Luận án tiến sĩ hóa học nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài zanthoxylum nitidum thuộc họ rutaceae ở việt nam

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân TS Phạm Minh Quân Các kết nghiên cứu luận án trung thực, không trùng lặp chưa công bố cơng trình khoa học khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Trần Thị Tuyến năm 2022 LỜI CẢM ƠN Với lòng chân thành biết ơn sâu sắc, xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân, TS Phạm Minh Quân người thầy vô tận tâm nhiệt huyết định hướng giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu làm luận án Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm, giúp đỡ Ban Lãnh đạo tập thể cán bộ, đồng nghiệp Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, đặc biệt GS.TS Phạm Quốc Long truyền đạt kiến thức tảng suốt thời gian học tập Tôi xin trân trọng cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam suốt thời gian thực luận án Tôi xin chân thành cảm ơn anh, chị, em cơng tác phịng Phân tích Hóa học phịng Hóa sinh Nơng nghiệp Tinh dầu - Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, ln chân thành, nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình tơi học tập nghiên cứu Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới tồn thể người thân gia đình, bạn bè động viên để tơi hồn thiện luận án Luận án thực với tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số đề tài 104.01-2015.44 PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân làm chủ nhiệm Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả luận án Trần Thị Tuyến iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC iv DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG x MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Chi Zanthoxylum 1.1.1 Đặc điểm thực vật chung chi Zanthoxylum 1.1.2 Phân bố loài Zanthoxylum Việt Nam 1.1.3 Cơng dụng lồi thuộc chi Zanthoxylum y học dân tộc 1.1.4 Tình hình nghiên cứu chi Zanthoxylum giới 1.1.5 Tình hình nghiên cứu chi Zanthoxylum Việt Nam 1.2 Loài Zanthoxylum nitidum 12 1.2.1 Đặc điểm thực vật 12 1.2.2 Phân bố 13 1.2.3 Công dụng 13 1.2.4 Tình hình nghiên cứu lồi Zanthoxylum nitidum giới 14 1.2.5 Tình hình nghiên cứu loài Zanthoxylum nitidum Việt Nam 38 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Đối tượng nghiên cứu 39 2.2 Phương pháp nghiên cứu 39 2.2.1 Phương pháp chiết mẫu 39 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 39 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 40 2.2.4 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học 42 2.2.5 Phương pháp mô tương tác phân tử 44 2.2.6 Phương pháp định lượng hoạt chất nitidine loài Z nitidum 45 2.2.7 Phương pháp chiết tách, phân tích thành phần hàm lượng tinh dầu 46 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 48 3.1 Xử lý đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt tính sinh học 48 v 3.1.1 Xử lý mẫu, tạo cao chiết methanol tổng 48 3.1.2 Sàng lọc hoạt tính cao chiết methanol tổng 48 3.2 Lựa chọn phân đoạn có hoạt tính cao để chiết tách, phân lập chất 48 3.2.1 Điều chế cặn chiết phân đoạn 48 3.2.2 Sàng lọc hoạt tính phần cặn chiết phân đoạn: 50 3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học lồi Zanthoxylum nitidum 50 3.3.1 Chiết tách, phân lập hợp chất từ cặn chiết 50 3.3.2 Hằng số vật lý kiện phổ chất phân lập 57 3.4 Thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 61 3.5 Nghiên cứu tương quan cấu trúc - hoạt tính kháng u số hợp chất phân lập 61 3.6 Định lượng hoạt chất nitidine loài Zanthoxylum nitidum 61 3.7 Nghiên cứu thành phần, hàm lượng hoạt tính sinh học tinh dầu lồi Zanthoxylum nitidum 61 3.7.1 Nghiên