Nghiên cứu tạo interleukin 6 người tái tổ hợp trên escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH TƠN THẢO VY NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH TƠN THẢO VY NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN ESCHERICHIA COLI NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN QUỐC THÁI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 iii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu nêu luận văn khách quan, trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Tôn Thảo Vy iv Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học khoá 2019 – 2021 NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN ESCHERICHIA COLI Tôn Thảo Vy Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Quốc Thái Đặt vấn đề IL-6 có chức sinh học đa dạng, tham gia vào trình điều hoà nhiều phản ứng miễn dịch thể người Nghiên cứu sản xuất thuốc điều trị bệnh lí thông qua tương tác IL-6 thụ thể cho thấy nhiều triển vọng Việc chiết xuất IL-6 trực tiếp từ mơ gặp nhiều khó khăn lượng protein chiết thấp Hiện nay, Việt Nam chưa thấy có nghiên cứu tạo nguồn IL-6 Bên cạnh nguồn IL-6 dùng cho thử nghiệm in vitro cho vấn đề bệnh lý liên quan đến IL-6 không đủ giá thành cao Đề tài thực với mong muốn bước đầu tạo lượng IL-6 với độ tinh khiết cao phục vụ cho nghiên cứu thử nghiệm thuốc cytokin Phương pháp nghiên cứu Chủng vi khuẩn sử dụng E coli BL21(DE3), vector pET-SUMO-IL-6 Plasmid pET-SUMO-IL-6 biến nạp vào tế bào E coli phương pháp sốc nhiệt Biểu IL-6 tái tổ hợp môi trường ZYP-5052 25 °C Tối ưu hóa điều kiện biểu protein dạng hịa tan Thu nhận tinh chế IL-6 pha tan thu phương pháp sắc kí lực cột Ni-Sepharose Thuỷ phân protease thu IL-6 nguyên thể Protein định tính phương pháp điện di SDS-PAGE, định lượng phương pháp Bradford ELISA Kết Chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) chứa vector plasmid pET-SUMO-IL-6 biểu IL-6 tái tổ hợp môi trường ZYP-5052 25 °C với suất biểu khoảng 40% ước lượng SDS-PAGE Tinh chế SUMO-IL-6 phương pháp sắc kí lực với cột Ni-Sepharose, nồng độ imidazol đệm rửa giải 200 mM Lượng IL-6 nguyên thể thu sau thuỷ phân tinh chế 3,924 mg từ 50 mL dịch nuôi cấy, hiệu suất đạt khoảng 18% Kết luận Nghiên cứu biểu thành công IL-6 tái tổ hợp môi trường ZYP-5052 25 °C tinh chế IL-6 phương pháp sắc kí lực với cột Ni-Sepharose với hiệu suất khoảng 18% Kết góp phần bổ sung thêm liệu tác nhân giúp cải tiến ổn định hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp IL-6 tăng cường biểu hoà tan E coli v Final esay for the degree of M.Sc in Pharm - Academic year: 2019-2021 RESEARCH EXPRESSION OF RECOMBINANT HUMAN INTERLEUKIN-6 IN ESCHERICHIA COLI Thao-Vy Ton Supervisor: Dr Nguyen Quoc Thai ABSTRACT Background: Human IL-6 is a cytokine involving a broad range of biological functions and regulating the human body's immune response The binding of IL-6 to its receptor also plays an essential role in many severe diseases Drug candidates blocking this interaction have been exploited as a promising strategy in treating these diseases Consequently, large quantities of active recombinant expression of IL6 are necessary because extraction from human tissues is complex and results in low protein yields Currently, since there had been no source of IL-6 in Vietnam, this study was carried out with the desire to initially create IL-6 with high purity for research and drug testing on this cytokine Method: An Escherichia coli BL21(DE3) strain has been constructed for efficient expression of recombinant IL-6 Plasmid pET-SUMO-IL-6 was transformed into E coli cells by heat shock method The expression of recombinant IL-6 was in ZYP-5052 medium at 25 °C and the optimization of protein expression conditions