TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHI ỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN THỊ BÉ TEN NGHIÊN C ỨU PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY VÀ B ẢO QUẢN ENZYME BROMELAIN TỪ VỎ KHÓM Luận văn tốt nghiệp Ngành CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM C[.]
GIỚI THIỆU
Tổng quan
Khóm là m ột loại trái có giá ịtrdinh dưỡng cao vừa là ngu ồn nguyên liệu để tạo ra các ảsn phẩm có giá trị trong công ngh ệ thực phẩm Trong khóm có ch ứa một hệ enzyme mà ch ủ yếu là bromelain, m ột enzyme có ứng dụng cao trong công ngh ệ sinh học cũng như trong công ngh ệ thực phẩm: trong sản xuất nước mắm, trong sản xuất bia, làm m ềm thịt mực…và nghiên c ứu gần đây nó được ứng dụng trong sản xuất mắm cá lóc phile rút ngắn thời gian làm chín m ắm Bên ạcnh đó nó còn được dùng nhiều trong y học như: ngừa huyết áp, trị bệnh viêm, hỗ trợ tiêu hóa, xử lý v ết thương tăng sức đề kháng, … Chính vì tầm quan trọng của bromelain đã có nhi ều nghiên ứcu tìm ra phương pháp trích ly nó từ các bộ phận khác nhau ủca cây khóm.
Vỏ khóm là m ột nguồn nguyên liệu dồi dào mà ta t ận dụng được từ các nhà máyảsn xuất các ảsn phẩm từ khóm Giống như các enzyme khác, hoạt tính xúc tác ủca enzyme “bromelain v ỏ” c ũng chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân t ố môi tr ường như: pH và nhi ệt độ… Nhân t ố bên trong: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm ch ức của enzyme, phương pháp trích ly và độ tinh khiết của enzyme Do bromelain rất dễ bị tácđộng bởi nhiều yếu tố do đó tìm ra ph ương pháp bảo quản để giữ được hoạt tính ít bị biến đổi sau thời gian bảo quản là v ấn đề quan trọng đặt ra sau khi tìm ra phương pháp trích ly.
Từ vấn đề trênđã đặt ra, việc nghiên cứu phương pháp bảo quản cũng như trích ly enzyme bằng phương pháp ấsy phun đã được nghiên cứu enzyme bromelain trong vỏ khóm là c ần thiết.
Mục tiêu nghiênứcu
Tìm ra nhiệt độ và n ồng độ pectin bổ sung vào dung d ịch enzyme bromelain thô sau khi ly tâm sau th ời gian bảo quản 4 ngày.
Tìm nhiệt độ và n ồng độ maltodextrin ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain bằng phương pháp ấsy phun.
Tìm nhiệt độ bảo quản enzyme bromelain thô ở dạng bột bằng phương pháp ấsy phun sau 7 ngày b ảo quản.
LƯỢC KHẢO TÀI LI ỆU
Giới thiệu về Bromelain
2.1.1 Sơ lược về lịch sử phát hiện enzyme bromelain
Enzyme bromelain lần đầu tiênđược biết đến vào kho ảng thế kỷ XIX Năm 1892, nhà khoa h ọc Chittenden là ng ười đầu tiênđã tìm th ấy sự hiện diện của một loại enzyme có kh ả năng thủy phân protein trong d ịch của cây và trái khóm Ông đã g ọi nó là “bromeline” Sau này, thu ật ngữ “bromelin” hay “bromelain” đã được dùng để gọi chung các enzyme thủy phân protein (protease), được tìm thấy từ những giống khóm thu ộc cùng họ Bromeliaceae. Ở nước ta nghiên ứcu về Bromelain được bắt đầu từ những năm 1968-1970.
(Nguồn: http://www.en.wikipedia.org/wiki/bromelain)
2.1.2 Hệ enzyme trong cây khóm
Từ các bộ phận của cây khóm ta đều có th ể trích ly được có m ột hệ enzyme kháđa dạng và ph ức tạp, chúng thay đổi trong suốt quá trình phát triển của cây và qu ả khóm H ệ enzyme trong khóm c ũng bao gồm nhiều nhóm enzyme v ới cácđặc tính khác nhau, trongđó enzyme protease chi ếm đa số, nó chi ếm 50% protein trong thân và trái khóm Protease trong khóm g ồm có cysteine protease, đây là nhóm enzyme chính với đại diện là enzyme bromelain, ngoài ra còn có m ột lượng ít các enzyme peroxidase, amylase, cellulase, acid phosphatase.
(Nguồn: http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/bromelain.html )
- Enzyme peroxidase tồn tại và có ho ạt tính không đổi trong suốt quá trình phát triển của quả Tuy nhiên, trong quả chín lượng enzyme này gi ảm dần, chỉ còn kho ảng 1/3 so với ban đầu (Gortner and Singleton, 1965).
- Cysteine protease là nhóm enzyme proteplytic ch ủ yếu được tìm thấy trong dịch thân và qu ả khóm Protease trong qu ả khóm xu ất hiện từ lúc bắt đầu ra hoa, tăng dần về số lượng trong suốt thời kỳ phát triển của quả Ở giai đoạn quả chín, lượng enzyme này có xu h ướng giảm dần (R E Paull and C-C Chen, 2003).
- Từ cây d ứa Ananas, người ta tìm thấy có t ối thiểu 4 loại cysteine protease khác nhau (Rowan et al., 1990) Protease hiện diện chủ yếu trong dịch từ thân d ứa là bromelain thân , ngoài ra còn có ananain (EC 3.4.22.31) và comosai n Trong dịch quả dứa, cysteine protease chủ yếu là bromelain quả.
- Từ quả xanh của giống Bromelia Hieronymi Mez, họ Bromeliaceae, các nhà khoa học đã tìm th ấy được một loại peptidase mới tên là Hieronymain I Loại enzyme này c ũng đã được xác ậlp vào nhóm cysteine protease.
- Trong quá trình phát triển của cây và trái khóm, d ịch chiết thân và trái còn ch ứa một số enzyme dehydrogenase, synthase, pectin methyl esterase, pectin galactoronase nhưng với số lượng rất thấp.
Bromelain hiện diện ở tất cả các phần của cây khóm, loài Ananas Chúng chi ếm trên 50% protein trong thân và quả khóm Do đó enzyme bromelain còn được gọi là
“enzyme khóm” Tùy theo ngu ồn gốc, bromelain được phân làm 2 lo ại là bromelain thân (trích từ dịch thân khóm) bromelain quả (trích từ dịch quả khóm) và bromelin thân là nhóm enzyme có giá tr ị kinh tế Bromelain có ho ạt tính xúc tác ựs phân gi ải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay facin trong cây thu ộc họ Sung Enzyme bromelain có tr ọng lượng phân t ử khoảng 33.000 Da, lớn gấp 1,5 lần so với papain.
Thịt quả khóm ch ỉ có ho ạt tính enzyme bromelain kể từ ba tháng trước khi chín, trong đó ho ạt tính bromelain cao nhất là kho ảng 20 ngày tr ước khi chín Khi trái chín, hoạt tính bromelain giảm xuống nhưng không m ất hẳn.
Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2.
Hoạt tính: là m ột endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân protein t ại vị trí bất kỳ trên mạch polypeptide.
Cơ chất: thủy phân c ơ chất tự nhiên ầln tổng hợp tương tự như bromelain thân Tuy nhiên, bromelain quả hoạt động thủy phân t ốt nhất trên cơ chất tổng hợp Bz-Phe- Val-Arg+NHMec, không ph ản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân.
(Nguồn: http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/enzymes/ec3/ec04/ec22/ec0033/index.html )
Bromelain quả là m ột protease acid, có phân t ử lượng khoảng từ 23-31kDa tùy thuộc vào k ỹ thuật phân tích c ủa phòng thí nghi ệm Bromelain quả có điểm đẳng điện pI = 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân v ới pI = 9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et al., 1985).
2.1.3 Tính chất của bromelain i Một số tên gọi và kí hiệu của bromelain
Tên khoa học và y h ọc: sulfhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease
Tên thương mại: bromanase, bromelain 2400 Maximum Strength
Enzyme được tìm thấy trong dịch chiết từ cây d ứa chủ yếu là các protease cysteine. Bromelain thân là m ột protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là m ột glycoprotein, mỗi phân t ử có glycan g ồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose và fructose S ợi hydrate carbon này liên kết hoán vị với sợi polypeptide Trong sợi hydrate carbon này m ột nữa sợi không liên quan đến cơ chế xúc tác ủca phân t ử.
Bromelain thân và qu ả có thành ph ần acid amin thay đổi khác nhau Bromelain thân có kho ảng 321-144 acid amin Còn bromelain qu ả thì có kho ảng 283-161 acid amin.
Bromelain thân là m ột sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valin và ở đầu carbonyl là glycine.
Bromelain quả có amino acid ở đầu amine là alanine. ii Cấu trúc khô ng gian
Murachi và Busan phân tích c ấu trúc bậc 1 của bromelain và nh ận thấy cách ắsp xếp amino acid trong phân t ử bromelain như sau:
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys– Gly – Ala – Cys – Tryp –
Hình 1: Cách sắp xếp các amino acid trong phâ n tử bromelain
Enzyme bromelain là m ột protease-thiol Trong trung tâm ho ạt động của bromelain có ch ứa cysteine và hai s ợi polypectide liên kết với nhau bằng cầu nối –
S – S Phân tử có d ạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp.
Trong phân t ử có ch ứa nhóm sulfhydryl có vai trò ch ủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong m ỗi phân t ử có t ất cả 5 cầu nối disulfite Ngoài ra trong phân t ử còn có ion
Zn 2+ có vai trò duy trì c ấu trúc không gian của enzyme. iii Hoạt tính của enzyme bromelain
Động học phản ứng enzyme
2.2.1 Cơ chế tácđộng của enzyme
Bản chất của cơ chế tác dụng bởi enzyme trong các phản ứng hóa h ọc là kh ả năng hoạt hóa c ơ chất để các ơc chất tham gia phản ứng mạnh hơn Theo đó, c ơ chất tương tác với enzyme do sự cực hóa, s ự chuyển dịch của các electron, ựs biến dạng các liênếkt Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ dàng tham gia vào các phản ứng hơn. Điểm đặc biệt là khi có enzyme tham gia xúc tác, thì năng lượng cần cho phản ứng nhỏ hơn khi không có enzyme, và c ũng nhỏ hơn so các phản ứng được xúc tác ởbi các catalist Quá trình xúc tácải trqua ba giai đoạn: Ở giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu Kết quả tạo thành m ột phức hợp enzyme-cơ chất, phức hợp này không b ền Phản ứng này x ảy ra rất nhanh và đòi h ỏi một ít năng lượng. Ở giai đoạn thứ hai: cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm c ăng và phá vỡ các liênếkt đồng hóa tr ị. Ở giai đoạn thứ ba: sản phẩm được tạo thành enzyme được giải phóng và tr ở lại trạng thái ựt do Liên kết giữa enzyme và c ơ chất để tạo thành ph ức hợp enzyme-cơ chất là liên kết hydro, tương tác ĩtnh điện, tương tác vadervaals.
2.2.2 Phương trình động học Michalelis Menten
Năm 1913 hai nhà khoa h ọc Leonom Michalelis và Maud Menten đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng xúc tác ởbi enzyme và l ập phương trình phản ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme.
Mô hình chuy ển hóa c ủa phản ứng enzyme với một cơ chất như sau. k 1
Với k1, k-1 , kcat là nh ững hằng số của các phản ứng E là enzyme, S c ơ chất, ES phức hệ enzyme-cơ chất, nồng độ enzyme ban đầu được ký hi ệu là E tot Giả sử nồng độ cơ chất ban đầu cũng là n ồng độ cơ chất ở trạng thái cân bằng của phản ứng.
Nếu bỏ qua phản ứng ng ược P + S ES
Tốc độ phản ứng tại th ời điểm bắt đầu phản ứng: V = dP/dT = kcat [ES].
Phản ứng xấp xỉ trạng tháiổn định (Steady -state) : [ES] là h ằng số
Tốc độ xuôi chi ều = tốc độ ngược chiều.
K1 [S][E] = k1[S] (Etot – [ES]) = (k -1 + kcat) [ES] k1[S] Etot = (k-1 + kcat + k1 [S] ) [ES]
[ES] = [S] Etot / (Km +[S]) Với Km = ((k-1 + kcat)/k1
Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sau cho tất cả enzyme đều tham gia phản ứng tạo phức hệ ES ta có: [ES] = E tot Phản ứng sẽ đạt tốc độ cực đại Vmax = kcat Etot
V = kcat [ES] = kcat [S]Etot /(Km + [S]) V = Vmax [S]/ (Km + [S]) (*)
Phương trình (*) là ph ương trình Michaelis – Menten Ph ương trình này ph ản ánh ươtng quan định lượng giữa tốc độ ban đầu của phản ứng V, tốc độ cực đại của phản ứng Vmax, nồng độ cơ chất ban đầu [S] và h ằng số Km. k cat
Hình 3: Đồ thị biểu diễn ph ương trình Michalaelis-Menten
Các giới hạn của phương trình Michaelis – Menten
V ~ (1/2) Vmax = (1/2) kcat Etot Ý ngh ĩa của hằng số Michaelis – Menten
Km có đơn vị là Molar, khi [S] = K m thì V = Vmax/2 và ng ược lại.
Km nhỏ chỉ ra rằng, enzyme chỉ cần một lượng nhỏ cơ chất để đạt đến trạng thái ổn định Vì thế, tốc độ cực đại đạt đến tại một nồng độ cơ chất thấp tương đối Km lớn chỉ ra rằng, cần một nồng độ c ơ chất cao để phản ứng có th ể đạt đến tốc độ cực đại. là h ằng số tốc độ phản ứng hai phân t ử hiệu quả tại nồng độ cơ chất thấp Kcat/Km ~ 10 9 chỉ ra rằng sự xúc tác ầgn như hoàn ch ỉnh: mỗi khi cơ chất gặp enzyme hầu như nó đều chuyển thành s ản phẩm.
