinh học phân tử gen cá trước sau phơi nhiễm với DDTs khảo sát Phôi cá medeka trưởng thành phơi nhiễm với hóa chất BVTV DDTs nồng độ 1500 1700 g/L vòng 24 mà không cho ăn Sau phơi nhiễm, phôi cá cá trưởng thành giữ -80oC phân tích RT-PCR 2.2.3.3 Các phương pháp quan sát hình thái, cấu tạo tế bào Phương pháp kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope): Phương pháp sử dụng để xác định hình thái bề mặt kích thước bào quan sinh vật thí nghiệm Kính hiển vi điện tử quét SEM quét bề mặt mẫu chùm tia điện tử hội tụ cao chân khơng, thu thập thơng tin (tín hiệu) từ mẫu phát ra, tái tạo thành hình ảnh lớn cấu trúc bề mặt mẫu thông qua việc ghi nhận phân tích xạ phát từ tương tác chùm điện tử với bề mặt mẫu Trong luận án này, mẫu mô sinh vật hàu cá ly tâm (5000v/p) 10 phút để thu sinh khối tế tào Tiếp theo, mẫu tế bào xử lý dung dịch 2,5% glutaraldehyte/cacodylate 0,1M, pH = 7,2-7,4 Mẫu tiếp tục rửa dung dịch cacodylate 0,1M cố định lại dung dịch OsO4 1% cacodylate 0,1M Sau để khô, mẫu đưa lên đế, phủ màng dẫn điện Pt-Pd Mẫu tế bào quan sát kính SEM HITACHI S4800 Phịng kính hiển vi điện tử, Viện vệ sinh Dịch Tễ trung ương Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Transmission Electron Microscopy): Phương pháp có độ phân giải cao dùng để nghiên cứu hình thái, cấu trúc bào quan sau sinh vật phơi nhiễm với hóa chất BVTV Kính hoạt động nguyên lý nguồn phát xạ đỉnh phát chùm tia điện tử, sau qua tụ kính chùm điện tử tác động lên mẫu mỏng Tùy thuộc vào loại mẫu vị trí chụp mà chùm điện tử bị tán xạ nhiều hay Mật độ điện tử truyền qua mặt mẫu phản ánh tình trạng mẫu, hình ảnh phóng đại qua loạt thấu kính trung gian thể huỳnh quang 46 Tương tự, mẫu mô sinh vật hàu cá ly tâm (5000v/p) 10 phút để thu sinh khối tế tào Mẫu tế bào sau xử lý dung dịch 2,5% glutaraldehyte/cacodylate 0,1M, pH = 7,2 – 7,4 Mẫu tiếp tục rửa dung dịch cacodylate 0,1M cố định lại dung dịch OsO4 1% cacodylate 0,1M Sau mẫu xử lý cách kết tinh epoxyresin; cắt lát siêu mỏng mức 50 - 100nm nhuộm Uranyl Acetate quan sát lát cắt kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) độ phóng đại có hệ số phóng đại M = 50 - 600.000, độ phân giải δ = Å, điện áp gia tốc U = 40 – 100kV để quan sát khác biệt vi cấu trúc tế bào đối chứng (khơng phơi nhiễm với DDTs) mẫu thực nghiệm (có phơi nhiễm với DDTs) Trong luận án này, mẫu tế bào quan sát kính (TEM) JEOL 1010 (JEOL - Nhật Bản) Phịng kính hiển vi điện tử, Viện vệ sinh Dịch Tễ trung ương 2.3 Địa điểm lấy mẫu Các vị trí lấy mẫu lựa chọn sở khảo sát thực tế, đồ địa giới khu vực tiếp giáp với cửa sơng Sài Gịn – Đồng Nai (tính theo tọa độ) chọn để đại diện cho khu vực nghiên cứu Hình 2.7, 2.8 Bảng 2.7 Các mẫu nước, trầm tích sinh vật thu thập cửa sơng Sài Gịn – Đồng Nai, vị trí lấy lần vào mùa khô (tháng 2) lần mùa mưa (tháng 6) năm 2017 2018 Hệ thống sông tiếp nhận nguồn nước thải từ tỉnh Đồng Nai, Bình Dương TP HCM với tổng diện tích khoảng 38.600 km2 Có 02 nhánh sơng Sồi Rạp sơng Lịng Tàu tiếp nhận lượng nước từ hệ thống sơng Hơn nữa, có 02 nhánh sơng Vàm Cỏ (nhánh 1) Thị Vải (nhánh 2) kết nối với nhánh bổ sung thêm nước cho hệ thống sơng Khu vực nghiên cứu có 02 mùa rõ rệt mùa khô mùa mưa với tổng lượng mưa hàng năm từ 1700 – 2800 mm Hệ thống sơng Sài Gịn - Đồng Nai có chức cung cấp nước sinh hoạt cho gần 20 triệu