insoluble form Acquisition and purification of soluble IL-6 obtained via affinity chromatography on a Ni-Sepharose column Protease hydrolysis yielded native IL-6 Proteins were quantified by SDS-PAGE electrophoresis and quantified by Bradford and ELISA methods Results: E coli strain BL21(DE3) containing the plasmid vector pET-SUMO-IL-6 expressing recombinant IL-6 in ZYP-5052 medium at 25 °C with an expression yield of about 40% as estimated by SDS-PAGE Purify SUMO-IL-6 by affinity chromatography with a Ni-Sepharose column,the concentration of imidazole in the elution buffer is 200 mM The amount of primary IL-6 obtained after hydrolysis and purification was 3,924 mg from 50 mL of culture, and the yield was about 18% Conclusion: This study successfully expressed recombinant IL-6 in ZYP-5052 medium at 25 °C and purified IL-6 by Ni-Sepharose column affinity chromatography with a yield of about 18% The results contribute to additional data on agents that stabilize the production system of recombinant IL-6 protein and enhance soluble expression on E coli vi MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG .x LỜI CẢM ƠN xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Interleukin 1.2 Interleukin-6 1.3 Sản xuất protein tái tổ hợp vi khuẩn Escherichia coli 1.4 Vector biểu 12 1.5 Tinh chế protein 15 1.6 Kiểm định protein .18 1.7 Các nghiên cứu tạo Interleukin người tái tổ hợp Escherichia coli 23 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu .26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ 38 3.1 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen IL-6 38 3.2 Tạo dòng E coli mang plasmid pET-SUMO-IL-6 .42 3.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy 43 3.4 Tinh chế protein 52 3.5 Định lượng IL-6 hIL-6-ELISA-KIT 56 CHƯƠNG BÀN LUẬN 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Gp 130 : Glycoprotein 130 GST : Glutathione S-transferase hIL-6 : Interleukin người IL : Interleukin IL-6 : Interleukin IMAC : Immobilized metal ion affinity chromatography IPTG : Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside LB : Luria-Bertani Broth MBP : Maltose Binding Protein MCS : Multiple Cloning Site NusA : N-utilization substance protein A PBS : Phosphat buffered salin Polyacrylamid (Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SDS-PAGE : Phương pháp điện di gel natri dodecyl sulfat SOC : Super Optimal Broth SUMO : Small ubiquitin-like modifier TB : Terrific Broth viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc Interleukin-6 Hình 1.2 Các đường tín hiệu khác kích thích IL-6 Hình 1.3 IL6 bệnh lý liên quan Hình 1.4 Sơ đồ chung hệ thống vector 13 Hình 1.5 Nguyên tắc chung sắc ký rây phân tử 17 Hình 1.6 Quá trình chạy điện di SDS-PAGE 19 Hình 2.1 Plasmid pET-24a(+) 26 Hình 2.2 Thang chuẩn protein GangNam-STAINTM 26 Hình 3.1 Độ sai lệch sử dụng codon 38 Hình 3.2 Tần suất sử dụng codon 39 Hình 3.3 Hàm lượng GC 39 Hình 3.4 Sơ đồ tạo plasmid pET-SUMO-IL-6 42 Hình 3.5 Ni cấy vi khuẩn E coli chứa vector pET-SUMO-IL-6 42 Hình 3.6 Tạo dòng vi khuẩn E coli chứa vector pET-SUMO-IL-6 43 Hình 3.7 Khảo sát mơi trường ni cấy biểu IL-6 44 Hình 3.8 Đường cong sinh trưởng E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-IL-6 37 °C 45 Hình 3.9 Biểu protein E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-IL-6 37 °C 46 Hình 3.10 Đường chuẩn Bradford 47 Hình 3.11 Đường cong sinh trưởng E coliBL21(DE3)/pET-SUMO-IL-6 25 °C 47 Hình 3.12 Biểu protein E coli BL21(DE3)/pET-SUMO-IL-6 25 °C 48 Hình 3.13 So sánh đường cong sinh trưởng 25 °C 37 °C 49 Hình 3.14 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng biểu IL-6 50 Hình 3.15 Khảo sát thời gian thu sinh khối 51 Hình 3.16 Khảo sát điều kiện tinh chế IL-6 tái tổ hợp 52 Hình 3.17 Tinh chế His-SUMO-IL-6 53 Hình 3.18 Tinh chế His-SUMO-IL6 qua cột HiTrap Desalting 54 Hình 3.19 Khảo sát điều kiện thuỷ phân pET-SUMO-IL-6 55 Hình 3.20 Thuỷ phân tinh chế IL-6 56 ix Hình 3.21 Đường chuẩn ELISA 57 x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 IL-6 bệnh lý ung thư Bảng 2.1 Hóa chất dùng nghiên cứu 29 Bảng 2.