Nghịch đảo 2 vế phương trình:
1/V = (1/Vmax) + (Km/Vmax)*(1/[S]) Đây là ph ương tr ình được Line Weaver và Burk đưa ra vào n ăm 1943 có d ạng y= ax + b là ph ương trình đường thẳng.
Nếu vẽ đồ thị đ ường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/ Vmax và c ắt trục hoành ở -1/Km và độ nghiêng (slope) bằ ng Km/Vmax Từ phương trình trên ta dễ dàng xác định Km và
Vmax trong các thí nghiệ m.
(1/mM/phú Độ nghiêng = k/V mmax
Hình 4: Đồ thị biểu diễn phương trình Line Weaver
Ngoài 2 d ạng phương trình động học phổ biến ở trên còn có m ột dạng phương trình khác do Eadie và Hofstee đưa ra.
V = Vmax – K m (V/[S]) Đây c ũng là ph ương trình dạng y= ax + b với tung độ gốc bằng Vmax còn hoành độ gốc bằng V ma x /K m và độ nghiêng là –K m Phương trình này ít khi được sử dụng tuy nhiên trong một số trường hợp đặc biệt ng ười ta vẫn sử dụng dạng ph ương trình này. v/[S]
Hình 5: Đồ thị biểu diễn phương trình Eadie-Hofstee
(Nguồn: Phạm Thị Trân Châu, 2007)
Giới thiệu về pectin
2.3.1 Nguồn gốc và c ấu tạo
Pectin là m ột polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành ph ần tham gia xây d ựng cấu trúc tế bào th ực vật Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan D ưới tác dụng của acid, enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin.
Pectin là h ợp chất cao phân t ử polygalactoronic có đơn phân t ử là galactoronic và rượu metylic Trọng lượng phân t ử từ 20.000 – 200.000 đvC Hàm l ượng pectin 1% trong dung dịch có độ nhớt cao, nếu bổ sung 60% đường và điều chỉnh pH môi trường từ 3,1-3,4 sản phẩm sẽ tạo đông.
Cấu tạo phân t ử pectin là m ột dẫn suất của acid pectic, acid pectic là m ột polymer của acid D-galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết 1- 4-glycozide.
Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là ch ỉ số methoxyl “MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl –OCH 3 có trong phân t ử pectin và ch ỉ số este hóa “DE” th ể hiện mức độ este hóa c ủa các phân tử acid galactoronic trong phân t ử pectin. i Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa : loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có trong thương mại chia pectin thành
2 độ methoxyl hóa th ấp.
- Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin – H MP): DE >50 % hay MI > 7%. Chất này có th ể làm t ăng độ nhớt cho sản phẩm Muốn tạo đông c ần phải có điều kiện pH
= 3,1 – 3,4 và n ồng độ đường trên 60 %.
- Pectin methoxyl hóa th ấp (Low Methoxyl Pectin – LMP): DE < 50 % hay MI < 7%. Được sản xuất bằng cách giảm nhóm methoxyl trong phân t ử pectin Pectin methoxy thấp có th ể tạo đông trong môi tr ường không có đường Chúng thường được dùng làm màng bao b ọc các ảsn phẩm.
Hình 8: Low Methoxyl Pectin ii Theo khả năng hoà tan trong n ước:
- Pectin hoà tan (methoxyl polygalacturonic): là m ột polysacharic có c ấu tạo bởi các gốc acid galacturonic trong đó m ột số gốc acid có ch ứa nhóm th ế methoxyl.
- Pectin không hoà tan trong n ước (Protopectin): là d ạng kết hợp của pectin với araban (polysaccharide ở thành t ế bào).
Trong quá trình bảo quản có th ể bị tách nước hoặc lão hóa Quá trình tạo đông ph ụ thuộc vào nhi ều yếu tố: nguồn pectin, mức độ methoxy hóa càng cao thì kh ả năng tạo đông càng cao Khi s ử dụng cần phải hòa tan pectin vào n ước, khi pectin hút đủ nước thì mới sử dụng ở công đoạn cuối chế biến.
Các pectinđều là nh ững chất keo háo nước nên có khả năng hydrat hóa cao nh ờ sự gắn các phân tử nước vào nhóm hydroxyl c ủa chuỗi polymethyl galacturonic Ngoài ra,trong phân t ử pectin có mang điện tích âm nên chúng có khả năng đẩy lẫn nhau có kh ả năng làm giãn m ạch và làm t ăng độ nhớt của dung dịch Khi làm gi ảm độ tích điện và hydrat hóa s ẽ làm cho s ợi pectin xích lại gần nhau và t ương tác với nhau tạo nên một mạng lưới ba chiều rắn chứa pha lỏng ở bên trong.
2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo gel i Pectin
Mạch phân t ử của pectin là c ơ cấu chính của hiện tượng tạo gel Vì thế, lượng pectin có trong d ịch đường phải đạt một hàm l ượng tối thiểu nào đó m ới tạo được sự keo tụ Nồng độ pectin trong dung dịch càng l ớn thì sự liên hợp giữa các phân tử xảy ra càng nhanh, h ệ keo đông t ụ càng b ền Thường lượng pectin sử dụng khoảng từ 0,5-1% Khi dùng lượng pectin vượt quá ượlng thích hợp sẽ thu được gel quá cứng, vì vậy đối với các loại quả chứa dư pectin người ta cần tiến hành phân gi ải bớt chúng bằng cáchđun lâu h ơn.Tuy nhiên, chất lượng của hệ keo pectin lại phụ thuộc rất lớn vào tính ch ất của pectin chứ không đơn thuần ở hàm l ượng pectin được sử dụng Hai yếu tố quan trọng hàng đầu là chi ều dài m ạch phân t ử pectin và mức độ methoxyl hóa trong phân t ử của chúng Chiều dài c ủa phân t ử quyết định độ cứng của gel
• N ếu phân t ử pectin quá ngắn thì nó s ẽ không t ạo được gel mặc dù sử dụng với liều lượng cao.
• N ếu phân t ử pectin quá dài thì gel tạo thành r ất cứng.
Mức độ methoxyl hoá quyđịnh cơ chế tạo gel
Khả năng keo hóa c ủa pectin phụ nhóm methoxyl Tùy thu ộc vào ch phân t ử pectin mà các kiểu kết hợp thuộc tương đối vào m ức độ hiện diện của các ỉ số methoxyl cao (>7%) hoặc thấp (3 – 5%) ở giữa chúng sẽ khác nhau trong việc tạo gel.