cứu thành phần hàm lượng tinh dầu 61 3.7.2 Thử hoạt tính sinh học tinh dầu 61 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62 4.1 Kết sàng lọc hoạt tính cao chiết methanol tổng cặn chiết phân đoạn 62 4.1.1 Kết sàng lọc hoạt tính cao chiết methanol tổng 62 4.1.2 Kết sàng lọc hoạt tính cặn chiết phân đoạn 62 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 64 4.2.1 Hợp chất ZN1 (nitidine) 64 4.2.2 Hợp chất ZN2 (7-methoxy-8-demethoxynitidine - Chất mới) 65 4.2.3 Hợp chất ZN3 (zanthoxyline) 66 4.2.4 Hợp chất ZN4 (dihydrochelerythrine) 68 4.2.5 Hợp chất ZN5 (zanthocadinanine C - Chất mới) 70 4.2.6 Hợp chất ZN6 (6-acetonyldihydrochelerythrine) 72 4.2.7 Hợp chất ZN7 (bocconoline) 74 4.2.8 Hợp chất ZN8 (6-carboxymethyldihydrochelerythrine) 76 4.2.9 Hợp chất ZN9 (6-acetonyl-N-methyldihydrodeccarine) 77 vi 4.2.10 Hợp chất ZN10 (zanthonitiside A - Chất mới) 79 4.2.11 Hợp chất ZN11 (zanthonitiside B - Chất mới) 82 4.2.12 Hợp chất ZN12 (zanthonitiside C - Chất mới) 82 4.2.13 Hợp chất ZN13 (zanthonitiside D - Chất mới) 84 4.2.14 Hợp chất ZN14 (zanthonitiside I - Chất mới) 85 4.2.15 Hợp chất ZN15 (sesamin) 87 4.2.16 Hợp chất ZN16 (syringaresinol O-β-D-glucopyranoside) 88 4.2.17 Hợp chất ZN17 (syringaresinol) 90 4.2.18 Hợp chất ZN18 ((+)-lyoniresino-9′-O-β-D-glucopyranoside) 91 4.2.19 Hợp chất ZN19 ((-)-lyoniresinol-9′-O-β-D-glucopyranoside) 93 4.2.20 Hợp chất ZN20 ((-)-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside) 93 4.2.21 Hợp chất ZN21 (2,6-dimethoxybenzoquinone) 95 4.2.22 Hợp chất ZN22 (3β-hydroxycholest-5-en-7-one) 96 4.2.23 Hợp chất ZN23 (β-amyrin) 97 4.3 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 102 4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào 102 4.3.2 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn 103 4.4 Kết mô tương tác phân tử nghiên cứu mối tương quan cấu trúc-hoạt tính kháng u số hợp chất 104 4.4.1 Kết docking phân tử 104 4.4.2 Phân tích số ADMET 106 4.5 Kết định lượng hoạt chất nitidine phận loài Z nitidum 107 4.6 Kết thành phần, hàm lượng hoạt tính sinh học tinh dầu loài Zanthoxylum nitidum 108 4.6.1 Kết phân tích thành phần hàm lượng chất tinh dầu loài Z nitidum 108 4.6.2 Kết hoạt tính sinh học 111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113 KẾT LUẬN 113 KIẾN NGHỊ 114 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 115 * Các báo quốc tế: 115 vii * Các báo quốc gia: 115 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 PHỤ LỤC PL1 Phụ lục 1: Các phổ nitidine (ZN1) PL1 Phụ lục 2: Các phổ 7-methoxy-8-demethoxynitidne- Chất (ZN2) PL4 Phụ lục 3: Các phổ zanthoxyline (ZN3) PL7 Phụ lục 4: Các phổ dihydrochelerythrine (ZN4) PL10 Phụ lục 5: Các phổ zanthocadinanine C - Chất mới(ZN5) PL13 Phụ lục 6: Các phổ 6-acetonyldihydrochelerythrine (ZN6) PL17 Phụ lục 7: Các phổ bocconoline (ZN7) PL21 Phụ lục 8: Các phổ 6-carboxymethyldihydrochelerythrine (ZN8) PL24 Phụ lục 9: Các phổ 6-acetonyl-N-methyl dihydrodecarine (ZN9) PL27 Phụ lục 10: Các phổ zanthonitiside A - Chất (ZN10) PL30 Phụ lục 11: Các phổ hợp chất zanthonitiside B - Chất (ZN11) PL33 Phụ lục 12: Các phổ hợp chất zanthonitiside C - Chất (ZN12) PL35 Phụ lục 13: Các phổ zanthonitiside D - Chất (ZN13) PL38 Phụ lục 14: Các phổ zanthonitiside E - Chất (ZN14) PL41 Phụ lục 15: Các phổ sesamin (ZN15) PL45 Phụ lục 16: Các phổ (syringaresinol O-β-D-glucopyranoside) (ZN16) PL47 Phụ lục 17: Các phổ (syringaresinol (ZN17) PL49 Phụ lục 18: Các phổ ((+)-lyoniresino-9′-O-β-D-glucopyranoside)(ZN18) PL51 Phụ lục 19: Các phổ ((-)-lyoniresino-9′-O-β-D-glucopyranoside)(ZN19) PL53 Phụ lục 20: Các phổ ((-)-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside) (ZN20) PL55 