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 29 Bảng 2.3 Xây dựng đường chuẩn Bradford 33 Bảng 2.4 Thành phần gel polyacrylamid 34 Bảng 3.1 Enzym giới hạn yếu tố CIS tối ưu hóa 40 Bảng 3.2 Sinh khối thu môi trường nuôi cấy 44 Bảng 3.3 Kết xây dựng đường chuẩn Bradford 46 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối lượng protein 50 Bảng 3.5 Kết xây dựng đường chuẩn ELISA 57 CHƯƠNG 58 BÀN LUẬN Thiết kế gen tăng tương thích gen IL-6 hệ thống biểu E coli Trong sản xuất protein tái tổ hợp, việc chuyển gen ngoại lai sinh vật vào vật chủ biểu khác cho kết biểu thấp khơng tương thích gen hệ thống biểu Trong trường hợp này, gen mục tiêu cần tối ưu hố để gia tăng mức độ biểu gen thơng qua việc tăng cường hiệu phiên mã dịch mã Tối ưu hoá gen thực cách cải thiện tiêu chí xu hướng sử dụng codon, thành phần GC hay trình tự lặp lại Khi tối ưu hố gen codon đồng nghĩa thay lẫn để làm thay đổi thành phần nucleotid từ thay đổi đặc tính gen mà giữ nguyên trình tự amino acid tạo [14] Sự biểu protein ngoại lai IL-6 E coli dẫn đến mức độ thấp khơng biểu việc sử dụng codon không phù hợp Do đó, đề tài tối ưu hố trình tự gen hIL-6 để tăng cường biểu E coli Sử dụng phần mềm OptimumGeneTM Optimization Analysis xem xét yếu tố ảnh hưởng tạo gen đơn lẻ đạt đến mức biểu cao Gen nguyên thể sử dụng song song codon làm giảm hiệu dịch mã tiến hành điều chỉnh độ sai lệch sử dụng codon E coli cách tăng CAI lên 0,97 Hàm lượng GC đỉnh không thuận lợi tối ưu hoá để kéo dài thời gian bán huỷ mARN Các cấu trúc Stem-Loop ảnh hưởng đến liên kết ribosom ổn định mARN bị phá vỡ Gen hIL-6 sau tối ưu hoá gắn đoạn His – SUMO giúp thuận lợi cho trình biểu tinh chế IMAC cột Ni-Sepharose Hệ thống vector pET-SUMO tăng khả biểu tan Sự hình thành thể vùi trở ngại lớn việc sản xuất protein tái tổ hợp E coli Mặc dù thể vùi mang nhiều ưu điểm biểu với suất độ tinh khiết cao, dễ phân lập khỏi protein khác tế bào, bảo vệ protein mục tiêu tránh khỏi phân hủy protease, không gây độc cho tế bào chủ thể vùi phải 59 tái gấp cuộn thành protein hịa tan có hoạt tính sinh học Quá trình phức tạp dẫn đến khả phục hồi kém, chiếm chi phí lớn sản xuất [46] Do đó, người ta thường mong muốn tối đa hố biểu protein dạng hồ tan hoạt động tránh trình tái cấu trúc phức tạp IL-6 xem protein khó biểu Khi sản xuất IL-6 E coli, protein tái tổ hợp thu có xu hướng khơng tan [26], [38] vấn đề khắc phục IL-6 gắn thêm đoạn dung hợp giúp hỗ trợ tan Kim cộng (2005) nhận thấy IL-6 kết hợp với Nus A (Nus A/ hIL-6) hay MBP (MBP/ hIL-6) IL-6 biểu dạng hoà tan Trx/hIL-6 Ubi/hIL-6 biểu chủ yếu dạng không tan [26] Tác động GST đến khả hồ tan IL-6 khơng cải thiện nghiên cứu Nausch [38] Cho đến nay, đoạn dung hợp Nus A MBP chứng minh hiệu biểu tan IL-6 Đề tài sử dụng hệ thống vector biểu pET-SUMO với mong muốn tìm đoạn dung hợp có khả tăng biểu protein tan Khi kết hợp với SUMO, mức độ biểu protein tái tổ hợp biểu dạng tan cao đạt đến 30% tổng số protein hoà tan E coli [54], [57] Thật vậy, kết cho thấy SUMO-IL-6 sản xuất dạng tan, mang lại khoảng 29% tổng lượng protein hoà tan E coli Do đó, kết hợp với SUMO, IL-6 khơng nâng cao mức độ biểu mà tạo dạng hồ tan (Hình 3.6) Điều kiện ni cấy tinh chế cột Ni-Sepharose Khả hoà tan SUMO-IL-6 tăng cường lựa chọn môi trường nuôi cấy tối ưu nuôi cấy nhiệt độ giảm Mơi trường LB (Luria-Bertani Broth) có hàm lượng dinh