Bảng 2: Tác dụng DE của pectin lên ựs tạo gel Điều kiện tạo gel
DE (%) pH Đường (%) Ion hoá trị II Tốc độ tạo gel
Nước là dung môi để pectin có th ể trương nở và khu ếch tán ạto nên dung dịch đồng thể Nước đóng vai trò quan tr ọng giúp pectin định hướng và s ắp xếp lại mạch phân tử của chúng Thông thường khi độ ẩm của dung dịch tạo keo tăng lên thì quá trình keo hóa di ễn ra càng nhanh. iii Đường
Trong dung dịch nước, pectin ở trạng thái hòa tan do có sự tạo thành các liên ếkt hydro giữa các nhóm OH- của mạch phân t ử pectin và H+ c ủa phân t ử nước Khi đường xuất hiện, đường đóng vai trò c ủa chất hydrate hóa, ng ậm mất phần nước đang liên kết với pectin Khi đó pectin tr ở nên không hòa tan Cộng với tácđộng của ion H+ từ lượng acid sử dụng để tạo đông, H+ làm trung hòa điện tích của các gốc COO- trên mạch phân t ử pectin, tạo gốc -COOH Vì thế sợi pectin không còn đẩy nhau mà ti ến lại gần nhau và t ạo mạng Lượng đường trong hỗn hợp pectin – đường – acid th ường phải lớn hơn 50% thì mới có kh ả năng tạo gel Thông th ường người ta tạo hỗn hợp có 65% đường để tiến hành keo đông N ếu hàm l ượng đường dùng cao hơn, sự kết tinh đường có th ể xảy ra trên bề mặt hạt keo, hoặc ngay trong hệ keo Để có th ể khắc phục có th ể thay thế một phần đường saccharose bằng đường glucose nhằm tránh hiện tượng kết tinh đường Với pectin chất lượng càng tốt thì thì lượng pectin dùng để gel hóa dùng m ột lượng đường càng ít. iv Acid
Pectin chỉ có th ể tạo gel trong môi tr ường acid có pH < 4 Trong môi tr ường có H+, các phân tử pectin tích điện âm s ẽ bị trung hòa và tr ở thành d ạng trung hòa điện dễ tạo đông t ụ Hơn nữa, ion H+ sẽ thay thế các ion kim loại (nếu có) trong nhóm cacboxyl của phân t ử pectin và chuy ển dạng muối pectat (không t ạo đông) thành dạng pectin (có t ạo đông).Acid s ử dụng để tạo đông c ần có m ức độ phân ly cao h ơn acid pectic để acid này có th ể ngăn cản sự phân ly c ủa acid pectic, và gi ữ cho chúng ở dạng trung hòa điện tích Nồng độ ion H+ càng l ớn thì khả năng tạo gel của dung dịch pectin sẽ càng cao C ần duy trì độ pH thấp để khi đun nấu sẽ gây ra quá trình nghịch đảo đường saccharose (30 – 50% đường thêm vào pectin) để ngăn cản sự kết tinh của đường Cũng không nên dùng quá nhiều acid, vì pH quá thấp sẽ gây ra s ự nghịch đảo một lượng lớn saccharose từ đó gây k ết tinh glucose và hóa gel nhanh t ạo nên các vón cục Thường dùng độ pH từ 3-3,5.
Mức độ tạo gel chỉ tăng đến một giới hạn nào đó c ủa nồng độ acid rồi sẽ ngừng lại bởi vì ở ngưỡng nồng độ đó toàn b ộ gốc COO- của phân t ử pectin đã được trung hòa điện tích Nên dù có tăng thêm ion H+ cũng không th ể tăng thêm mức độ tạo gel Nồng độ acid để tạo gel dung dịch pectin phụ thuộc mức độ methoxyl của pectin và hàm l ượng pectin trong dung dịch Khi hàm l ượng pectin sử dụng tăng khoảng 0,05 –0,1% thì pH c ủa dung dịch có th ể tăng lên 1đơn vị Nếu phải sử dụng pectin có kh ả năng đông t ụ yếu thì nên ătng nồng độ acid lên Nhưng việc tăng nồng độ này l ại dễ làm t ăng lượng đường chuyển hóa và làm t ăng tính háo nước của sản phẩm.Pectin là ch ất tạo gel quan trọng nhất được sử dụng để tạo ra cấu trúc gel cho thực phẩm Khả năng tạo gel của nó được sử dụng trong những thực phẩm cần có s ự ổn định của nhiều pha Tác dụng tạo gel của pectin được sử dụng chủ yếu trong các sản phẩm mứt trái cây và mứt đông.
Tác dụng của pectin là t ạo ra cấu trúc mứt đông và m ứt trái cây không bị thay đổi trong quá trình vận chuyển, tạo ra mùi vị thơm ngon cho sản phẩm và gi ảm sự phá vở cấu trúc Trong một số trường hợp, pectin còn được sử dụng với carageenan để tăng hiệu quả tạo gel.
(Nguồn : http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/cong-nghe-san-xuat-pectin.170186.html )
Giới thiệu về maltodextrin
Maltodextrin là các loại polysaccharide không ng ọt, có công th ức
(C6H10O5)n.H2O, là s ản phẩm thủy phân tinh b ột không hoàn toàn (b ằng enzyme hoặc acid), có đương lượng dextrose (DE) từ 4 – 20.
Maltodextrin được ứng dụng rộng rãi trong nhi ều lĩnh vực chế biến thực phẩm và dược phẩm Sản phẩm có DE 4 – 7 dùng để tạo màng m ỏng dễ tan và t ự hủy được làm v ỏ bọc kẹo, bọc trái cây khi bảo quản, đưa vào kem, làm ph ụ gia cho các loại nước xốt, làm ch ất độn tạo viên trong công nghiệp dược Sản phẩm có DE 9 – 12 dùng trong công nghi ệp sản xuất đồ uống, đặc biệt là đồ uống cho trẻ em, đồ uống và th ức ăn riêng cho vận động viên thể thao, làm k ẹo gum mềm, chất trợ sấy, chất giữ hương, yếu tố tạo hình Sản phẩm có DE 15–18 được sử dụng làm ch ất kết dính, chất tăng vị cho đồ uống, đưa vào thành ph ần bơ, sữa bột, cà phê hòa tan và làm v ật mang các thành phần không ph ải đường.
Sản phẩm Tinh bột Maltodextrin
Phản ứng hoá nâu Ức chế điểm đồng hoá
Tính thẩm thấu Ức chế tăng trưởng tinh thể
Khả năng hoà tan Độ ngọt Độ nhớt/ yếu tố tạo hình
Hình 9: Sơ đồ biến đổi tính chất hó a l của Maltodextrin theo giátrị DE
Tính chất của maltodextrin có DE 9–12: ít hút ẩm, ít ngọt, ít tham gia phản ứng hóa nâu, hòa tan t ới 30% chất khô, hàm l ượng glucose 0,8%, maltose 2,9% chất khô.
Giới thiệu về sấy phun
Sấy phun là quá trình sấy thực hiện bằng cách phun vật liệu (chất lỏng) thành h ạt nhỏ và r ơi tự do trong buồng sấy Môi ch ất sấy (không khí nóng, khói v.v…) được thổi vào và chuy ển động cùng với hạt vật liệu và s ấy khô v ật liệu Nhờ quá trình phun vật liệu thành h ạt nhỏ (đường kính vài ch ục micron) nên bề mặt tiếp xúc giữa vật liệu và môi ch ất rất lớn nên ườcng độ sấy cao, thời gian sấy ngắn (vài giây đến vài ch ục giây).
