2008 Copy 2 a |
TRUONG DAI HOC KY THUAT CONG NGHE TP.HCM
KHOA MOI TRUONG & CONG NGHE SINH HOC - -000 - BAO CAO ' ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC - CHỦ NHIỆM: KS PHAM MINH NHUT - Tháng 12/2008 - 100021531
XÂY DỰNG NGAN HANG GIONG VI SINH VAT _PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC GIẢNG DẠY |
Trang 2
_ BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINHHỌC _ -000 - _ BÁO CÁO
ĐẺ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
XÂY DUNG NGAN HANG GIÓNG VI SINH VẬT |
Trang 3MUC LUC 1 Chương 1: Giới thiệu 3- 1.1 Đặt vấn đề 22222 k1 L1 cc.crrrrEErrirrrEErrrrrrrrrrrrrrrrriee Hee 3 1.2 Mục 7 1 ¬_ 3 1.3 Nội dung TH HH TT TH 3 2 Chương 2: Tổng quan 4
2.1 Giới thiệu một số chúng vi sinh vật sử dụng trong thực hành
Vĩ sinh đại CƯƠNG 4
2.L1 Bacillus subtiÏiS G sk.TnSH HH ke LH TH TH ng ng g0 ve 4 2.1.2 NAM MEN eeesssccscssecsssesssssssssecsssssssssesssssesssusessuseessevessavessssecseneessseessstecessneessseens4
2.1.3 Nắm THỐC 52269 E919E11511911155115711111111111121.2231232eeExe _¬ „„4 |
2.1.4 Xạ khuẩn ma 0S | 22 Giới thiệu một số chủng vi sinh vật sử dụng trong thực hành ~ |
Vi sinh ứng dụng và công nghệ lên men «s« Ố 2.2.1 Acetobacter xylinum
_ 2.2.2 Mucor 22s csstecerrcee ¬- — 6
2.2.3 Kefr HH HH ke 8
3 Chương 3: Vật liệu và phương pháp 9
| 3.1 Phân lập một số ching vi sinh vật sử dụng trong thực hành Vĩ sinh đại cương 3.1.1 Phân lập Bacillus suÐiÏiS se HH TH HT ng HH TH ng net 9 3.1.2 Phan lap TAM MEN 0 eseseecesseseccesecsecsucsesscsecsesscsessesscssesesussscsssessssassacsscesseseveees 10 |
3.1.3 Phân lập nắm méc ccscocsssssssssssssntsssssssssisstesseeseetentnesnetnesneteetnenne Mo
3.1.4 Phân lập xạ khuẩn 4 13
3.1.5 Phân lập E Coli stress ld
32 Phân lập một số chúng vi sinh vật sử dụng trong thực hanh Vi sinh ứng dụng và Công nghệ lên men | : | 15 3.2.1 Nắm men trong ứng dụng lên men rượu -s-s- se +x+xtersrxersvrsrssrsrssee 15~ 3.2.2 Nắm mốc trong các ứng dụng thủy phân . - c5 cc<scc<e TY 1x14 17
3.2.3 Vi khuẩn lactic trong ứng dụng lên men lactic 5-5-5 <k+ssesevesss 21
3.2.4 Vi khuan Acetobacter xylinum trong sản xuất Nata de coco 24 4 Chương 4: Kết qua 30
Trang 5
CHUONG I: GIOI THIEU 1.1 Đặt vấn đề Ở Việt Nam, ngành Công nghệ sinh học đang trên đà phát triển khá mạnh Vì
đây là ngành học được ưa thích và có nhiều cơ hội cho sinh viên sau khi tốt nghiệp Mặc dù trường ta đi sau những trường khác trong công tác đào tạo nhưng cũng đã có
những chiến lược hết sức hợp lý để hình thành nên những kỹ sư Công nghệ sinh học
có trình độ kỹ thuật tốt Đó là đào tạo sinh viên Công nghệ sinh học theo các chuyên
ngành thế mạnh của trường là Công nghệ sinh học thực vật, Công nghệ sinh học ứng ©
dụng trong Môi trường - và nhất là công nghệ vi sinh
Hién nay, do nganh Công nghệ sinh học chỉ mới thành lập từ năm 2005 nên vẫn còn nhiều khó khăn trong công tác giảng dạy, nhất là trong khâu giảng dạy thực hành các môn học liên quan đến chuyên ngành vi sinh đo chưa có được bộ sưu tập giống vi
_ ginh vật để phục vụ cho quá trình giảng dạy |
Đứng trước những tình hình cấp thiết về ngân hàng giống vi sinh vật phục vụ -
cho các học phần thực hành vỉ sinh như thực hành Vi sinh dai cương, Vi sinh ứng Ằ dụng, Công nghệ lên men , chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng ngân hàng giống vi sinh vật phục vụ cho công tác giảng dạy” nhằm phục vụ cho công tác
giảng dạy ngày càng tốt hơn cho sinh viên ngành Công nghệ sinh học nói riêng và sinh | viên Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học nói chung ¬
1.2 Mục đích
Xây dựng ngân hàng giống vi sinh vật, một số giống thông dụng phục vụ cho © _ cơng tác giảng dạy các môn thực hành liên quan đến chuyên ngành Vi sinh Xây dựng