dưỡng phong phú, tính thẩm thấu phù hợp cho pha tăng trưởng tế bào Đây môi trường sử dụng phổ biến để nuôi cấy E coli nhiên LB lựa chọn tốt để đạt nuôi cấy mật độ tế bào cao Môi trường TB (Terrific Broth) chứng minh tạo mật độ tế bào cao LB Việc tăng lượng pepton cao nấm men dẫn đến mật độ tế bào cao hơn, bổ sung lượng nhỏ cation hoá trị hai MgSO4 giúp tăng trưởng tế bào Q trình chuyển hố glucose tạo acid giúp hệ đệm ổn định, kiểm soát pH, bổ sung 60 hệ đệm phosphat ổn định môi trường nuôi cấy [41] Khi nuôi cấy môi trường LB TB, OD600 đạt 0,4-0,6 cần phải bổ sung chất cảm ứng IPTG Môi trường tự cảm ứng ZYP-5052 coi môi trường tối ưu để nuôi cấy tế bào Khi sử dụng môi trường tránh việc theo dõi sinh khối để bổ sung chất cảm ứng kịp thời môi trường LB hay TB, thao tác nuôi cấy dễ quan sát Môi trường tự cảm ứng ZYP-5052 sử dụng glucose, lactose glycerol để tối ưu hoá điều kiện cảm ứng Glucose nguồn carbon tối ưu cho pha tăng trưởng tế bào, nguồn glucose cạn kiệt, tế bào sử dụng nguồn carbon từ lactose-chất cảm ứng operon lac [41] Đề tài lựa chọn môi trường ZYP-5052 môi trường tối ưu để cảm ứng biểu protein IL-6 tái tổ hợp khác biệt so với nghiên cứu trước sử dụng môi trường LB hay TB điều đem lại nhiều ưu thuận lợi Ngồi ra, IPTG có giá thành cao, tăng quy mô sản xuất sản xuất công nghiệp môi trường ZYP-5052 mang lại hiệu kinh tế cao Nhiệt độ yếu tố quan trọng, liên quan tốc độ phản ứng nuôi cấy tốc độ phát triển tế bào Các loài vi sinh vật thường sinh trưởng phát triển nhiệt độ 25-37 °C So sánh nhiệt độ nuôi cấy 37 °C 25 °C (Hình 3.14), kết lượng sinh khối lẫn protein pha tan nhiệt độ thấp thu cao Điều phù hợp với sở lý thuyết nghiên cứu trước Phản ứng kết tập nói chung protein thường xảy nhiệt độ cao Khi giảm nhiệt độ nuôi cấy giúp loại bỏ phần protease sốc nhiệt tạo điều kiện biểu mức, giảm hoạt động biểu chaperone, giảm kết tụ tương tác kỵ nước, tốc độ sản xuất protein chậm giúp protein tái tổ hợp hình thành tăng độ ổn định có thời gian để gấp lại cách [41], [49] His-tag hỗ trợ cho trình tinh chế cột Ni-Sepharose thuận lợi pET-SUMO-IL-6 gắn thẻ histidin có lực chọn lọc cao với Ni2+ số ion kim loại khác cố định mơi trường sắc kí sử dụng phối tử chelat Do đó, IL-6 chứa thẻ histidin liên kết chọn lọc với cột sắc kí Ni Sepharose High Performance protein khác không liên kết liên kết yếu Khi cho hỗn hợp protein chứa IL-6 tái tổ hợp qua cột sắc kí Ni Sepharose High 61 Performance, IL-6 chứa thẻ histidin giữ lại cột, protein khác không bám cột khỏi cột Dung dịch đệm cân cột mẫu IL-6 bổ sung imidazol với nồng độ 10 mM Imidazol cạnh tranh với protein để liên kết với ion kim loại cố định cột sắc kí Sau cùng, sử dụng imidazol nồng độ 500 mM rửa giải để đảm bảo rửa giải hoàn toàn protein [16] Ngược lại, giai đoạn tinh chế lần 2, His-SUMO-IL-6 sau bị thủy phân protease tạo IL-6 dạng nguyên thể đuôi dung hợp His-SUMO Đoạn dung hợp His-SUMO chứa thẻ histidin liên kết chọn lọc với cột sắc kí Ni Sepharose IL-6 khơng liên kết liên kết yếu Vì cho hỗn hợp protein chứa His-SUMO IL-6 qua cột sắc kí Ni Sepharose, dung hợp His-SUMO chứa thẻ histidin giữ lại cột, IL-6 không bám cột khỏi cột Định lượng IL-6 phương pháp Bradford ELISA IL-6 sau phân cắt tinh chế thu phân đoạn 50 mM imidazol Khi định lượng phương pháp Bradford ELISA có chênh lệch lượng IL6 đo Sự sai lệch phương pháp giải thích phương pháp Bradford định lượng lượng protein tổng hồ tan, số protein tạp cịn sót lại sau trình tinh chế IL-6 bị biến tính q trình bảo quản Phương pháp ELISA định lượng đặc hiệu IL-6 tan có khả liên kết với kháng thể đĩa phản ứng Kết thử nghiệm ELISA mẫu SUMO-IL-6 IL-6 cho kết định lượng thấp Để giải thích điều đưa dự đốn IL-6 gắn kết với đoạn dung hợp đoạn dung hợp