9/13/2020 1 NỘI DUNG • Cơ sở lý thuyết • Phân loại các phương pháp sắc kí • Quá trình sắc kí cơ bản và sắc kí đồ • Các thông số đặc trưng của pp sắc kí • Ứng dụng của pp sắc kí • Các phương pháp sắc k[.]
9/13/2020 NỘI DUNG • • • • • • • • CƠ SỞ LÝ THUYẾT Cơ sở lý thuyết Phân loại phương pháp sắc kí Q trình sắc kí sắc kí đồ Các thơng số đặc trưng pp sắc kí Ứng dụng pp sắc kí Các phương pháp sắc kí CỔ ĐIỂN PP sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) PP sắc kí khí (GC) Lịch sử đời Sắc kí phương pháp tách chất Dựa trình • Hỗn hợp chất tách khỏi qua cột! – Hấp phụ – Giải hấp phụ Xảy liên tục pha không trộn lẫn – Pha tĩnh (cột sắc kí): chất rắn lỏng – Pha động: chất lỏng (LC) chất kí (GC) Trong pttp sắc kí ứng dụng rộng rãi để định lượng hợp chất, đặc biệt hàm lượng nhỏ Năm 1906 - Mikhail SemenovichTswett (1872-1919) thí nghiệm tách chất cột sắc ký lần 9/13/2020 PHÂN LOẠI Cách 1: Dựa cấu tạo pha tĩnh – Sắc kí cột – Sắc kí phẳng Cách 2: Dựa tính chất pha động – Sắc kí lỏng (LC) – Sắc kí khí (GC) Cách 3: Dựa chất tương tác chất phân tích với pha tĩnh – – – – Sắc kí phân bố Sắc kí hấp phụ Sắc kí trao đổi ion Sắc khí gel Q TRÌNH TÁCH TRONG SẮC KÍ • Quá trình tách (separation) trình pp sắc kí (chromatography) • Nhờ vào việc tách riêng chất khỏi mẫu ban đầu mà việc định tính định lượng trở nên dễ dàng nhiều • Cơ chế: khác biệt lực chất phân tích (các chất khác có lực khác nhau!) với hai pha khơng trộn lẫn, mà chất tách chúng di chuyển tác dụng pha động (pha di chuyển) qua pha tĩnh (pha đứng yên) 9/13/2020 SẮC KÍ ĐỒ (Chromatogram) Cường độ tín hiệu • Là đồ thị biễu diễn mối quan hệ tín hiệu – nồng độ - thời gian – Định tính: dựa vào thời gian lưu tR – Định lượng: dựa vào diện tích hay chiều cao peak Thời gian lưu • Peak sắc kí: thời gian lưu cường độ tín hiệu (diện tích hay chiều cao) • Mỗi peak tương ứng với chất => phân tích đồng thời nhiều chất lần phân tích mẫu Thời gian lưu - tR Là thông số quan trọng đặc trưng cho chất phân tích điều kiện xác định Dùng để định tính (một phần!) • Là thời gian chất phân tích khỏi cột, có tính đến tương tác với pha tĩnh • Thời gian lưu chết tM: thời gian chất phân tích khỏi cột khơng có tương tác với cột • Thời gian lưu thực t’R = tR - tM CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG TRONG SẮC KÍ • • • • • • • • Thời gian lưu tR Hệ số phân bố K Hệ số chọn lọc α Hệ số dung lượng k’ Số đĩa lý thuyết N Chiều cao đĩa lý thuyết H Độ phân giải Rs Phương trình Van Deemter Thời gian lưu - tR Thời gian lưu chất định bởi: - Pha tĩnh (loại, cỡ hạt, độ xốp, loại xốp,…) - Pha động (loại khí, thành phần, tốc độ,…) - Bản chất cấu trúc chất PT - Nhiệt độ cột trình chạy SK 9/13/2020 Hệ số phân bố K Hệ số phân bố K • Là đại lượng đặc trưng cho cân động chất phân tích pha: tĩnh động K = CS/CM – CS CM: nồng độ chất pha tĩnh pha động – K lớn chất giữ lại lâu cột K phụ thuộc yếu tố: - Bản chất, cấu trúc phân tử chất PT, nhóm chức, nhóm thế, - Bản chất, loại cấu trúc SP - Bản chất, thành phần tốc độ MP - Nhiệt độ cột tách Hệ số chọn lọc - = Hệ số tách hai chất t r ,B t m tr,A tm t 'B k 'B t'A k 'A t’A t’B: thời gian lưu thực chất A B k‘A, k’B: hệ số chứa chất A B Với chất kề nhau: = 1: khơng có tách sắc ký chất 1: có tách sắc ký chất 15 9/13/2020 Hệ số dung lượng k’ (K’) • Đại lượng đăc trưng cho di chuyển chất phân tích cột k'=K’=KAVS/VM • Cách xác định: k'=(tR-tO)/tO Số đĩa lý thuyết N - Số đĩa lý thuyết (N): biểu thị số lớp chất di chuyển cột N = 16(tR/wb)2 = 5.545(tR/w0.5)2 tR : thời gian lưu tòan phần wb w0.5 độ rộng peak đo chân đường nửa chiều cao peak Số đĩa lý thuyết thực (hiệu dụng) N’: N’ = 16(t’R/wb)2 = 5.545(t’R/w0.5)2 - Chiều cao đĩa lý thuyết: bề dày lớp chất mẫu cột tách h = L/N Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng: H = L/N’ L : chiều dài cột tách (mm) H, h: mm Độ phân giải Rs • Là đại lượng cho phép đánh giá hai chất tách khỏi không WA, WB; độ rộng đáy peak sắc ký hai chất A B t'RA, t’RB: thời gian lưu hai chất A B • 9/13/2020 Độ phân giải Rs Hiện tượng kéo đuôi, đầu peak sắc kí • Muốn tăng độ phân giải Rs => tăng α, N, k’ (k) ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÍ Ưu điểm PP sắc ký Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất Độ phân giải cao nhờ trình tách cột Độ nhạy cao (ppm-ppb) Thể PT • Phổ biến mẫu thực phẩm như: dư lượng thuốc trừ sâu, kháng sinh, độc chất…ở hàm lượng vết đến siêu vết • Định tính: dựa vào thời gian lưu • Thử độ tinh khiết: khơng có peak ứng với tạp chất tích mẫu phân tích nhỏ (1-100µL) nhanh • Định lượng: dựa vào mối quan hệ diện tích (chiều cao) peak với hàm lượng chất phân tích Thường sử dụng kĩ thuật đường chuẩn 23 9/13/2020 SẮC KÍ CỘT CỔ ĐIỂN • Pha động: dung môi hữu Chảy qua cột tác dụng trọng lực/ (áp thấp) • Pha tĩnh: hạt nhồi vào cột • Q trình tách: chất phân tích đưa vào đầu cột, cho dung môi từ từ chảy qua cột tác dụng lực Do khác biệt chất với pha tĩnh pha động khác mà Dựa màu sắc (quan sát mắt) chất tách khỏi ghi nhận tín hiệu qua cột detector tiến hành thu nhận phân đoạn khác (các chất khác nhau) => sắc kí điều chế SẮC KÍ GIẤY • Tương tự sắc kí mỏng! • Pha tĩnh giấy cellulose (chất rắn) SẮC KÍ BẢN MỎNG Rf = a/b Rf: 0-1 Giá trị Rf khoảng 0.25 – 0.35 • Pha động: chất lỏng • Pha tĩnh: chất rắn or chất lỏng gắn mỏng • Q trình tách: chất phân tích chấm vào vạch cuối mỏng, làm bay dung mơi Đưa mỏng + chất phân tích vào bình chứa dung mơi Dung