ngân hàng giống vi sinh vật phục vụ cho giảng dạy thực hành 1.3 Nội dung
- _ Phân lập và bảo quản một số chủng vi sinh vật phục vụ cho giảng dạy môn học
Vị sinh đại cương
- Phan lập, bước đầu xây dựng quy trình lên men và bảo quản phục vụ cho giảng
đạy môn hoc Vi sinh ứng dụng và Công nghệ lên men
1.4 Phạm vi nghiên cứu
Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này, chủng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu
Trang 6
chủng vi sinh vật có thể ứng dụng trong giảng dạy, chưa thể phân biệt đến loài Để có thê xác định đến loài cần nhiễn nghiên cứu chuyên sâu hơn và cần có thời gian và kinh
phí đầy đủ
Trang 7
CHUONG II: TONG QUAN |
2.1 Giới thiệu một số chủng vi sinh vật sử dụng trong thực hành Vi sinh đại
Cương |
Môn học thực hành Vị sinh đại cương là môn học nền tảng giúp sinh viên các
kiến thức cơ bản nhất về thế giới vi sinh vật, biết cách nuôi cấy, phân lập và quan sát
hình thái một số chủng vi sinh vật như vi khuẩn, nắm men, nắm mốc, Xạ khuẩn (nói
chung)
2.1.1 Bacillus subtillis
Từ bacillus nhằm miêu tả hình đáng của một nhóm vỉ khuẩn khi được quan sắt
dưới kính hiển vi Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que Do đó, một sô nơi gọi là khuẩn que hoặc trực khuẩn
Trực khuẩn có ở mọi nơi trong tự nhiên và khi điều kiện sống gay go, ching có
ás 1
: _ khả năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông" trong thời gian dài Qua kính hién vi Bacillus subtilis đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình
ra ở một đầu Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống vi sinh vật này rất -
_ rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng 2.1.2 Nam men
Nắm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm eukaryote Kích thước của tế bao nắm men thường gấp 10 lần so với kích thước vi khuẩn và có thể nhìn thấy rõ dưới
kính hiển vi quang học "
Tùy loài nấm men mà tế bào có hình cầu, hình trứng, hình oval, hình ellipse, -
hinh mi phot, hinh myn com, hinh sao thé, hinh cái liém Cac loài nắm men CÓ
i khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả Khuẩn ty giả chưa hình thành sợi rõ rệt mà chỉ là nhiều tế
_ bào nối với nhau thành chuỗi dài Có loài có thể tạo thành váng khi nuôi cấy trên môi
_ trường địch thể | :
Thành tế bào nắm men dày khoảng 25 nm Đa số nam men có thành phần cầu
_ tạo bởi glucan và mannan Một số thành tế bào nấm men có chứa thành phần là kiin
và mannan Trong thành tế bào nắm men chứa khoảng 10% protein và một lượng nhỏ
._ lipid (Nguyễn Lân Dũng, 1998)
Trang 8
Một số ít nắm ở thể đơn bào có hình trứng (yeast=nắm men), đa số có hình sợi (fñilamentous fungi=nắm sợi), sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn
Chiêu dài của sợi nâm có thê tới vài chục centimet Các sợi nằm phát triên chiêu dài
theo kiểu tăng trưởng ở ngọn Các sợi nắm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại
môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bảo tử nâm, tê bào nâm hoặc
một đoạn sợi nắm có thể phát triển thành một hệ sợi nắm có hình dạng nhất định gọi là
khuẩn lạc nắm LN guyén Lan in Ding, 1998)
Hình 2.1: Khuẩn lạc nắm mốc
2.1.4 Xa khuẩn
Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn tỉ khí sinh Chỉ
Actinomycetes và vài chỉ khác có khuẩn ty khí sinh Loại khuẩn ty không mang bào tử được gọi chung là khuẩn ty đỉnh dưỡng
khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đứt đoạn Màu sắc của khuẩn ty ở | bao) Soi ndm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy:
loài Đường kính của sợi nắm thường từ 3-5um, có khi đến 10um, thậm chi đến Imm |
_ phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nắm (mycelium) khí sinh xù xì như bông Trên
Trang 9
xa khuẩn hết sức phong phú như màu trắng, vàng, đỏ, lục, tím, nâu, den Khuan ty