che lấp điểm nhận diện gây cản trở gắn kết, điều gặp phải nghiên cứu trước [38] SUMO với đặc tính chaperon đóng vai trị ổn định, gấp nếp cách hồ tan protein tái tổ hợp SUMO có bề mặt bên ưa nước lõi kỵ nước bên SUMO đóng vai trị chất biến tính protein khơng hồ tan [32] Khi loại bỏ SUMO, IL-6 bị ảnh hưởng, nếp gấp cầu nối disulfid khơng ổn định Ngồi ra, KITELISA hãng Thermo nhận diện IL-6 tổng độ dài 212 acid amin IL6 thiết kế gồm phần chứa hoạt tính 184 acid amin có độ dài ngắn dẫn đến kết định lượng thấp 62 Tóm lại, đề tài mơ tả chi tiết quy trình sản xuất protein tái tổ hợp hIL6 E coli, tối ưu hoá điều kiện cho biểu hoà tan hIL-6 cách kết hợp với SUMO, lựa chọn môi trường nuôi cấy tối ưu kết hợp giảm nhiệt độ nuôi cấy Năng suất cuối thu 78,48 mg IL-6/ L dịch nuôi cấy tế bào cao nghiên cứu Spiridonova với mg IL-6/ L [50] hay Li với 18 mg IL-6/ L [31] Nausch 2,6 mg IL-6/ L dịch nuôi cấy tế bào [38] Nghiên cứu Lee suất thu cao 270 mg IL-6 /L [29] trình loại bỏ MBP gặp khó khăn tính đặc hiệu vị trí phân cắt, phải chèn thên liên kết oligopeptid SUMO với ưu điểm đề cập trước giúp lựa chọn enzym phân cắt dễ dàng sử dụng SUMO Protease để phân cắt đặc hiệu SUMO protein tạo protein đầu N mong muốn, giúp quy trình phân cắt đơn giản hiệu Kết nghiên cứu đề tài góp phần bổ sung thêm liệu tác nhân giúp cải tiến ổn định hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp IL-6 tăng cường biểu hoà tan E coli 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài đạt mục tiêu đề việc sản xuất thành công Interleukin-6 người tái tổ hợp E coli, cụ thể: - Thiết kế vector pET-SUMO-IL-6 mang gen mã hoá IL-6 tối ưu hoá biểu E coli - Đã tạo dòng chủng E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET-SUMO-IL-6 - Cảm ứng biểu thành công IL-6 dạng tan từ chủng biến nạp xác nhận protein đích SDS-PAGE - Xây dựng quy trình biểu protein tái tổ hợp IL-6 khảo sát điều kiện ni cấy để thu protein hịa tan với suất cao qui mơ phịng thí nghiệm - Đã tinh chế IL-6 tái tổ hợp thành cơng sắc kí lực cột NiSepharose - Đã loại bỏ đoạn dung hợp SUMO, thu IL-6 dạng nguyên thể Kiến nghị Đề tài nghiên cứu dừng lại mức sản xuất biểu IL-6 tan E coli Sau kết thúc, SUMO-IL-6 sử dụng để thử nghiệm gắn kết cấu trúc phân tử nhỏ thí nghiệm in vitro nhằm nghiên cứu phát triển thuốc tác động IL-6 thụ thể Trên sở đó, chúng tơi đề nghị tiếp tục khảo sát nội dung sau: - Tối ưu hoá điều kiện tinh chế IL-6 tái tổ hợp qui mô lớn - Khảo sát thêm điều kiện phân cắt nhằm nâng cao hiệu suất cắt, thu IL-6 xác - Khảo sát đệm bảo quản giúp ổn định IL-6 - Thử nghiệm hoạt tính sinh học IL-6 thu TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmed N, Abbas R, Khan M A, Bashir H, et al, (2018), "Enhancing recombinant interleukin-6 production yield by fermentation optimization, two-step denaturing, and one-step purification", Biotechnol Appl Biochem, 65 (3), pp 490-496 Akhtar H, Akhtar S, Jan S U, et al (2013), "Over expression of a synthetic gene encoding interferon lambda using relative synonymous Codon usage bias in Escherichia coli", Pak J Pharm Sci 26 (6), pp 1181-1188 Ataie-Kachoie P, Pourgholami MH, Richardson DR, et al (2014), “Gene of the month: Interleukin (IL-6)”, Journal of clinical pathology, 67(11), pp 932937 Aydin S (2015), A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA, Peptides, 72, pp 415 Bahiri-Elitzur S, Tuller T, (2021), “Codon-based indices for modeling gene expression and transcript evolution” Computational and Structural Biotechnology Journal, 19, pp 2646-2663 Bhatwa A, Wang W, Hassan YI, et al (2021), "Challenges Associated With the Formation of Recombinant Protein Inclusion Bodies in Escherichia coli and Strategies to Address Them for Industrial