Cường độ sấy tăng tỉ lệ thuận với sự tăng của bề mặt tiếp xúc giữa vật liệu sấy và tác nhân sấy, tức là ph ụ thuộc vào độ phân tán của chất lỏng được phun thành b ụi.
2.5.2 Các phương pháp ấsy phun
Ly tâm : Cho dung d ịch đi vào m ột đĩa quay nhanh với tốc độ từ 2.000-6.000 vòng/phút và d ưới tác dụng của lực ly tâm, dung d ịch sẽ được phun ra thành b ụi mù.
Cơ khí : Cho dung dịch đi qua một đầu ‘‘hoa sen’’ l ắp cố định ở đỉnh tháp nhờ một bơm cao áp với áp suất khoảng ≥200 at Để phun đều và t ạo được thành các tia nhỏ, các vòi phun thường phải đục nhiều lỗ nhỏ với đường kính khoảng 0,5mm Loại này không thích h ợp vơi sử dung dịch huyền phù và các dung dịch có độ nhớt cao.
Dùng khí nén: Có thể dùng khí nén với áp suất từ 3–6 at để nén dung dịch qua các vòi phun t ĩnh.
Trong ba trường hợp trên phương pháp ly tâmđược dùng nhiều hơn cả vì nó có hi ệu quả cao nhất nhưng phương pháp này tiêu hao nhiều năng lượng nhất.
Sấy phun dùng để sấy các dung dịch thành b ột như: cà phê, các loại trái cây, sữa, trứng, muối hoà tan Môi ch ất sấy là khói hay không khí nóng tu ỳ thuộc vào v ật liệu sấy.
2.5.3 Tác nhân sấy i Nhiệm vụ của tác nhân sấy
Tác nhân sấy có nhi ệm vụ:
- Gia nhiệt cho vật sấy
- Tải ẩm: mang ẩm cho bề mặt vật vào môi tr ường
- Bảo vệ vật sấy khỏi bị hư hỏng do quá nhiệt
Tùy theo phương pháp ấsy, tác nhân sấy có th ể thực hiện một hoặc hai trong ba nhiệm vụ nói trên.
Chẳng hạn, khi sấy đối lưu thì tác nhân sấy làm hai nhi ệm vụ gia nhiệt và t ải ẩm. Khi sấy bức xạ thì tác nhân sấy làm nhi ệm vụ tải ẩm và b ảo vệ vật sấy Khi sấy tiếp xúc thì tác nhân ấsy làm nhi ệm vụ tải ẩm Còn khi s ấy bằng điện trường tần số cao thì tác nhân sấy làm nhi ệm vụ tải ẩm.
Khi sấy chân không ch ỉ có th ể cấp nhiệt bằng bức xạ hay dẫn nhiệt hoặc kết hợp cả hai cách cấp nhiệt này Vi ệc thoátẩm dùng bơm chân không hay k ết hợp bơm chân không và thi ết bị ngưng kết ẩm, vì vậy phương pháp ấsy chân không không c ần tác nhân s ấy. ii Các loại tác nhân sấy
Không khí ẩm: là lo ại tác nhân sấy thông d ụng nhất Dùng không khí ẩm có nhi ều ưu điểm, thứ nhất không khí có s ẵn trong tự nhiên, thứ hai không độc và th ứ ba là không làm ô nhi ễm sản phẩm.
Khói lò: s ử dụng khói lò làm môi ch ất sấy có ưu điểm là không c ần dùng calorife, phạm vi nhiệt độ rộng nhưng dùng khói lò có nhược điểm là khói lò có th ể ô nhi ễm sản phẩm do bụi và các chất có h ại như CO2, SO2,
Hỗn hợp không khí h ơi và h ơi nước: tác nhân sấy loại này dùng khi c ần có độ ẩm.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên ứcu bao gồm :
– Kh ảo sát nhiệt độ và n ồng độ pectin bổ sung vào dung d ịch enzyme bromelain thô sau khi ly tâm sau th ời gian bảo quản 4 ngày.
– Kh ảo sát các chếđộ sấy khác nhauđến hoạt tính và ho ạt tính riêng của enzyme bromelain trích ly từ vỏ khóm Ch ọn chế độ sấy và n ồng độ maltodexrin bổ sung thích hợp nhất bằng phương pháp ấsy phun.
– Kh ảo sát nhiệt độ bảo quản enzyme bromelain ở dạng sấy phun sau khi chọn nhiệt độ và n ồng độ maltodextrin bổ sung sau 7 ngày b ảo quản.
PHƯƠNG TIỆN VÀ PH ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
Phương pháp thí nghiệm
3.2.1 Phương pháp trích ly enzyme thô từ vỏ khóm
Vỏ khóm t ừ công ty đem về được chọn lựa để loại vỏ chín hoàn toàn và enzyme bromelain được thu nhận theo sơ đồ
Ly tâm l ạnh, 6000 RPM, 20 phút
Ly tâm l ạnh (10.000 RPM, 20 phút)
Hình 10: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme bromelain vỏ (thô )
(Nguồn: Lại Thị Ngọc Hà, 2009)
3.2.2 Phương pháp xácđịnh hoạt tính của enzyme bromelain
Hoạt tính enzyme bromelain trong các nội dung nghiên ứcu được xácđịnh dựa trên sự thủy phân protein casein c ủa enzyme có trong dung d ịch, hoạt tính được đánh giá bằng lượng tyrosine sinh ra (phương pháp Kunitz, xem phụ lục).
3.2.3 Xácđịnh hàm l ượng protein của enzyme bromelain bằng Coomassie
Brillant Blue – G250 (ph ương pháp Bradford)
Phương pháp Bradford là cách xácđịnh hàm l ượng protein có trong dung d ịch được xácđịnh dựa trên phản ứng tạo màu gi ữa protein và thu ốc thử Coomassie brilliant blue Hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thụ ở bước sóng 595nm và d ựa vào đường chuẩn của protein tinh khiết ta có hàm l ượng protein của mẫu nghiên cứu (phương pháp Bradford, xem phụ lục).
Bố trí thí nghiệm
3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sátảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ pectin bổ sung đến hoạt tính của enzyme bromelain theo thời gian bảo quản. e i Mục đích
Tìm ra nhiệt độ và n ồng độ pectin bổ sung vào dung d ịch enzyme bromelain thô sau khi ly tâm sau th ời gian bảo quản 7 ngày. f ii Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với ba nhân t ố hoàn toàn ng ẫu nhiên với hai lần lặp lại Nhân t ố A: Nhiệt độ
Nhân t ố B: Nồng độ pectin bổ sung
Nhân t ố C: Thời gian bảo quản
Tổng số mẫu thí nghiệm: 2x4x5x2 (lần lặp lại) = 80 mẫu g iii Tiến trình thí nghiệm
Chuẩn bị dịch vỏ khóm xanh Các mẫu được tiến hành nh ư cách bố trí trên Theo thời gian bảo quản mẫu thí nghiệm được kiểm tra đặc tính vật lý ( màu s ắc, độ kết lắng), đo độ nhớt, đo hoạt tính của enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục) với cơ chất là casein điều kiện thí nghiệm pH =7, nhiệt độ 37 o C.