mơi + chất phân tích di chuyển lên lực mao dẫn • Tùy thuộc vào lực chất phân tích với pha tĩnh pha động mà quãng đường di chuyển khác khoảng thời gian xác định => sở định tính SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - HPLC High Performance Liquid Chromatography High Pressure Liquid Chromatography • Q trình tách thực cột, nhồi hạt có kích thước bé cỡ µm (5µm, 3µm) => cần áp lực cao để đẩy dung môi qua cột Hiệu tách cao • Pha động (dung mơi): chất lỏng, có vai trị đẩy chất phân tích khỏi cột • Pha tĩnh (cột): chất rắn chất lỏng, lưu giữ tách chất phân tích 9/13/2020 THIẾT BỊ HPLC Dung môi (pha động) Bơm cao áp Bộ tiêm mẫu THIẾT BỊ HPLC (tt) Cột sắc kí (pha tĩnh) Detector Hệ thống ghi đó, xử lý tín hiệu LC Instrumentation The Agilent 1100, a typical modern LC system Solvent reservoirs Solvent degasser Pump Autosampler Dung mơi (pha động): có vai trị đẩy chất phân tích khỏi cột Nước dung môi hữu Bơm cao áp: bơm dung môi qua cột Bộ tiêm mẫu: đưa mẫu chất phân tích vào cột Cột sắc kí (pha tĩnh): tách hỗn hợp thành cấu tử riêng lẻ *là trái tim hệ sắc kí* Detector: ghi nhận chất khỏi cột theo thời gian Tín hiệu ghi nhận (cường độ) tỉ lệ với hàm lượng chất phân tích => sở định lượng Bộ phân thu nhận xử lý tín hiệu: SẮC KÍ KHÍ - GC • Thường sử dụng phân tích hợp chất dễ bay bền nhiệt • Pha động (khí mang): khí trơ N2, Ar, He Đẩy chất phân tích khỏi cột • Pha tĩnh (cột): chất rắn, lỏng Lưu giữ tách chất phân tích Column oven DAD 9/13/2020 THIẾT BỊ GC THIẾT BỊ GC (tt) Khí mang (pha động): chất khí trơ N2, Ar, He…đẩy chất phân tích khỏi cột Pha động khơng có tương tác với chất phân tích Buồng tiêm mẫu: nơi mẫu đưa vào, hóa hơi, lơi theo dịng khí mang vào cột Lị cột: dùng điều khiển nhiệt độ cột tách Pha động (khí mang) Pha tĩnh (cột) Detector Buồng tiêm mẫu Bộ phân ghi nhận Lò cột xử lý tín hiệu Trong GC, q trình phân tách dựa khác lực chất với pha tĩnh, nhiệt độ bay chất phân tích chúng di chuyển liên tục dọc theo cột sắc kí Chương trình nhiệt: nâng cao hiệu tách Thường dùng chương trình gradient nhiệt cho mẫu phức tạp THIẾT BỊ GC (tt) Cột sắc kí (pha tĩnh): tách chất phân tích Có loại cột nhồi cột mao quản Detector: ghi nhận chất phân tích khỏi cột theo thời gian Cường độ tín hiệu (diện tích peak hay chiều cao) tỉ lệ với hàm lượng chất phân tích => sở định lượng Các loại detector phổ biến: ion hóa lửa FID; Cộng kết điện tử ECD; khối phổ MS Hệ thống ghi nhận xử lý tín hiệu: phần mềm máy vi tính 9/13/2020 Câu hỏi Vẽ mô tả cấu tạo thiết bị HPLC GC So sánh HPLC với GC Khi sử dụng dung môi đệm pH cần lưu ý gì? Vì nối cột bảo vệ vào cột phân tích? Vì cần trì dịng ổn định từ bơm? Tác hại chất rắn khí hịa tan pha động biện pháp loại trừ 10