Applications", Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 9, pp 65 Bird L E (2011), “High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli”, Methods, 55 (1), pp 2937 Chen G, Wu DI, Guo W, et al (2020), "Clinical and immunological features of severe and moderate coronavirus disease 2019", J Clin Invest, 130(5), pp 2620-2629 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Chomarat P, Banchereau J, Davoust J, et al (2000), "IL-6 switches the differentiation of monocytes from dendritic cells to macrophages", Nat Immunol, 1(6), pp 510-514 10 Costa S J, Almeida A, Castro A, et al (2012), “The novel Fh8 and H fusion partners for soluble protein expression in Escherichia coli: a comparison with the traditional gene fusion technology”, Applied Microbiology and Biotechnology, 97(15), pp 6779-6791 11 Dembic Z (2015), The Role of Cytokines in Disease Related to Immune Response, The Cytokine of the Immune System, Mica Haley, ed, Elsevier, pp 1-16 12 Dinarello C A (1994), "The interleukin‐1 family: 10 years of discovery 1", The FASEB Journal, (15), pp 1314-1325 13 Donnelly R P, Young H A, Rosenberga A S (2009), "An Overview of Cytokines and CytokineAntagonists as Therapeutic Agents", Annals of the New York Academy of Science 1182 (1), pp 1-13 14 Ermolaev M D (2001), “Synonymous codon usage in bacteria”, Current issues in molecular biology, (4), pp 91-97 15 Gabay C, Kushner I (1999), "Acute-phase proteins and other systemic responses to inflammation", New England journal of medicine, 340(6), pp 448-454 16 GE Healthcare, “Affinity Chromatography Vol.2 Tagged Proteins”, GE Heathcare, pp 32-33 17 Hage D S., Chapter - Chromatography, in Principles and Applications of Clinical Mass Spectrometry, Nader Rifai, Andrea Rita Horvath, Carl T Wittwer, Editors 2018, Elsevier, pp 1-32 18 Hall M, Chapter 21 - Size Exclusion Chromatography (SEC), in Biopharmaceutical Processing, Günter Jagschies, Eva Lindskog, Karol Łącki, Parrish Galliher, Editors 2018, Elsevier p 421-432 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 19 Heinrich P C, Behrmann I, Müller-Newen G, et al (1998), "Interleukin-6-type cytokine signalling through the gp130/Jak/STAT pathway", Biochem J, 334 (2), pp 297-314 20 Hong D S, Angelo L S, Kurzrock R (2007) Interleukin‐6 and its receptor in cancer: implications for translational therapeutics Cancer, 110 (9), pp.19111928 21 Itzhaki R F., Gill D M (1964), “A micro-biuret method for estimating proteins”, Analytical Biochemistry, 9(4), 401-410 22 Ji HL, Zhao R, Matalon S, et al (2020), "Elevated Plasmin(ogen) as a Common Risk Factor for COVID-19 Susceptibility", Physiol Rev, 100(3), pp 10651075 23 Jia B, Jeon C O, (2016), "High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives", Open biology, (8), pp 160-196 24 Kaur J, Kumar A, Kaur J (2018), "Strategies for optimization of heterologous protein expression in E coli: Roadblocks and reinforcements", International Journal of Biological Macromolecules 106, pp 803-822 25 Kaur S, Bansal Y, Kumar R, et al (2020), “A panoramic review of IL-6: Structure, pathophysiological roles and inhibitors”, Bioorganic & medicinal chemistry, 28 (5), pp 115327 26 Kim T W, Chung B H, Chang Y K, (2005), "Production of soluble human interleukin-6 in cytoplasm by fed-batch culture of recombinant E coli", Biotechnol Prog, 21 (2), pp 524-531 27 Krohn R I (2011), “The colorimetric detection and quantitation of total protein”, Curr Protoc Cell Biol, 3, 28 Kuczynska-Wisnik D, Kedzierska S, Matuszewska E, et al (2002), “The Escherichia coli small heat-shock proteins IbpA and IbpB prevent the aggregation of endogenous proteins denatured in vivo during extreme heat shock”, Microbiology, 148, pp 1757-1765 