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sátảnh hưởng nhiệt độ và n ồng độ maltodextrin bổ sung lên enzyme bromelain ằbng phương pháp ấsy phun. h i Mục đích i Tìm nhiệt độ và n ồng độ maltodextrin ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain bằng phương pháp ấsy phun. j ii Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ng ẫu nhiên với 2 nhân t ố:
Thí nghiệm được lặp lại 2 lần.
Tổng số mẫu thí nghiệm: 3x2x2 = 12 mẫu k iii Tiến trình thí nghiệm
Tiến hành thí nghi ệm như cáchđã b ố trí Các mẫu thí nghiệm sau thời gian sấy đo hoạt tính bằng phương pháp Kunitz và xácđịnh hàm l ượng protein bằng phương pháp Bradford.
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sátảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain trích ly bằng phương pháp ấsy phun theo thời gian bảo quản. l i Mục đích m Tìm nhiệt độ bảo quản enzyme bromelain thô ở dạng sấy phun sau 7 ngày b ảo quản. n ii Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với hai nhân t ố, 2 lần lặp lại
G4: Ngày 4 G 5: Ngày 5 G 6: Ngày 6 G 7: Ngày 7 Ứng với mỗi nghiệm thức thời gian là m ột mẫu thử, lập lại 2 lần. o Tổng số mẫu thí nghiệm: 2x8x2 (số lần lập lại)= 32 mẫu p iii Tiến trình thí nghiệm
Sau thời gian bảo quản mẫu thí nghiệm được kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp Kunitz.
KẾT QUẢ VÀ TH ẢO LUẬN
Khảo sátảnh hưởng nhiệt độ và n ồng độ pectin bổ sung đến enzyme bromelain trích ly từ vỏ khóm theo th ời gian bảo quản
bromelain trích ly từ vỏ khóm theo th ời gian bảo quản. Để nghiên ứcu enzyme bromelain trong dung dịch khóm t ươi trích ly từ vỏ khóm, đầu tiên chuẩn bị nguyên liệu vỏ khóm để tiến hành trích ly l ấy dịch Vỏ khóm sau khi lấy về từ nhà máy được lựa chọn lấy vỏ khóm xanh có độ chín 0% - 0,25%, vì độ chín này ho ạt tính enzyme bromelain được trích ly là cao nh ất 3,975 TU/ml, theo nghiên ứcu của Nguyễn Thị Hồng Nhung và H ồ Chí Công (2010) Sau đó ti ến hành trích ly lấy dịch khóm nh ư quy trình (hình 10) Sau khi thu được dịch chiết từ vỏ khóm ta chu ẩn bị mẫu để khảo sátđiều kiện bảo quản, bảo quản ở 4 o C và -16 o C ứng với mỗi nhiệt độ ta bổ sung pectin với các nồng độ là 0,0%, 0,1%, 0,2%, 0,3% Thí nghiệm khảo sátđiều kiện bảo quản tối ưu nhất mà không làm thay đổi lớn đến đặc tính của bromelain trong dung dịch Vì vậy, vấn đề đặt ra là c ần tiến hành kh ảo sát phương pháp bảo quản enzyme trong điều kiện nào là t ốt nhất về nhiệt độ hay nồng độ pectin bổ sung để hạn chế tối thiểu sự biến đổi hoạt tính của bromelain trong dung dịch khóm. a) Vỏ Khóm b) Trước ly tâm c) Sau ly tâm
Hình 11: Nguyên liệu và dịch khó m để bảo quản
Thí nghiệm tiến hành kh ảo sátở hai điều kiện bảo quản là b ảo quản lạnh ở nhiệt độ
4 o C và b ảo quản ở nhiệt độ -16 o C Mẫu được đem phân tích ho ạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz,đồng thời được đánh giáảcm quan về cácđặc tính vật lý, có sự so sánh giữa các mẫu Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain theo nhiệt độ và n ồng độ pectin bổ sung kết quả thu được như sau:
Bảng 3: Hoạt tính bromelain theo nhiệt độ và n ồng độ pectin bổ sung
Kết quả thể hiện là ho ạt tính enzyme theo đơn vị Tu/ml Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
Các chữ cái thể hiện sự khác biệt có ý ngh ĩa thống kê giữa các giá ịtrtrung bình (ở cùng hàng ho ặc cột) ở mức ý ngh ĩa 5%
Qua kết qua thu được ở bảng 3 bảo quản ở -16 o C (3,77 TU/ml)
Kết quả còn cho th ấy không có s cho thấy so sánh giữa ở 4 o C và -16 o C thì bromelain hoạt tính tốt hơn so với bảo quản 4 o C (1,92 TU/ml). ự khác biệt giữa các nồng độ pectin bổ sung.
Bảng 4: Hoạt tính bromelain ở 4 o C theo nồng độ pectin bổ sung và th ời gian bảo quản
Thời gian Nồng độ pectin
Kết quả thể hiện là ho ạt tính enzyme theo đơn vị Tu/ml
Các chữ cái khác nhau trong cùng ộmt cột biểu thị sự khác biệt có ý ngh ĩa về mặt thống kêở độ tin cậy 95%
Bảng 5: Hoạt tính bromelain ở -16 o C theo nồng độ pectin bổ sung và th ời gian bảo quản
Thời gian Nồng độ pectin
Kết quả thể hiện là ho ạt tính enzyme theo đơn vị Tu/ml
Các chữ cái khác nhau trong cùng ộmt cột biểu thị sự khác biệt có ý ngh ĩa về mặt thống kêở độ tin cậy 95%
Từ kết quả ở bảng 4 và b ảng 5 cho thấy các mẫu dung dịch chứa enzyme được bảo quản trong điều kiện lạnh và l ạnh đông có ho ạt tính enzyme vẫn còn ổn định sau ngày đầu, đến ngày th ứ hai thì hoạt tính bromelain bảo quản ở 4 o C thay đổi rõ r ệt theo xu hướng giảm khá mạnh còn b ảo quản ở nhiệt độ -16 o C thì hoạt tính vẫn còn cao Đến ngày th ứ 3 và th ứ 4 bảo quản ở nhiệt độ 4 o C thì hoạt tính giảm dần theo thời gian nhưng đối với mẫu bảo quản ở điều kiện -16 o C hoạt tính của bromelain trong dung dịch vẫn còn cao, th ể hiện qua giá trị hoạt tính thu được không thay đổi nhiều trong suốt thời gian tồn trữ Xét về nhân t ố nhiệt độ bảo quản, theo kết quả khảo sát ta chọn nhiệt cao sau thời gian bảo quản 4 ngày Enzyme ở điều kiện bảo quản này có th ể sử dụng tốt cho nghiên ứcu trong thời gian dài Điều này có th ể giải thích ở nhiệt độ -
16 o C 86% nước trong dung dịch chứa enzyme bị đóng b ăng, phần lớn hoạt động của vi sinh bị ức chế, enzyme không ho ạt động được tránh hiện tượng tự phân c ủa chúng Vì thế, sau rã đông m ẫu có th ể duy trì được hoạt tính của bomelain gần như ban đầu Các nghiênứcu về sự ổn định của enzyme cũng cho thấy, lạnh đông nhanh ở nhiệt độ nhỏ hơn -20 o C (tốt nhất là -70 o C hay lạnh đông b ằng Nitơ lỏng) là ch ế độ tối ưu nhằm duy trì hoạt tính của enzyme (Copeland, 2000).
