Bnước đầu nghiên cứu thành phần hóa thực vật và một số hoạt tính sinh học từ lá cây trứng cá muntingia calabura l

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Học viên thực Luận văn ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường tất thầy cô truyền dạy kiến thức quý báu cho em suốt năm học vừa qua Qua em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Ngọc Hồng người định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp Bên cạnh em xin cảm ơn thầy Phịng Thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường bạn nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln bên cạnh, động viên lúc khó khăn, nản lịng suốt thời gian học tập, nghiên cứu sống iii TÓM TẮT Cây trứng cá (Muntingia calabura) trồng nhiều miền Nam Việt Nam thường dùng để làm bóng mát hoạt tính sinh học nghiên cứu Trong nghiên cứu dịch chiết ethanol 70% (EMC70), ethanol 90% (EMC90) dịch chiết nước (AMC) từ trứng cá sử dụng để đánh giá sơ thành phần hóa học khảo sát số hoạt tính sinh học bao gồm: Khả chống oxi hóa, khả kháng khuẩn, khả điều hịa đường huyết, khả trị tiêu chảy, khả giải độc gan đồng thời định tính số thành phần hóa học phương pháp LC-MS/MS Kết định tính cho thấy có nhiều hợp chất phenolic, flavonoid, tannin steroid dịch chiết EMC70 EMC90, AME chứa saponin amino acid tự Kết định tính cho thấy hàm lượng pholyphenol, flavonoid tannin tổng số dịch chiết EMC70 cao Khả kháng khuẩn EMC70 EMC90 tương đương chủng E.coli-ETEC, Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria innocua Staphylococcus aureus Dịch chiết EMC90 có khả hạ đường huyết tốt tổng số loại dịch chiết lại nồng độ 200 mg/kg Khả ức chế tiêu chảy dịch chiết EMC70 nồng độ 750 mg/kg lên tới 78,87 % tương đương với đối chứng loperamide mg/ml Khả giải độc gan loại dịch chiết xác định dựa số men gan ALT AST Dịch chiết EMC70 nồng độ 50 mg/kg với kết giá trị ALT giảm đáng kể so với lúc trước chữa trị Phân tích HPLCMS dịch chiết EMC70 cho kết hướng tới diện chrysoeriol có khả bảo vệ gan nhiễm độc tác động tích cực điều trị bệnh tiểu đường Một số chất khác thuộc nhóm flavonoid tìm thấy dịch chiết Kết tổng hợp cho thấy Muntingia calabura có hoạt tính chống oxi hóa, tiềm kháng khuẩn số chủng vi sinh gây bệnh đường ruột, khả trị tiêu chảy, điều hòa đường huyết bảo vệ gan dịch chiết ethanol iv ABTRACT Muntingia calabura L was grown in southern Vietnam Until now there are not many scientific articles published on the bioactivity of Muntingia calabura leaves In this study, ethanol 70% extract (EMC70), ethanol 90% extract (EMC90) and aqueous extract (AMC) from Muntingia calabura leaves are used to test phytochemical and evaluation of bioactivities such as antioxidant, antimicrobial activity, hypoglycemia, anti-diarrhea and hepatoprotective activity Determination of compounds by high performance liquid chromatography ‒ mass spectrometry (HPLC/MS) The result of phytochemical screening showed that phenolics, flavonoids, tannins and steroids in EMC70 and EMC90 AMC with saponins and free amino acids Result of EMC70 in total polyphenol content, total flavonoid content and total tannin content were highest Antimicrobial activity of EMC70 and ECM90 were the same in E.coli-ETEC, Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Listeria innocua and Staphylococcus aureus Anti-diarrhea activity of EMC70 was reached 78.87% and it was equivalent to the group was treated by loperamide mg/ml Hepatoprotective activity of EMC70, EMC90 and AMC was determined based on ALT and AST EMC70 resulted in a significant reduction in ALT at 50 mg/kg compared with prior to treatment Qualitative HPLC/MS analysis of EMC70 was showed the results toward the presence of chrysoeriol that is capable of protecting the liver from toxicity as well as positive