Phụ lục 21: Các phổ 2,6-dimethoxybenzoquinone (ZN21) PL57 Phụ lục 22: Các phổ 3β-hydroxycholest-5 ene-7-one (ZN21) PL59 Phụ lục 23: Các phổ β-amyrin (ZN23) PL61 Phụ lục 24: Tinh dầu loài Z nitidum PL63 viii DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu NMR Tiếng Anh Nuclear Magnetic Resonance Proton Magnetic Resonance H-NMR spectroscopy Carbon 13 Nuclear Magnetic 13 C-NMR Resonance spectroscopy Distortionless Enhancement DEPT by Polarisation Heteronuclear Multiple Bond HMBC Correlation Heteronuclear Single HSQC Quantum Coherence COSY Corrrlated Spectroscopy Nuclear Overhauser Effect NOESY Spectroscopy Rotating-frame Overhauser ROESY Enhancement Spectroscopy HR-ESIHigh Resolution Electron MS Spray Ionization Mass Spectra Circular dichroism CD spectroscopy Gas Chromatography - Mass GC-MS Spectrometry High Performance Liquid HPLC Chromatography UVUltraviolent Visible Diode Vis/DAD Array Detector STT TLTK TMS Tetramethylsilane DMSO Dimethyl sulfoxide MeOH Methanol EtOAc Ethylacetate ACN Methyl cyanide Effective Concentration at EC50 50% Inhibitory Concentration at IC50 50% LD50 Lethal Dose at 50% Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Phổ DEPT Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp H→C Phổ COSY Phổ NOESY Phổ ROESY Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử phân giải cao Phổ lưỡng sắc trịn Sắc kí khí - khối phổ Sắc kí lỏng hiệu cao Số thứ tự Tài liệu tham khảo Metanol Etyl axetat acetonitrile Nồng độ gây tác động sinh học cho 50% đối tượng thử nghiệm Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Liều gây chết 50 % ix A-549 HT-29 Minimum Inhibitory Concentration Sulforhodamine B Tricloacetic acid Dulbecco’s Modified Eagle Medium Cell survival % Human epidemic carcinoma Human lung carcinoma Human breast carcinoma Hepatocellular carcinoma Hormone dependent human prostate carcinoma Human lung cancer Human colon cancer OVCAR Human ovarian cancer MIC SRB TCA DMEM CS% KB LU-1 MCF7 Hep- G2 LNCaP f MLP/CB δH δC ADMET CTPT VSVKĐ s: Singlet fMet-LeuPhe/cytochalasin B Proton chemical shift Carbon chemical shift Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity d: Doublet m: Multiplet Nồng độ ức chế tối thiểu Axit tricloaxetic Môi trường nuôi cấy tế bào % tế bào sống sót Dịng tế bào ung thư biểu mơ KB Dịng tế bào ung thư phổi LU-1 Dòng tế bào ung thư vú MCF7 Dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt LNCaP Dòng tế bào ung thư phổi A-549 Dòng tế bào ung thư đại tràng HT-29 Dòng tế bào ung thư buồng trứng OVCAR Độ dịch chuyển hóa học proton Độ dịch chuyển hóa học cacbon Chỉ số hấp thụ, phân bố, chuyển hóa, thải trừ độc tính Cơng thức phân tử Vi sinh vật kiểm định t: Triplet q: Quartet dd: double doublet x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loài Zanthoxylum phân bố Việt Nam Bảng Cơng dụng lồi thuộc chi Zanthoxylum Việt Nam Bảng Các hợp chất khung benzophenanthridine phân lập từ loài Z nitidum 15 Bảng 1.4 Các hợp chất khung aporphine, benzylisoquinoline, furoquinoline phân lập từ loài Z nitidum 19 Bảng 1.5 Các hợp chất khung quinoline, quinolone phân lập từ loài Z nitidum 21 Bảng 1.6 Các hợp chất amine phân lập từ loài Z nitidum 22 Bảng 1.7 Các hợp chất lignan phân lập từ loài Z nitidum 22 Bảng 1.8 Các hợp chất coumarin phân lập từ loài Z nitidum 25 Bảng 1.9 Các hợp chất flavonoid phân lập từ loài Z nitidum 26 Bảng 10 Các hợp chất tinh dầu lồi Z nitidum 28 Bảng 1.11 Các hợp chất khác phân lập từ loài Z nitidum 30 Bảng 3.1 Các cao chiết methanol tổng 48 Bảng 3.2 Các cặn chiết phân đoạn thu từ cao methanol tổng thân cành 49 Bảng 4.1 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao chiết methanol tổng 62 Bảng 4.