Các pectinđều là nh ững chất keo háo nước nên có khả năng hydrat hóa cao nh ờ sự gắn các phân tử nước vào nhóm hydroxyl c ủa chuỗi polymethyl galacturonic
Ngoài ra, trong phân t ử pectin có mang điện tích âm nên chúng có khả năng đẩy lẫn nhau có kh ả năng làm giãn m ạch và làm t ăng độ nhớt của dung dịch Khi làm gi ảm độ tích điện và hydrat hóa s ẽ làm cho s ợi pectin xích lại gần nhau và t ương tác với nhau tạo nên một mạng lưới ba chiều rắn chứa pha lỏng ở bên trong Chính nhờ tính chất này c ủa pectin nên ta bổ sung pectin nhằm tạo gel làm gi ảm sự di chuyển của enzyme bromelain trong dung dịch nhằm tránh ựs tự phân c ủa của nó trong th ời gian bảo quản Kết quả ở bảng 4 và b ảng 5 pectin hầu như không có tác dụng ngăn sự giảm hoạt tính của bomelain trong quá trình bảo quản Ở 4 o C, pectin không có tác dụng mà có tác dụng ngược lại so với mẫu không b ổ sung pectin Có th ể kết luận bổ sung pectin 0,3% có hi ệu quả để bảo quản bromelain ở dạng lỏng nhưng bomelain được bảo quản tốt ở nhiệt độ -16 o C.
Bảng 6: Độ nhớt của dung dịch chứa bromelain theo nhiệt độ và n ồng độ pectin bổ sung
Kết quả thể hiện là độ nhớt enzyme theo đơn vị cP
Các chữ cái thể hiện sự khác biệt có ý ngh ĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức ý ngh ĩa 5% Số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại
Qua kết quả ở bảng 6 cho thấy độ nhớt có s ự khác biệt giữa các nồng độ pectin bổ sung, bổ sung pectin với nồng độ càng cao thì đồng thời độ nhớt của dung dịch khóm c ũng tăng nhưng không khác biệt ở nhiệt độ 4 o C và -16 o C.
Bảng 7: Độ nhớt của dung dịch chứa bromelain ở 4 o C theo nồng độ pectin bổ sung theo thời gian bảo quản
Thời gian Nồng độ pectin
Kết quả thể hiện là độ nhớt của dung dịch khóm theo đơn vị cP
Các ốs liệu trong bảng là k ết quả trung bình của 2 lần lặp lại Các chữ cái khác nhau trong cùng ộmt cột dọc biểu thị sự khác biệt có ý ngh ĩa về mặt thống kêở độ tin cậy 95%
Bảng 8: Độ nhớt của dung dịch chứa bromelain ở -16 o C theo nồng độ pectin bổ sung theo thời gian bảo quản
Thời gian Nồng độ pectin
Kết quả thể hiện là độ nhớt của dung dịch khóm theo đơn vị cP
Các ốs liệu trong bảng là k ết quả trung bình của 2 lần lặp lại Các chữ cái khác nhau trong cùng ộmt cột dọc biểu thị sự khác biệt có ý ngh ĩa về mặt thống kêở độ tin cậy 95%
Về đặc tính vật lí, mẫu dung dịch khóm t ươi chứa enzyme bromelain quả sau ly tâm ban đầu có tr ạng thái trong, màu vàng sángđặc trưng của dung dịch khóm, không v ẩn đục, không có mùi l ạ Sau những khoảng thời gian bảo quản mẫu ở hai điều kiện trên, nhận thấy các mẫu dung dịch có s ự khác biệt ở nhiều mặt Mẫu được bảo quản ở điều kiện -16 o C, sau các thời gian bảo quản 4 ngày, dung d ịch sau rã đông v ẫn giữ được trạng thái và màu sắc như ban đầu, không mùi l ạ, bị vẩn đục do sự lắng tụ của pectin nằm ở phía dưới của đáy cốc và n ồng độ pectin càng cao thì sự lắng tụ càng nhi ều Mẫu được bảo quản ở điều kiện 4 o C, sau 4 ngày b ảo quản mẫu có màu vàng s ậm, hơi có mùi l ạ, bị vẫn đục và b ị kết lắng thể hiện khá rõ và t ăng dần theo nồng độ pectin bổ sung.
Từ các kết quả đã kh ảo sát có thể kết luận: nên ửs dụng dung dịch khóm ch ứa enzyme bromelain b ảo q u ản ở n h i ệt đ ộ - 1 6 o C , vì nhiệt độ này bromelain thay đổi ít so với ban đầu về hoạt tính bromelain cũng như về trạng thái, màu sắc.
Ảnh hưởng nhiệt độ và n ồng độ maltodextrin bổ sung lên enzyme bromelain bằng phương pháp ấsy phun
bromelain bằng phương pháp ấsy phun.
Dịch khóm sau khi trích ly t ừ vỏ đã được ly tâm 6.000 vòng/phút trong 20 phút, sau đó ti ến hành k ết tủa dịch enzyme bromelain ở nồng độ cồn 96 o , nhiệt độ tủa cồn -
16 o C với tỷ lệ 1 cồn : 3 dịch khóm trong th ời gian 4 giờ (Hồ Chí Công, 2010) Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong th ời gian 20 phút, thu được tủa Để tiến hành đồng nhất các mẫu có cùng n ồng độ và nhi ệt độ sấy, do đó d ịch khóm được chuẩn bị trước một ngày, c ấp đông ở tủ (-86 o C) cho ngày sau s ử dụng Kết tủa thu được hoà tan l ại với dung dịch maltodextrin có n ồng độ 15% và 20% đã được làm l ạnh ở 4 o C với tỉ lệ 20% thể tích so với thể tích dịch khóm ban đầu Mẫu sấy phun ở nhiệt độ 85 o C, 95 o C và 105 o C Sau khi sấy, enzyme thu được hòa tan tr ở lại nước cất 4 o C (với 0,5g mẫu pha với 10ml nước) để xácđịnh hoạt tính enzyme còn l ại và hàm lượng protein Để đánh giá ệhiu quả của phương pháp ấsy phun cần dựa vào ho ạt tính riêngđể chọn nhiệt độ sấy và n ồng độ maltodextrin bổ sung thích hợp Kết quả thu được như sau:
Bảng 9: Hoạt tính bromelain theo nhiệt độ sấy và n ồng độ maltodextin bổ sung
Nhiệt độ Nồng độ Hoạt tính Hoạt tính riêng Hoạt tính riêng còn lại sấy ( o C) maltodextrin (%) (TU/g) (TU/mg protein) so với ban đầu (%)
Ghi chú: kết quả thể hiện hoạt tính riêng enzyme còn lại theo đơn vị TU/g Các giá ịtrtrên là kết quả trung bình của 2 lần lặp lại
Trong cùng một cột, cùng một hàng nh ững giá trị có kèm ch ữ cái khác nhau là khác nhauở mức ý ngh ĩa 5%
Từ kết quả bảng 9 cho thấy khi tăng nhiệt độ sấy sẽ làm ho ạt tính bromelain cũng như hoạt tính riêng gimả nhưng khi tăng nhiệt độ lên 105C thì hoạt tính lại tăng trở o lại do thời gian tiếp xúc giữa mẫu với nhiệt được rút ngắn nên hoạt tính ổn định hơn so với 95 o C So sách giữa 3 nhiệt độ đã kh ảo sát, ấsy ở nhiệt độ 85 o C giữ được hoạt tính tốt hơn sấy ở 95 o C và 105 o C Qua kết quả khảo sát chọn chế độ sấy 85 o C là t ốt nhất để trích ly enzyme ở dạng bột.