effects in treatment of diabetes Other flavonoid compounds were found in this extract The results in this study were showed that Muntingia calabura had antioxidant activity, potential antimicrobial activity, antidiarrhea activity, hypoglycemia and hepatoprotective activity of ethanol extracts v MỤC LỤC TRANG LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii ABTRACT iv MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DÁNH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xiii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Muntingia calabura 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm chung Muntingia calabura 1.1.4 Công dụng 1.1.5 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học Muntingia calabura 1.1.6 Cây trứng cá thuốc dân gian 1.1.7 Các nghiên cứu nước 1.2.Tổng quan chất chống oxi hóa 11 1.2.1 Khái niệm chất chống oxi hóa 11 1.2.2 Cơ chế chống oxi hóa hợp chất tự nhiên 11 1.2.3 Một số chất tự nhiên từ thực vật có khả chống oxi hóa 11 1.3 Vi sinh vật thị 12 1.3.1 Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Escherichia 12 1.3.2 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Listeria 13 1.3.3 Nhóm vi khuẩn thuộc dịng Shigella 15 1.3.4 Nhóm vi khuẩn thuộc dòng Staphylococcus 17 1.4 Hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 19 1.4.1 Khái niệm hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 19 vi 1.4.2 Cơ chế kháng khuẩn hợp chất từ thực vật 19 1.5 Giới thiệu bệnh tiểu đường 22 1.5.1 Khái niệm 22 1.5.2 Phân loại 23 1.5.3 Thuốc trị tiểu đường glibenclamide 24 1.6 Giới thiệu bệnh tiêu chảy 25 1.6.1 Khái niệm 26 1.6.2.Nguyên nhân gây bệnh 26 1.6.3 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy 28 1.6.4 Cơ chế gây tiêu chảy tác nhân castor oil 29 1.6.5 Thuốc trị tiêu chảy loperamide 29 1.7 Giới thiệu bệnh gan acetaminophen 30 1.7.1 Các bệnh gan 30 1.7.2 Các loại enzyme gan 30 1.7.3 Cơ chế gây độc gan acetaminophen 31 1.7.4 Thuốc giải độc gan Silymarin 33 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1.Thời gian địa điểm 34 2.1.1 Thời gian 34 2.1.2 Địa điểm 34 2.2 Đối tượng nghiên cứu 34 2.2.1 Nguyên liệu thực vật 34 2.2.2 Vi sinh vật thị 34 2.2.3 Đối tượng động vật 34 2.2.4 Hóa chất, dụng cự thiết bị 34 2.3 Phương pháp nghiên cứu 35 2.3.1 Thu hái xử lý mẫu 35 2.3.2 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 35 2.3.3 Phương pháp xác định thành phần hóa học 38 2.3.4 Hàm lượng flavonoid tổng số 39 2.3.5 Hàm lượng phenolic tổng số 39 vii 2.3.6 Hàm lượng tannin tổng số 39 2.3.7 Phương pháp FRAP 39 2.3.8 Khả chống oxy hóa quét gốc tự DPPH 40 2.3.9 Phương pháp xác định lực khử 40 2.3.10 Hoạt tính kháng khuẩn 40 2.3.11 Xác định độc tính cấp diễn 40 2.3.12 Mơ hình chuột tiểu đường cấp tính 41 2.3.13 Mơ hình cḥt bi ̣nhiễm đợc acetaminophen 41 2.3.14 Mơ hình chuột tiêu chảy castor oil 41 2.3.15 Phương pháp sắc ký cao áp ghép khối phổ (HPLC-MS) 41 2.3.16 Xử lý số liệu 41 2.4 Bố trí thí nghiệm 41 2.4.1 Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết EMC70, EMC90 AMC từ Muntingia calabura 43 2.4.2 Thí nghiệm 2: Định tính số thành phần hóa học có 43 2.4.3 Thí nghiệm 3: Hàm lượng flavonoid tổng số 46 2.4.4 Thí nghiệm 4: Hàm lượng phenolic tổng số 46 2.4.5 Thí nghiệm 5: Hàm lượng tannin tổng số 47 2.4.6 Thí nghiệm 6: Khả chống oxi hóa phương pháp FRAP 47 2.4.7 Thí nghiệm 7: Khả chống oxi hóa quét gốc tự DPPH 48 2.4.8 Thí nghiệm 8: Xác định lực khử 49 2.4.9 Thí nghiệm 9: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết EMC70, EMC90 AMC từ Muntingia calabura 51 2.4.10 Thí nghiệm 10: Xác định độc tính cấp diễn 52 2.4.11 Thí nghiệm 11: Mơ hình chuột tiểu đường cấp tính 53 2.4.12 Thí nghiệm 12: Mơ hình chuột bi ̣nhiễm độc acetaminophen 54 2.4.13 Thí nghiệm 13: Mơ hình chuột tiêu chảy castor oil 55 