Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2022, Tập 13, Số 1, trang 1 8 1 Nghiên cứu điều kiện xác định hoạt độ CYP2E1 trong microsom phân lập từ gan chuột thực nghiệm Nguyễn Xuân Bắc1*, Nguyễn Thị Lập1, Mai[.]
Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2022, Tập 13, Số 1, trang 1-8 Nghiên cứu điều kiện xác định hoạt độ CYP2E1 microsom phân lập từ gan chuột thực nghiệm Nguyễn Xuân Bắc1*, Nguyễn Thị Lập1, Mai Văn Hiên1, Nguyễn Trịnh Quỳnh Anh2, Đào Thị Mai Anh1 Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại Học Dược Hà Nội SVK72, Trường Đại học Dược Hà Nội * Tác giả liên hệ: bacnx@hup.edu.vn (Ngày gửi đăng: 12/01/2022 – Ngày duyệt đăng: 25/02/2022) SUMMARY As a major source of variability in drug pharmacokinetics and response, the activity of CYP450 enzymes has received considerable attention in recent years This matter of fact makes CYP450 activity assays have crucial application in drug development The purpose of this study is to evaluate the conditions for determining the activity of CYP2E1, the highest expressed CYP enzyme in human livers In this context, the substrate (aniline) and cofactor (NADPH) concentrations and incubation time were investigated in rat liver microsomes (0,4 mg microsome/ml) The results indicate that the minimum concentration of aniline and NADPH needed using in the experiments was 250 µmol/L and 0.4 mmol/L, respectively in order to obtain the maximum reaction rate The research result also shows that the reaction duration longer than 20 minutes reduced the average reaction rate Hence, the proper condition for the CYP2E1 activity assay using 0.4 mg microsome/ml were established as follow: 250 µmol/L of aniline, 0.4 mmol/L of NADPH with the 20 minutes of reaction duration In this study, we used DMSO a selective inhibitor of CYP2E1 as a proof of concept to demonstrate the validity of the experimental methodology developed Từ khóa: microsom, gan chuột cống, xác định hoạt độ CYP2E1, anilin, NADPH, thời gian phản ứng Đặt vấn đề Các mơ hình in vitro, mơ hình sử dụng microsom để nghiên cứu ảnh hưởng chất nghiên cứu/dược liệu đến hoạt tính enzym cytochrom P450 (CYP450) có vai trị quan trọng nghiên cứu tương tác thuốc [1] Trong nghiên cứu trước [2] phân lập microsom chứa CYP450 từ gan chuột cống Xác định hoạt độ CYP450 chứa microsom bước để đánh giá chất lượng microsom thu thực nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng chất/dược liệu đến hoạt tính CYP450 Trong CYP450, CYP2E1 enzym biểu nhiều (chiếm 21 % tổng protein CYP450) có vai trị chuyển hóa nhiều thuốc paracetamol, isoniazid, ciplatin, lidocain [3] Nhiều nghiên cứu sử dụng chất anilin NADPH để xác định hoạt độ CYP2E1 [4, 5] chưa có nghiên cứu cơng bố nồng độ cần thiết chất để phản ứng có tốc độ cực đại (điều kiện cần thiết để xác định hoạt độ enzym) Bên cạnh đó, tốc độ phản ứng thay đổi theo thời gian thay đổi điều kiện phản ứng Do vậy, nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng nồng độ anilin, nồng độ nicotinamid adenin dinucleotid 2′-phosphat thời gian phản ứng tới tốc độ phản ứng hydroxyl hóa anilin xúc tác CYP2E1 có microsom phân lập từ gan chuột thực nghiệm, từ xác định điều kiện để xác định hoạt độ CYP2E1 cho nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng chất nghiên cứu đến hoạt tính enzym Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2022, Tập 13, Số 1, trang 1-8 Nguyên vật liệu trang