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 29 Lee E G, Baek J-E, Lee S-H, et al, (2009), "Efficient proteolytic cleavage by insertion of oligopeptide linkers and its application to production of recombinant human interleukin-6 in Escherichia coli", Enzyme and Microbial Technology, 44 (5), pp 254-262 30 Lee S, Weon S, Lee S, Kang C (2010), “Relative codon adaptation index, a sensitive measure of codon usage bias”, Evolutionary Bioinformatics, (4608) 31 Li Y, Chen C X, von Specht B U, (2002), "Cloning and hemolysin-mediated secretory expression of a codon-optimized synthetic human interleukin-6 gene in Escherichia coli", Protein Expr Purif, 25 (3), pp 437-447 32 Malakhov M P, Mattern M R, Malakhova O A, et al (2004), “SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins”, Journal of structural and functional genomics, (1), pp.75-86 33 Mauer J, Denson J L, Brüning J C (2015), “Versatile functions for IL-6 in metabolism and cancer” Trends in immunology, 36 (2), pp 92-101 34 May L T, Santhanam U, Sehgal P B (1991), “On the multimeric nature of natural human interleukin-6”, Journal of Biological Chemistry, 266 (15), pp 99509955 35 Medical & Biological Laboratories Co LTD The principle and method of polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 36 Mogk A, Mayer M P, Deuerling E (2002), “Mechanisms of protein folding: molecular chaperones and their application in biotechnology”, Chembiochem, 3, pp 807-814 37 Naugler W E, Karin M (2008), "The wolf in sheep's clothing: the role of interleukin-6 in immunity, inflammation and cancer", Trends Mol Med, 14 (3), 109-119 38 Nausch H, Huckauf J, Koslowski R, et al (2013), "Recombinant production of human interleukin in Escherichia coli", Plos one, (1), pp 54933 39 Novagen (2013), “pET system manual”, novagen Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 40 Redmile-Gordon M, Armenise E, White R P, Hirsch P, et al (2013), "A comparison of two colorimetric assays, based upon Lowry and Bradford techniques, to estimate total protein in soil extracts", Soil Biology and Biochemistry, 67, pp 166-173 41 Rosano G L, Morales E S, Ceccarelli E A (2019), "New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: a 5‐year update", Protein Science, 28 (8), pp 1412-1422 42 Sambrook J, Russell D W (2006), “Preparation and Transformation of Competent E coli Using Calcium Chloride”, Cold Spring Harbor Protocols, 2006 (1), pp.3932 43 Schlieker C, Bukau B, Mogk A (2002), “Prevention and reversion of protein aggregation by molecular chaperones in the E coli cytosol: implications for their applicability in biotechnology”, Journal of biotechnology, 96, pp 1321 44 Scopes R, (2001), Strategies for protein purification, Current protocols in protein science, pp Unit 1.2 45 Simpson R J, Hammacher A, Smith D K, et al (1997), "Interleukin-6: structurefunction relationships", Protein Scien, (5), pp 929-955 46 Singh S M, Panda A K (2005), "Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins", Journal of bioscience and bioengineering, 99 (4), pp 303310 47 Smith B J (1984), “SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins”, Proteins, 1, 41-56 48 Somers W, Stahl M, Seehra J S (1997), "1.9 A crystal structure of interleukin 6: implications for a novel mode of receptor dimerization and signaling", The EMBO journal, 16 (5), pp 989-997 49 Sørensen H P, Mortensen K K (2005), “Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli”, Microb Cell Fact, (1), pp 1-8 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 50 Spiridonova V, Lygina A, Anohina M, Tupitsyn N (2007), "Preparation of functionally active recombinant human interleukin-6", Biochemistry, 72 (4), pp 424-429 51 Srirangan