Nguyên tắc tách chiết RNA − Cần phải được nhiều RNA, sạch, toàn phần không bị gãy mới có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nhân gen và nghiên cứu biểu hiện của gen.. Muốn vậy cần phải l
Trang 1PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT RNA TOÀN PHẦN VÀ mRNA.
1 Nguyên tắc tách chiết RNA
− Cần phải được nhiều RNA, sạch, toàn phần không bị gãy mới có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nhân gen và nghiên cứu biểu hiện của gen Muốn vậy cần phải làm bất hoạt enzyme endonuclease như RNase và ngăn cản sự xâm nhập của enzyme RNase từ bên ngoài vào
− Điều khó khăn là phần lớn các RNA đều không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease, vì thế bước đầu tiên của quy trình tách chiết là phân rã tế bào trong môi trường hóa học có khả năng làm biến tính RNase
− Các enzyme này lại rất bền vững và hoạt động mạnh không cần có sự tham gia của yếu tố cộng nhân tố, thậm chí nhiều khi xử lý ở nhiệt độ 90oC trong một giờ vẫn không làm bất hoạt được men này Chúng tồn tại ở khắp nơi, ở rất nhiều trên đầu ngón tay, chính vì thế mọi dụng cụ đều phải dùng mới hoặc sử dụng một lần
− Khi thao tác phải đeo găng tay, khẩu trang, các dung dịch, nước hoặc muối khi
sử dụng để chiết xuất RNA đều phải xử lý bằng hóa chất Diethylpysocarbbonate (DEPC), hóa chất này làm bất hoạt men RNase bằng cách làm biến đổi liên kết cộng hóa trị phosphodiester
− Tất cả các dung dịch dùng để chiết xuất RNA tuyệt đối không được lẫn tạp RNase, muốn thế thì tất cả các dung dịch trừ dung dịch TES vì chứa Tris-Cl chất này làm bất hoạt DEPC, sau khi thêm dung dịch Guanidium đều phải được xử lý DEPC
2 Các bước chiết xuất cơ bản.
− Tế bào, mô (nơi có gen mục tiêu hoạt động) được lấy mẫu và nghiền trong dung dịch có chứa các chất tẩy mạnh như SDS và Sarkosyl ở nồng độ cao kết hợp với 2 tác nhân gây biến tính protein mạnh và hiệu quả là: Guanidinium thiocyanate và 2 mercaptoethanol, 2 chất này có tác dụng ức chết hoạt động của các RNase nội bào và tách các protein liên kết ra khỏi RNA
− Loại bỏ các protein ra khỏi mẫu bằng cách xử lý Phenol:Choloroform rồi quay
li tâm, để kết tủa protein và cặn bã cò nucleic axit sẽ hòa tan ở phần trên
− Kết tủa nucleic axit (RNA và DNA) bằng cách thêm lượng ethanol dư thừa tách DNA ra khỏi RNA nếu cần thiết, trong nhiều trường hợp không cần thiết tách, bằng cách dùng 8M LiCL với lượng thêm vào bằng ½ thể tích của mẫu để
có nồng độ làm việc của LiCl là 2M, để kết tủa qua đêm ở nhiệt độ 4oC
− Như chúng ta đã biết, có 3 loại RNA nồng độ mỗi loại khác nhau tùy theo từng
tế bào, mô và giai đoạn sinh trưởng phát triển Nhìn chung, Rrna chiếm
Trang 280-85% Trna từ 15-20%, hai loại này có kích thước và trình tự xác định đặc biệt tRNA nhỏ, có thể tách riêng ra một cách dễ dàng bằng li tâm hoặc điện di Vì mục đích tách chiết RNA chủ yếu là tách chiết được nhiều và được nguyên vẹn mRNA, loại này chỉ chiếm 1-5% tổng RNA Tất nhiên, hàm lượng này còn phụ thuộc vào mô tế bào Đặc điểm của mRNA ở sinh vật nhân thực phần lớn đều
có đầu 3’ đính poly A, tùy mRNA có thể lên tới 100A Dựa vào đặc tính này và đặc tính liên kết bổ sung A=T của nucleic axit người ta có thể tách riêng mRNA ra khỏi hỗn hợp RNA tổng số bằng phương pháp sắc ký ái lực trên cột oligon dT cellulose Hiện nay, trên thương trường người ta bán những bộ KIT, thay bằng cột oligo dT là các viên bi từ có mang oligo dT trên bề mặt Đổ các viên bi này vào dung dịch RNA tổng số, sau đó các viên bi này được thu nhận lại và rửa bằng môi trường pH kiềm thì các mRNA sẽ được tách trở ra Nhờ kỹ thuật này đã cho phép chúng ta thu được chỉ mRNA từ những mẫu, mô tế bào nhỏ
Sau khi có mRNA thì bược tiếp là phải tinh sạch bằng phương pháp kết tủa, điện di hay sắc ký Cuối cùng là định tính và định lượng mRNA