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao chiết methanol tổng 62 Bảng 4.3 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cặn chiết phân đoạn 63 Bảng 4.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao chiết phân đoạn 63 Bảng 4.5 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN1, ZN2 số liệu tham khảo 64 Bảng 4.6 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN3 số liệu tham khảo 67 Bảng 4.7 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN4, ZN5 số liệu tham khảo 69 Bảng 4.8 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN6 số liệu tham khảo 73 Bảng 4.9 Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR DEPT ZN7 số liệu tham khảo 75 Bảng 4.10 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN8 số liệu tham khảo 76 Bảng 4.11 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN9 số liệu tham khảo 78 Bảng 4.12 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN10 ZN11 80 Bảng 4.13 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN12 ZN13 83 Bảng 4.14 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN14 85 Bảng 4.15 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN15 87 Bảng 4.16 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR hợp chất ZN16, ZN17 89 xi Bảng 4.17 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR ZN18, ZN19 số liệu tham khảo 92 Bảng 4.18 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR ZN20 số liệu tham khảo 94 Bảng 4.19 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR, DEPT ZN21 số liệu tham khảo 95 Bảng 4.20 Số liệu phổ 1H-NMR,13C-NMR ZN22 số liệu tham khảo 96 Bảng 4.21 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR ZN23 β-amyrin 98 Bảng 4.22 Cấu trúc hóa học 23 hợp chất phân lập từ thân cành loài Z nitidum 100 Bảng 4.23 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập 102 Bảng 4.24 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn hợp chất phân lập 103 Bảng 4.25 Năng lượng liên kết phối tử với protein tubulin 104 Bảng 4.26 Kết mô docking phân tử chất ức chế tiềm với protein 105 Bảng 4.27 Chỉ số ADMET dự đốn độc tính chất ức chế tiềm 106 Bảng 4.28 Hàm lượng nitidine có phận loài Z nitidum 108 Bảng 4.29 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn mẫu tinh dầu 112 PL50 Phụ lục 17.3 Phổ DEPT ZN17 PL51 Phụ lục 18: Các phổ ((+)-lyoniresino-9′-O-β-D-glucopyranoside)(ZN18) Phụ lục 18.1 Phổ 1H-NMR ZN18 PL52 Phụ lục 18.2 Phổ 13C-NMR ZN18 Phụ lục 18.3 Phổ HSQC ZN18 Phụ lục 18.4 Phổ HMBC ZN18 PL53 Phụ lục 19: Các phổ ((-)-lyoniresino-9′-O-β-D-glucopyranoside)(ZN19) Phụ lục 19.1 Phổ 1H-NMR ZN19 Phụ lục 19.2 Phổ 13C-NMR ZN19 PL54 Phụ lục 19.3 Phổ HSQC ZN19 Phụ lục 19.4 Phổ HMBC ZN19 PL55 Phụ lục 20: Các phổ ((-)-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside) (ZN20) Phụ lục 20.1 Phổ 1H-NMR ZN20 PL56 Phụ lục 20.2 Phổ 13C-NMR ZN20 Phụ lục 20.3 Phổ HSQC ZN20 Phụ lục 20.4 Phổ HMBC ZN20 PL57 Phụ lục 21: Các phổ 2,6-dimethoxybenzoquinone (ZN21) Phụ lục 21.1 Phổ 1H-NMR ZN21 PL58 Phụ lục 21.2 Phổ 13C-NMR ZN21 Phụ lục 21.3 Phổ HSQC ZN21 Phụ lục 21.4 Phổ HMBC ZN21 PL59 Phụ lục 22: Các phổ 3β-hydroxycholest-5 ene-7-one (ZN21) Phụ lục 22.1 Phổ 1H-NMR ZN22 Phụ lục 22.2 Phổ 13C-NMR ZN22 PL60 Phụ lục 22.3 Phổ DEPT ZN22 Phụ lục 22.4 Phổ HSQC ZN22 PL61 Phụ lục 23: Các phổ β-amyrin (ZN23) Phụ lục 23.1 Phổ 1H-NMR ZN23 Phụ lục 23.2 Phổ 13C-NMR ZN23 PL62 Phụ lục 23.3 Phổ HSQC ZN23 Phụ lục 23.4 Phổ HMBC ZN23 PL63 Phụ lục 24: Tinh dầu lồi Z nitidum Phụ lục 24.1 Sắc kí đồ tinh dầu lồi Z nitidum Phụ lục 24.2 Sắc kí đồ tinh dầu loài Z nitidum PL64 Phụ lục 24.3 Sắc kí đồ tinh dầu cành lồi Z nitidum