thiết bị Microsom: phân lập từ gan chuột cống tuần tuổi theo phương pháp bổ sung calci [2] chứa CYP2E1 có hoạt độ riêng > 0,5 nmol/phút.mg protein Hóa chất: Nicotinamid adenin dinucleotid 2′-phosphat (NADPH), anilin (dạng muối hydrochlorid), dimethyl sulfoxid (DMSO), natri carbonat, calci chlorid, paminophenol, acid trichloacetic, phenol, sucrose, glycerol, đệm phosphat pH 7,4, TrisHCl, BCA kit (Sigma-Aldrich, Mỹ) Trang thiết bị: Máy ly tâm Mikro 220R (Hettich, Đức), máy ly tâm Supra R22 (rotor 6x50 ml) (Hanil, Hàn Quốc), máy nghiền đồng thể WiseStir (B Braun, Đức), máy đọc đĩa iMark (Bio-Rad, Nhật Bản) Phương pháp nghiên cứu Phương pháp xác định tốc độ phản ứng Tốc độ phản ứng hydroxyl hóa anilin biểu thị số nmol p-aminophenol tạo thành phút xúc tác CYP2E1 Tốc độ phản ứng tính tốc độ trung bình khoảng thời gian phản ứng Hỗn hợp gồm dung dịch đệm phosphat (0,7 ml), microsom (0,1 ml nồng độ mg/ml) anilin (0,1 ml nồng độ 160 – 120000 μmol/L) ủ phút 37 °C trước bổ sung NADPH (0,1 ml nồng độ – 16 mmol/L) Sau bổ sung NADPH, hỗn hợp phản ứng tiếp tục ủ khoảng thời gian khác (10 - 40 phút) (thời gian phản ứng) 37 °C bổ sung 0,5 ml acid trichloacetic 20% để kết thúc phản ứng Hỗn hợp lắc (vortex) ly tâm 8000 g phút để thu dịch Lượng p-aminophenol dịch xác định theo phương pháp mô tả mục “Phương pháp định lượng p-aminophenol” Phương pháp định lượng p-aminophenol Dịch từ hỗn hợp phản ứng (0,1 ml) ủ với Na2CO3 10 % (0,05 ml) phenol % (0,1 ml) 30 phút nhiệt độ phòng tiến hành đo độ hấp thụ ánh sáng dung dịch thu bước sóng 630 nm Dựa vào đường chuẩn p-aminophenol (2 – 250 μmol/L) để xác định nồng độ p-aminophenol tạo thành hỗn hợp phản ứng Từ xác định tốc độ phản ứng hydroxyl hóa anilin tạo thành p-aminophenol (nmol/phút) Phương pháp xác định ảnh hưởng DMSO DMSO hòa tan dung dịch đệm phosphat ủ phút 37 °C với 0,1 ml microsom nồng độ mg/ml, 0,1 ml dung dịch anilin trước bổ sung 0,1 ml NADPH Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng ml nồng độ DMSO hỗn hợp phản ứng – % Nồng độ anilin, nồng độ NADPH thời gian phản ứng thích hợp xác định nghiên cứu Tốc độ phản ứng có mặt khơng có mặt (nồng độ DMSO 0) sử dụng để xác định khả ức chế hoạt tính xúc tác phản ứng hydroxyl hóa anilin CYP2E1 Nồng độ DMSO ức chế 50 % hoạt tính CYP2E1 (IC50) xác định phần mềm Graphpad prism 8.0 (San Diego, Hoa Kỳ) Phương pháp xử lý số liệu Kiểm định t-test one-way ANOVA sử dụng để so sánh tốc độ phản ứng nhóm khác Sự khác có ý nghĩa p < 0,05 Kết nghiên cứu Ảnh hưởng của nồng độ anilin Các nghiên cứu CYP2E1 thường áp dụng thời gian phản ứng 20 phút, nồng độ NADPH mmol/L [4-6] Trong số nghiên cứu (chưa công bố) Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, 2022, Tập 13, Số 1, trang 1-8 không thấy có khác biệt đến tốc độ phản ứng sử dụng NADPH nồng độ mmol/L so với 0,4 mmol/L Vì chúng tơi thực khảo sát ảnh hưởng nồng độ anilin khoảng 16 – 12000 µmol/L đến tốc độ phản ứng điều kiện thời gian phản ứng 20 phút, nồng độ NADPH 0,4 mmol/L Kết cho thấy, khoảng nồng độ 16 – 250 µmol/L, tăng nồng độ anilin làm tăng đáng kể tốc độ phản ứng (p < 0,001) Tuy nhiên, tăng gấp đôi nồng độ anilin khoảng 250 - 12000 µmol/L khơng làm tăng tốc độ phản ứng (p > 0,05) (hình 1) Hình Ảnh hưởng nồng độ anilin khoảng 16 – 500 µmol/L đến tốc độ phản ứng Giá trị trung bình ± SD biểu thị biểu đồ dựa thí nghiệm lặp lại, sử dụng phần mềm Graphpad 8.0, phân tích one-way ANOVA, khác biệt có ý nghĩa p