2.4.14 Thí nghiệm 14: Định tính phương pháp sắc ký sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ HPLC 56 CHƯƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 57 3.1 Bước đầu góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 57 3.1.1 Khảo sát vi phẩu soi bột dược liệu 57 viii 3.1.2 Độ tinh khiết dược liệu 61 3.1.3 Hàm lượng cắn thu từ dịch chiết trứng cá 62 3.2 Thành phần hóa học có Muntingia calabura 62 3.3 Định lượng flavonoid phenolic tannin 65 3.4 Khả chống oxy hóa 65 3.4.1 Khả chống oxi hóa theo phương pháp FRAP 65 3.4.2 Khả chống oxi hóa theo phương pháp xác định lực khử 67 3.4.3 Khả chống oxi hóa quét gốc tự DPPH 68 3.5 Hoạt tính kháng khuẩn 72 3.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ Muntingia calabura 72 3.5.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dịch chiết EMC70, EMC90 AMC 76 3.6 Độc tính cấp diễn 79 3.7 Khả điều hịa đường huyết mơ hình chuột tiểu đường cấp tính 80 3.8 Khả trị tiêu chảy mơ hình castor oil 82 3.9 Khả giải độc gan mô hình acetaminophen 85 3.10 Phân tích sắc kí HPLC-MS 89 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 93 4.1 Kết luận 93 4.2 Đề nghị 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 ix DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMC: Aqueous extract of Muntingia calabura (Dịch chiết nước từ Muntingia calabura) EMC70: 70% ethanol extract of Muntingia calabura (Dịch chiết ethanol 70% từ Muntingia calabura) EMC90: 90% ethanol extract of Muntingia calabura (Dịch chiết ethanol 70% từ Muntingia calabura) FRAP: Ferric reducing antioxidant power (Khả chống oxi hóa thơng qua việc khử sắt) HPLC/MS: High performance liquid chromatography / mass spectrometry (Sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ) PSMs: Plant secondary metabolites: (Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật) x DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 1.1 Một số hợp chất có khả kháng khuẩn từ thực vật 20 Bảng 2.1 Các tiêu theo dõi 52 Bảng 3.1 Độ ẩm bột dược liệu 61 Bảng 3.2 Định tính thành phần hóa học có Muntingia calabura L 63 Bảng 3.3 Hàm lượng polyphenol, flavonoid tannin tổng số 65 Bảng 3.4 Kết tính toán giá trị FRAP 66 Bảng 3.5 Tương quan pearson hàm lượng polyphenol flavonoid với khả chống oxi hóa theo phương pháp FRAP 66 Bảng 3.6 Tương quan pearson hàm lượng polyphenol flavonoid với khả chống oxi hóa theo theo lực khử 68 Bảng 3.7 Kết IC50 chống oxi hóa quét gốc tự DPPH 70 Bảng 3.8 Tương quan pearson hàm lượng polyphenol flavonoid với khả chống oxi hóa quét gốc tự DPPH 70 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết EMC70, EMC90 AMC (100 mg/ml) chủng vi sinh vật khác 74 Bảng 3.10 Hoạt tính kháng khuẩn từ Muntingia calabura L nồng độ 100 mg/ml 75 Bảng 3.11 Nồng độ ức chế tối thiểu EMC70 nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml 77 Bảng 3.12 Nồng độ ức chế tối thiểu EMC90 nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml 77 Bảng 3.13 Nồng độ ức chế tối thiểu AMC nồng độ 50 mg/ml, 25 mg/ml, 12.5 mg/ml 78 Bảng 3.14 Kết phân tích số hợp chất từ dịch chiết Muntingia calabura phương pháp sắc ký HPLC-MC 89 232 137 96 277 149 105 259 145 87 251 166 85 270 157 91 c e Trung bình 253±19 152±11 90±9f Kết đo men gan (AST) mơ hình acetaminophen nhóm chuột uống dịch chiết AMC nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg 50 mg/kg từ Muntingia calabura 15 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg STT AST (IU/L) 475 411 307 501 420 322 455 359 256 527 405 331 550 312 310 549 452 288 c d Trung bình 510±39 393±50 302±27e Kết đo men gan (ALT) mơ hình acetaminophen nhóm chuột uống dịch chiết sylimarin nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg 50 mg/kg từ Muntingia calabura 15 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg STT ALT (IU/L) 44 37 20 35 20 27 49 25 35 27 33 18 30 45 31 45 39 39 g g Trung bình 38±9 33±9 28±8g Kết đo men gan (AST) mơ hình acetaminophen nhóm chuột uống dịch chiết sylimarin nồng độ 15 mg/kg, 25 mg/kg 50 mg/kg từ Muntingia calabura 15 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg STT AST (IU/L) 114 133 117 139 107 120 155 129 128 102 111 104 130 138 111 131 107 135 Trung bình 128±19g 121±14gh 119±11gh Kết đo men gan (ALT) mơ hình acetaminophen nhóm chuột uống acetaminophen nhóm đối chứng Độc Đối chứng STT ALT (IU/L) 434 38 509 40 420 22 480 33 515 38 443 30 a Trung bình 467±40 34±8g Kết đo men gan (AST) mơ hình acetaminophen nhóm chuột uống acetaminophen nhóm đối chứng chuột khỏe mạnh Độc Đối chứng STT AST (IU/L) 785 74 741 83 760 77 793 65 782 71 775 59 a Trung bình 773±19 72±8h PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ Hàm lượng cắn thu Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 1.884978 Critical Value of t 3.70743 Least Significant Difference 4.156 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MAU A 22.590 AMC B 18.210 EMC70 C 7.307 EMC90 Định lượng Tương quan Pearson Pearson Correlation Coefficients, N = Prob > |r| under H0: Rho=0 POL POL FLA 1.00000 0.91114 FLA 0.91114 0.82256 0.0006 0.0065 1.00000 0.56705 0.0006 TAN TAN 0.1113 0.82256 0.56705 0.0065 0.1113 1.00000 Chống oxi hóa Tương quan Pearson Khả chống oxi hóa quét gốc tự DPPH với kết định lượng phenolic flavonoid Pearson Correlation Coefficients, N = Prob > |r| under H0: Rho=0 CHONGOXIHOA CHONGOXIHOA 1.00000 POLY FLAVON -0.45667 -0.78111 Pearson Correlation Coefficients, N = Prob > |r| under H0: Rho=0 CHONGOXIHOA POLY -0.45667 POLY FLAVON 0.2166 0.0129 1.00000 0.91114 0.2166 FLAVON 0.0006 -0.78111 0.91114 0.0129 0.0006 1.00000 Tương quan Pearson Khả chống oxi hóa theo phuong pháp FRAP với kết định lượng phenolic flavonoid Pearson Correlation Coefficients, N = Prob > |r| under H0: Rho=0 CHONGOXIHOA CHONGOXIHOA POLY 1.00000 0.98537 POLY FLAVON 0.98537 0.93520 |r| under H0: Rho=0 CHONGOXIHOA 0.0016 POLY FLAVON 0.0006 Hoạt tính kháng khuẩn ETEC Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 547.0555556 273.5277778 Error 4.1666667 0.6944444 Corrected Total 551.2222222 393.88 F Model 13 530.7569444 40.8274573 Error 22 4.3194444 0.1963384 Corrected Total 35 535.0763889 207.94 F Model 12 218.0256410 18.1688034 Error 26 8.8333333 0.3397436 Corrected Total 38 226.8589744 53.48 F Model 27 626.4761905 23.2028219 Error 56 18.6666667 0.3333333 Corrected Total 83 645.1428571 69.61 F Model 47 264.1286435 5.6197584 Error 60 14.4440556 0.2407343 Corrected Total 107 278.5726991 23.34 F Model 31 29430.61500 949.37468 Error 40 1187.55520 29.68888 Corrected Total 71 30618.17019 31.98 F Model 39 73167.34444 1876.08575 Error 50 2657.77778 53.15556 Corrected Total 89 75825.12222 35.29 F Model 39 5.79023204 0.14846749 Error 50 0.08019378 0.00160388 Corrected Total 89 5.87042582 92.57 F Model 47 2630791.889 55974.296 Error 60 6838.778 113.980 Corrected Total 107 2637630.667 491.09 F Model 47 8063183.102 171557.087 Error 60 53761.889 896.031 191.46 F Corrected Total 107 8116944.991 R-Square Coeff Var Root MSE AST Mean 0.993377 7.502028 29.93378 399.0093 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean N SC A 772.67 S5C1 A 772.67 S5C2 A 772.67 S5C3 A 762.50 S2C1 A 726.17 S2C2 B 664.00 S2C3 C 509.50 S3C1 D 403.50 S1C1 D 393.17 S3C2 E 302.33 S3C3 E 294.67 S1C2 F 208.33 S1C3 G 128.50 S4C3 G 128.50 S4C1 G 128.50 S4C2 H 71.50 S6C1 H 71.50 S6C2 H 71.50 S6C3 S1 EMC70 S2 EMC90 S3 AMC C1 15 mg/kg C2 25 mg/kg C3 50 mg/kg S4C1 S4C2 S4C3 Sylimarin 15 mg/kg S5C1 S5C2 S5C3 Tăng men gan S6C1 S6C2 S6C3 Đối chứng HPLC/MS: SẮC KÝ ĐỒ DỊCH CHIẾT EMC70 Phạm Hữu Tuấn Email: huutuanpro93@yahoo.com Đt: 0909234159