Xét về nồng độ maltodextrin mẫu có b ổ sung maltodextrin 15% thì luôn cho ho ạt tính riêng còn lại cao do chất trợ sấy maltodextrin đã bao l ấy enzyme hạn chế tác dụng của nhiệt tới protein ngăn cản quá trình làm biến tính protein trong mẫu sấy, so với mẫu bổ sung 20% maltodextrin thì mẫu bổ sung 15% tốt hơn, điều này có th ể giải thích do khi bổ sung maltodextrin với nồng độ lớn thì lượng maltodextrin này có hiện diện của đường khử và acid amin trong quá trình tự phân có th ể tácđộng đến hoạt tính enzyme cũng như hoạt tính riêng của nó khi s ấy ở nhiệt độ cao.
Ban đầu Tủa Sấy 85 o C Sấy 95 o C Sấy 105 o C
Hình 15: Đồ thị biểu diễn hoạt tính riêng enzyme bromelain ở các nhiệt độ sấy và nồng độ maltodextrin bổ sung
Tuy nhiênđể chọn chế độ sấy thích hợp ngoài các yếu hoạt tính, hàm l ượng protein, hiệu suất thu hồi, hoạt tính riêng là yếu tố quan trọng để đánh giá ừTđồ thị cho thấy sấy 85 o C có b ổ sung 15% maltodextrin hoạt tính riêng còn 66,98% so với mẫu ban đầu, cao nhất so với các mẫu còn l ại Hoạt tính riêng enzyme bromelain giảm ầ ă ệ độ ấ ư ă o ầ ă ạ d n khi t ng nhi t s y nh ng khi t ng lên 105C ph n tr m ho t tính riêng còn lại tăng lên do nhiệt độ tăng rút ngắn thời gian tiếp xúc giữa nhiệt và m ẫu hạn chế tácđộng của nhiệt làm bi ến tính protein nên hoạt tính riêng lúcạli còn 64,43% so với ban đầu Qua kết quả khảo sát chọn nhiệt độ sấy 85 o C với nồng độ maltodextrin 15% là t ốt nhất cho chế độ sấy phun enzyme bromelain ở dạng bột.
Khảo sátảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain ở dạng bột trích ly bằng phương pháp ấsy phun theo thời gian bảo quản
Sử dụng kết quả tối ưu của thí nghiệm 2, tiến hành s ấy mẫu ở chế độ sấy 85 o C và nồng độ maltodextin bổ sung 15% Chuẩn bị một lượng mẫu lớn để tiến hành b ảo quản từ phương pháp ấsy phun Enzyme bromelain thu được sau khi sấy được bảo quản trong bao bì PA nhằm tránh ựs hút ẩm, mẫu dem di bảo quản được chia ra thanh nhiều gói nh ỏ do lấy mẫu kiểm tra hoạt tính mỗi ngày theo th ời gian nhằm tránh ựs giao động của nhiệt độ và hút ẩm trở lại Tiến hành b ảo quản khảo sát với hai nhiệt độ: Nhiệt độ thường và 4 o C, kiểm tra hoạt tính mỗi ngày trong 7 ngày bảo quản Kết quả thu được như sau:
Bảng 10: Hoạt tính enzyme bromelain theo nhiệt độ và th ời gian bảo quản ở dạng bột sau khi sấy phun
Thời gian Nhiệt độ bảo quản
Kết quả thể hiện hoạt tính enzyme bromelain đơn vị TU/g Các giá ịtrtrên là kết quả trung bình của 2 lần lặp lại
Trong cùng một cột hoặc dòng, nh ững giá trị có kèm ch ữ cái khác nhau là khác nhauở mức ý ngh ĩa 5%
Từ kết quả ở bảng các mẫu chứa enzyme được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thường và 4 o C có ho ạt tính enzyme không ổn định trong khoảng 5 ngày b ảo quản đầu Tuy nhiên, c h o đến n g à y b ảo quản thứ 6 có s ự thay đổi rõ r ệt, hoạt tính enzyme bắt đầu ổn định hơn so với những ngày b ảo quản t r ước h o ạt t í n h c a o t r ở l ại g ần h o ạt t í n h s a u k h i s ấy đối với mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C. Còn m ẫu bảo quản ở nhiệt độ thường tới ngày th ứ 6 mẫu cũng có tính ổn định so với những ngày tr ước đó nh ưng đến ngày th ứ 7 hoạt tính lại giảm Bảo quản ở nhiệt độ 4 o C hoạt tính kháổn định ở ngày th ứ 7 không thay đổi so với ban đầu Vậy bảo quản ở 4 o C tốt hơn nhiệt độ thường đều này là do điều kiện bảo quản được ổn định nhiệt độ theo thời gian bảo quản, qua nhiều nghiên cứu 4 o C là nhi ệt độ thích hợp được chọn làm nhi ệt độ bảo quản nhiều loại hoá chất cũng như nhiều loại enzyme, còn nhi ệt độ thường nhiệt độ không ổn định luôn thay đổi theo nhiệt độ môi tr ường, enzyme lại rất dễ bị ảnh hưởng bởi nhân t ố này do đó nhi ệt độ thường không thích h ợp để bảo quản bromelain ở dạng bột sau khi được sấy phun Sau một thời gian bảo quản, thích hợp với môi tr ường bảo quản, các phần tử protease trong mẫu bảo quản được ổn định hơn do đó ho ạt tính tăng trở lại như ban đầu Qua kết quả thu được từ thí nghiệm 3 này ta ch ọn nhiệt độ bảo quản ở 4 o C là nhi ệt độ thích hợp để bảo quản cho sản phẩm enzyme bromelain trích ly từ vỏ khóm b ằng phương pháp ấsy phun.