Bài 3 KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT Nguyên tắc phân lập vi sinh vật Phân lập VSV là một quá trình tách rời một loại VSV nào đó từ quần thể VSV, sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạc.
Bài 3: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT Nguyên tắc phân lập vi sinh vật Phân lập VSV trình tách rời loại VSV từ quần thể VSV, sau gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc Sau ủ điều kiện thích hợp VSV phân chia nhiều lần tạo thành quần thể mọc riêng biệt gọi khuẩn lạc Các chủng VSV thu nhận từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa khiết khuẩn lạc hình thành nhiều tế bào, phải làm nhiều lần thu chủng VSV khiết Nguyên tắc phân lập VSV - Cấy dịch chứa VSV pha loãng môi trường dinh dưỡng đặc trưng - Nuôi điều kiện thích hợp cho mọc khuẩn lạc tách biệt - Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng VSV khiết Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa mơi trường lỏng Dùng que cấy vịng làm theo trình tự bước sau: Ống nghiệm cầm tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út lịng bàn tay tay phải dùng để mở giữ nút Sau khử trùng que cấy, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm cách hơ qua lửa đèn cồn Đưa que cấy khửu trùng vào bên ống nghiệm hay bình tam giác nhúng vào canh trường lấy canh trường chứa vi sinh vật mà không để đầu que cấy chạm vào thành miệng ống nghiệm Đầu que cấy có dính VSV giữ không gian vô trùng gần lửa đèn cồn Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khửu trùng miệng ống nghiệm, đưa que cấy vào bên ống nghiệm nhúng vào canh trường khuấy nhẹ que cấy Rút que cấy ra, hơ miệng ống nghiệm nút đậy lại Để ống nghiệm vào giá, đốt que cấy đèn cồn trước trả giá để que cấy Dán nhãn lên ống môi trường gieo cấy: ghi tên vi sinh vật ngày gieo cấy Chú ý: Khi cấy truyền từ ống nghiệm sang ống nghiệm cầm hai ống nghiệm lúc bàn tay trái Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống nghiệm thạch nghiêng Thường sử dụng que cấy vòng Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng, khác bước Sau lấy sinh khối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que cấy vào ống nghiệm cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên Cấy đâm sâu ống nghiệm thạch đứng Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào môi trường thạch đứng Các bước tiến hành tương tự, có điểm khác sau: Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống để tránh việc nhiễm khuẩn lúc gieo cấy Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch gần đáy ống nghiệm Lưu ý: Khi cắm que cấy vào rút que cấy ra, ý phải giữ que cấy thẳng, nhẹ nhàng không làm cho môi trường bị nứt nẻ CÂU HỎI ÔN TẬP tắc: Người ta phân lập VSV từ môi trường tự nhiên dựa nguyên Vi sinh vật tồn tự nhiên dạng quần xã gồm nhiều quần thể loài vi sinh vật khác Phân lập loài định quần xã vi sinh vật dựa vào khả phân tách tế bào thành riêng lẻ môi trường chọn lọc Trong nhà máy lên men bia, sơ ý kỹ thuật, người ta làm giống nấm men có khả chịu nồng độ ethanol cao Em đề xuất bước tiến hành phân lập giống nấm men có đặc tính để thu hồi tàng trữ Trình bày phương pháp phân lập vi sinh vật kỹ thuật cấy ria kỹ thuật pha loãng kết hợp với cấy trải Kỹ thuật cấy ria ống nghiệm thạch nghiêng - Bước 1: ống nghiệm cầm tay trái, tay phải cầm que cấy, ngón út lịng bàn tay tay phải dùng để mở giữ nút Sau khử trùng que cấy, mở nút ống chứa vi sinh vật, khử trùng miệng ống nghiệm cách hơ qua lửa để khử trùng - Bước 2: Đưa que cấy khử trùng vào bên ống nghiệm hay bình tam giác nhúng vào canh trường lấy sinh khối vi sinh vật mà không để đầu que cấy chạm vào thành miệng ống nghiệm - Bước 3: Mở nút ống thạch cần cấy, khử trùng miệng ống nghiệm, đưa que cấy vào đáy ống nghiệm ria theo đường dzích dzắc từ kéo hướng miệng ống nghiệm - Bước 4: Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm nút đậy lại - Bước 5: Để ống nghiệm vào giá, đốt que cấy đèn cồn trước trả giá để que cấy - Bước 6: Dán nhãn lên ống môi trường gieo cấy, ghi tên vi sinh vật ngày gieo cấy Kỹ thuật cấy ria đĩa thạch - Bước 1: Lắc ống nghiệm nuôi cấy vi sinh vật - Bước 2: Khử trùng đầu que cấy lửa nóng đỏ - Bước 3: Mở nút khử trùng miệng ống nghiệm - Bước 4: Nhúng que cấy vào canh khuẩn để lấy giống - Bước 5: Tiệt trùng miệng ống nghiệm để que cấy có vi sinh vật khơng gian vơ trùng - Bước 6: Tiệt trùng nút bơng đóng nút ống nghiệm - Bước 7: Tay trái mở nắp Petri, tay phải cầm que cấy ria bề mặt thạch - Bước 8: Khử trùng que cấy sau cấy ria xong Kỹ thuật pha loãng mẫu - Bước 1: Cân 10g (hoặc 25g) hút 10ml (hoặc 25ml) mẫu vào bình tam giác có 90ml (hay 225ml) SPW - Bước 2: Nếu mẫu rắn đồng mẫu máy dập mẫu (stomacher) hay xay mẫu cối vô trùng tối đa 2,5 phút - Bước 3: Lắc mẫu bình tam giác phút ta mẫu có độ pha lỗng 10-1 - Bước 4: Dùng pipetteman với đầu tip vô trùng (hay pipette 1ml vô trùng) hút 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm để độ pha loãng - Bước 5: Trộn mẫu ống nghiệm cho máy vortex mixer hay lắc mạnh tay ta độ pha loãng Kỹ thuật hộp trải - Bước 1: Dùng micropipette đầu tip vô trùng hút 0.1ml dịch vi sing vật lên bề mặt môi trường thạch đĩa không gian vô trùng - Bước 2: Nhúng đầu que trang cốc thủy tinh chứa cồn 700 , đốt lửa đèn cồn để khử trùng Để đầu que trải nguội không gian vô trùng ( gần lửa đèn cồn) - Bước 3: Mở đĩa petri, dùng que trang gạt giọt vi sinh vật bề mặt thạch Dùng que trang gạt xoay bề mặt thạch Trong gạt, xoay đĩa petri tới lui 3-4 lần, lần ½ chu vi cho dịch vi sinh vật trải khắp trê bề mặt môi trường - Bước 4: Rút que trang khỏi đĩa, đậy đĩa, gói giấy ủ nhiệt độ thời gian thích hợp theo đối tượng vi sinh vật mục tiêu