người sống dọc theo lưu vực Tuy nhiên, hoạt động phát thải cạn làm chất lượng nước khu vực bị suy giảm tác động đến chất lượng trầm tích sinh vật thủy sinh cửa sơng, từ gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người Vì việc đánh giá ô nhiễm cửa sông Sài Gòn – Đồng Nai điều cần thiết cấp bách 47 Hình Bản đồ mơ tả vị trí lấy mẫu nước trầm tích 48 Hình Bản đồ mơ tả vị trí lấy mẫu sinh vật Bảng Đặc điểm vị trí lấy mẫu cửa sơng Sài Gịn – Đồng Nai TT Tên điểm quan Ký Tọa độ địa lý trắc hiệu X Sơng Sồi Rạp1 KCN Hiệp Phước ST 01 106.77083 10.61972 ST 02 601.116 1.173.128 ST 03 600.414 1.169.526 (TP HCM) Phà Cần Giuộc (chợ Cần Giuộc) Hợp lưu rạch Mồng Gà- sông Rạch Giá (Long An) Cầu Thủ Bộ (Long An) Cần Giuộc (Long An) Vị trí gần sơng có khu nghiệp phát triển mạnh Vị trí quan trắc nằm gần chợ Cần Giuộc Vị trí quan trắc ngã sơng Cần Giuộc- rạch Mồng Gà Vị trí quan trắc gần chân cầu Thủ ST 04 598.296 1.165.714 Bộ, cách chân cầu khoảng 100m hạ nguồn Vị trí quan trắc nằm ngã kênh Hợp lưu kênh Nước Mặn - sông Mô tả vị trí quan trắc Y Nước Mặn sơng Cần Giuộc, ST 05 600.356 1.161.029 khu vực dân cư sống đơng đúc có 01 bến phà nối 02 huyện Cần Giuộc Cần Đước 49 TT Tên điểm quan Ký Tọa độ địa lý trắc hiệu X Phà Bình Khánh (TP HCM) Khu vực phà Bình Khánh tập ST 06 106.77167 10.66972 Tam thơn Hiệp (TP trung nhiều dân cư, hoạt động đánh bắt chế biến thủy hải sản Nơi tập trung dân cư chảy Sơng Lịng Tàu7 Mơ tả vị trí quan trắc Y ST 07 106.84556 10.62167 quanh co cắt ngang rừng Sác trước đổ biển Đông HCM) Hợp lưu thành hệ thống sông riêng biệt nằm bờ trái sông Hợp lưu suối Cả sông Thị Vải ST 08 106.5831 10.4231 (Đồng Nai) Đồng Nai đổ biển vịnh Gành Rái, hạ lưu sông Thị Vải chịu ảnh hưởng thủy triều gần xưởng Vedan Giáp ranh Đồng Nai Bà Rịa - Vũng Tàu, gần công ty Cảng Gò Dầu (Đồng Nai) ST 09 107.01694 10.66139 TNHH nhựa hóa chất TPC Vina, nhà máy supe phốt phát Long Thành nhà máy xử lý nước thải KCN Gị Dầu Là cảng nước sâu nằm sơng 10 Cảng Phú Mỹ (Đồng Nai) ST 10 107.02611 0.58528 Thị Vải, nơi có khu cơng nghiệp giao thơng thủy sầm uất Vị trí quan trắc nằm ngã ba Ngã ba sơng Gị Da 11 sơng Cái Mép sơng Gị Da - sơng Cái Mép ST 11 107.01222 10.52361 (Đồng Nai) sông Thị Vải chạy dọc theo hai bờ sơng Gị Da, gần khu cơng nghiệp Nơi hợp lưu sông Ngã 12 Vịnh Gành Rái (Đồng Nai) Bảy, Đồng Tranh, sông Thị Vải, ST 12 107.00222 10.435 sông Dinh bán đảo Vũng Tàu, tập trung nhiều trại nuôi trồng thủy hải sản 50 2.4 Xử lý thống kê số liệu Các biến không gian tham số quan trọng đánh giá thông qua kỹ thuật thống kê đa biến bao gồm phân tích thành phần PCA phân tích cụm CA Phân tích PCA/FA áp dụng cho mùa nhóm để khảo sát nguồn nhiễm OCPs Ngoài ra, PCA/FA áp dụng cho toàn liệu để chia 12 vị trí phân biệt theo mùa hay theo biến đổi khơng gian Quy trình cụ thể kỹ thuật sử dụng nghiên cứu mô tả Eqani [83] CA cách tiếp cận phổ biến sử dụng phân tích mơi trường, phân cụm hình thành tuần tự, cách bắt đầu với cặp đối tượng tương đồng hình thành nhóm lớn theo bước Trong nghiên cứu tại, CA thực liệu chuẩn hóa dư lượng OCPs nước mặt, trầm tích sinh vật vùng cửa sơng Sài Gịn – Đồng Nai phương pháp Ward, sử dụng khoảng cách Euclidian làm thước đo độ tương đồng Các khoảng cách Euclidian thường cho tương đồng hai mẫu khác biệt giá trị phân tích hai mẫu biểu diễn dạng “khoảng