S, Choy E H (2010), "The role of interleukin in the pathophysiology of rheumatoid arthritis", Therapeutic advances in musculoskeletal disease, (5), pp 247-256 52 Tanaka T, Narazaki M, Kishimoto T (2016), "Immunotherapeutic implications of IL-6 blockade for cytokine storm", Immunotherapy, 8(8), pp 959-970 53 Uciechowski P, Dempke W C (2020), “Interleukin-6: a masterplayer in the cytokine network” Oncology, 98 (3), pp 131-137 54 Wang H, Xiao, Y, Fu L, Zhao H, et al (2010), “High-level expression and purification of soluble recombinant FGF21 protein by SUMO fusion in Escherichia coli.” BMC biotechnology, 10 (1), pp 1-9 55 Zarschler K, Witecy S, Kapplusch F, et al (2013), "High-yield production of functional soluble single-domain antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli", Microbial cell factories, 12 (1), pp 97 56 Zhang J M, An J (2007), “Cytokines, inflammation, and pain”, InteARNtional anesthesiology clinic, 45 (s2), pp 27-37 57 Zhu F, Wang Q, Pu H, et al (2013), “Optimization of soluble human interferon-γ production in Escherichia coli using SUMO fusion partner” World Journal of Microbiology and Biotechnology, 29 (2), pp 319-325 58 Zumla A, Hui DS, Azhar EI, et al (2020), "Reducing mortality from 2019-nCoV: host-directed therapies should be an option", Lancet, 395 (10224), pp 3536 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự nucleotid gen mã hóa cho IL-6 người (Gene ID: 3569, UniProtKB/Swiss-Prot: P05231) ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGG GCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCCTTCCCTGCCCCAGTACCCCCAGGAG AAGATTCCAAAGATGTAGCCGCCCCACACAGACAGCCACTCACCTCTTC AGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGCATCTCAGCC CTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAA GAGGCACTGGCAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAA GATGGATGCTTCCAATCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTGAAAA TCATCACTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAAC AGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTCCAGATGAGTACA AAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAAT AACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAG GCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGCGCG CTTTAAGGAGTTCCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTAG Phụ lục Trình tự acid amin SUMO MSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAF AKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Kết xây dựng đường chuẩn ELISA Nồng độ protein Độ hấp thu OD450 Độ hấp thu OD450 chuẩn (pcg/mL) Mẫu Mẫu Giá trị trung bình 400 2,546 2,224 2,385 160 1,091 1,166 1,128 64 0,613 0,589 0,601 25,6 0,400 0,380 0,390 10,24 0,281 0,251 0,266 0,222 0,208 0,215 Phụ lục Thử nghiệm hoạt tính gắn kết kháng thể IL-6 SUMO-IL-6 Độ hấp thu OD450 Độ hấp thu OD450 Mẫu Mẫu Giá trị trung bình SUMO-IL-6 0,315 0,275 0,295 IL-6 0,384 0,333 0,359 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Quy trình tạo Interleukin – Biến nạp vector pET-SUMO-IL-6 vào E coli BL21(DE3) phương pháp sốc nhiệt Chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp chứa gen IL-6 cấy hoạt hóa mL mơi trường LB Broth có bổ sung kanamycin 50 µg/mL, 1% glucose, lắc qua đêm 37 °C (14-16 giờ) Cấy chuyển 700 µL dịch vi khuẩn qua erlen 250 mL chứa 50 mL môi trường ZYP-5052, lắc 25 °C, 200 vòng/phút, 36 Ly tâm thu sinh khối, phân tán sinh khối dung dịch đệm A, tán siêu âm phá tế bào 30 phút, °C thu protein tan Tinh chế qua cột Ni-Sepharose thu SUMO-IL-6 phân đoạn rửa giải chứa 200 mM imidazol Tinh chế SUMO-IL-6 loại Imidazol qua cột HiTrap Desalting Thuỷ phân SUMO-IL-6 Protease nồng độ 1/100 (mol/mol) °C Tinh chế qua cột Ni-Sepharose thu IL-6 phân đoạn rửa giải chứa 50 mM imidazol