cách” Phương pháp Ward quy tắc liên kết sử dụng phương pháp phân tích phương sai để đánh giá khoảng cách cụm với giá trị tối thiểu tổng bình phương hai cụm hình thành bước CA áp dụng liệu dư lượng OCPs cho vị trí nhóm có mơ hình dư lượng tương tự dạng Dendrogram Phân tích ANOVA chiều bố trí hồn tồn ngẫu nhiên thực để so sánh giá trị trung bình 02 mùa 02 nhóm Mơ hình tổng thể ANOVA 𝛾𝑖𝑗 = 𝜇 + 𝛼𝑗 +∈𝑖𝑗 , 𝛾𝑖𝑘 biến đáp ứng; 𝜇 trung bình tổng; 𝛼𝑗 tác động cố định mùa hay nhóm thứ jth; ∈𝑖𝑗 sai số ngẫu nhiên với trung bình phân bố chuẩn [84] Nếu ANOVA thể ý nghĩa P ≤ 0,05 cho OCPs nào, thử nghiệm Student áp dụng để phân chia theo mùa theo nhóm Mối liên hệ nồng độ OCPs nước trầm tích phân tích cách sử dụng mơ hình hồi quy tuyến tính đơn giản: 𝛾𝑖 = 𝛽1 + 𝛽2 𝑥𝑖 + ∈, 𝛾𝑖 nồng độ OCPs nước; 𝑥𝑖 nồng độ OCPs trầm tích; 𝛽1 hệ số chặn, 𝛽2 hệ số góc, ∈ sai số ngẫu nhiên Tất liệu tần số (%) hợp chất xuất mẫu nước, trầm tích sinh vật, trung bình, phạm vi dư lượng OCPs; độ lệch chuẩn, phương sai phân tích thống kê chương trình JMP 13 (SAS 51 Institute Inc, North Carolina, USA) Tất hình ảnh vẽ chương trình Sigmaplot 14 (Systat Software Inc.) Tổng kết chương 2: Nội dung chương thống kê sơ đồ hóa bước thực luận án thể Hình 2.9 dây 52 CỬA SƠNG SÀI GỊN – ĐỒNG NAI Trầm tích (n=48) Nước (n=48) Chiết tách Chiết tách pH, EC, TDS, độ đục, nhiệt độ Sinh vật (n=58) GC/ECD GC/ECD GC/ECD DDT, HCH, aldrin, heptachlor, dieldrin, endrin DDT, HCH, endosulfan, heptachlor, aldrin, dieldrin, endrin DDT, HCH, aldrin, heptachlor, dieldrin, endrin Đánh giá nồng độ môi trường theo: ▪ Mùa khơ, mùa mưa ▪ Nhóm 1, Đánh giá nồng độ sinh vật theo: ▪ Loài ▪ Khơng gian (vị trí) Phơi, ấu trùng hàu Thái Bình Dương Phôi, ấu trùng cá medaka DDT LC50, EC50 Hàm lượng lipit, tuổi, khối lượng, kích thước Chiết tách pH, TOC, thành phần giới DDT Tỷ lệ sống/chết RT-PCR Kính hiển vi Hình thái phơi SEM/TEM Ghi chú: Đánh giá OCPs nước, trầm tích Đánh giá OCPs cá nhuyễn thể hai mảnh vỏ Đánh giá độc tính DDTs lên phơi, ấu trùng hàu Thái Bình Dương, cá medaka Xác định phôi, ấu trùng gan cá: ▪ Hình thái bề mặt ▪ Kích thước bào quan Hình Sơ đồ nghiên cứu chung luận án Xác định biểu gen phôi, ấu trùng 53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN Dư lượng OCPs tần số mức độ khác phát mẫu nước, trầm tích sinh vật thu thập từ vị trí cửa sơng Sài Gịn – Đồng Nai Lượng hóa chất BVTV OCPs phát tất mẫu thu thập nhóm HCHs DDTs Ngồi cịn có phân nhóm cyclodien heptachlor, endosulfan, aldrin, dieldrin endrin phát từ mẫu nước, trầm tích sinh vật khu vực Mục tiêu chương đánh giá hàm lượng phân nhóm HCHs, DDTs cyclodien phát vị trí khác nước, trầm tích, thủy sinh vật cửa sơng Sài Gịn – Đồng Nai Kết báo cáo theo biến đổi theo thời gian, không gian, với nguồn gốc ô nhiễm tiềm ẩn OCPs khu vực nghiên cứu Đồng thời luận án tiến hành thử nghiệm độc tính hóa chất DDTs lên phơi, ấu trùng hàu Thái Bình Dương cá medaka 3.1 Phân nhóm địa điểm lấy mẫu Các vị trí lấy mẫu phân thành nhóm dựa tương đồng nồng độ sáu hóa chất BVTV OCPs nước trầm tích phương pháp CA (Chi tiết xem Phụ lục 1) Mười hai vị trí lấy mẫu nhóm thành hai cụm (Hình 3.1) Hình Biểu đồ phân tích cụm khơng gian vị trí lấy mẫu Nhóm bao gồm ba vị trí lấy mẫu ST03, ST04, ST08 nằm đầu hai nhánh sơng Nhóm gồm chín vị trí cịn lại nằm nhánh sơng gồm bốn vị trí hạ lưu