cơ chất có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tế Khuẩn ty cơ chất phát triển trong
một thời gian dài trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh Sau một thời gian -
phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các sợi bào tử: thẳng, lượn sóng,
_ vòng, Có loại mọc vòng đơn cấp, có loại mọc vòng hai cấp Những đặc điểm này
quan trọng trong định tên xạ khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 1998)
Hình 2.2: Xạ khuẩn quan sát dưới kính hiển vi
Bào tử xạ khuẩn được hình thành theo ba phương thức sau: | - Phuong thitc phat trién toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của thành khuẩn ty
hình thành ra thành của bào tử
- _ Phương thức phát triển trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng
sinh chất và thành khuẩn ty
- _ Phương thức phát triển bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty không tham gia vào
_ quá trình hình thành bào tử ¬¬ |
Thành tế bào xạ khuẩn có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 — 20 nm, có tác
dụng duy trì hình đáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào |
Màng tế bào chất của xạ khudn day khoang 7,5 — 10 nm Chúng có cấu trúc vào chức năng tương tự như màng tế bào chất của vi khuẩn
Thể trung gian hay mesosome nằm ở phía trong của màng tế bào (CM) và có | hinh phién, hinh bong hay hinh ống Chức năng là làm tăng diện tích tiếp xúc của CM - và do đó làm tăng cường hoạt tính enzyme, tăng chuyển điện tử |
Khuẩn lạc của xạ khuẩn rất đặc biệt, nó không trơn ướt như vi khuẩn mà thường -
_ở dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ vì -
thế mới có tên xạ khuẩn
Trang 10
2.2.1 Acetobacter xylinum
_ - Ching Acetobacter xylinum nay cé nguén tit Philippin Acetobacter xylinum
thuộc nhóm vi khuẩn acetic Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey th
Acetobacter xylinum thuộc: lớp Schizommycetes, b6 Pseudomonadales, ho |
- Pseudomonadieae | | |
- A.xylimum là loại vi khuẩn dài khoảng 2um, đứng riêng lẽ hoặc xếp thành chuỗi,
có khả năng tạo váng hemicellulose khá dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod và H;SO¿
- A.xylinum sinh trưởng ở pH < 5 t? = 28-32°C va có thể tích luỹ 4.5% acid |
acetic Acid acetic là sản phâm sinh ra trong quá trình hoạt động của vỉ khuẩn, nhưng - khi chúng vượt quá mức cho phép, chúng sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạt động
cua vi khuẩn (Nguyễn Thúy Hương, 2002)
Hình 2.3: Vì khuẩn Acetobacter xylinum |
2.2.2 Mucor
Mucor là nhóm nắm hoại sinh trên xác bã hữu cơ đặc biệt trong dạ dày của
ngựa và trâu bò (Mucor mucedo), nhiều loài phát tán trong đất như Mucor racemosus
- và Mucor spinosus, nắm này cũng có mặt trên bánh mì củ, thịt, phó mát, nước trái - cây nhiều loài gây ra bệnh mycormycosis trên người và gia súc; Tuy nhiên nhiều loài 7 nắm cũng có ích như Mucor rouxii phân hủy tỉnh bột thành đường; Đặc tính phát triển
- của Mucor giống như Rhizopus, ví dụ như chúng phát triển khuẩn ty trên bánh mì củ -
trong 24 giờ |
. Nắm Mucor sinh sản vô tính như nắm Rhizopus bằng cách thành lập cọng mang bọc
bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore)
- Cong mang bọc bào tử với những bào tử bất động hình thành trong cái bao hay bọc bào tử (sporangia); mỗi bọc bào tử phát triển tận ngọn, không phân nhánh và - cọng mang bọc bào tử phát triển riêng biệt, không cùng nhóm (hình 3.6) nhiều khi cé
Trang 11
nhiều loài cá biệt có thể mang bọc bào tử phân nhánh như Mucor racemosus (hình 3.7) và Mucor plumbeus
Hình 2.4 Cọng mang bọc bào tử với I bọc bào tử (Sharma, 1998)
Trong tế bào chất chứa nhiều nhân.nhưng ở bào tử chỉ có 1 nhân, tuí bào tử đổi |
sang màu nâu khi bào tử trưởng thành và dé đàng vở ra để phóng thích bào tử theo gió, nhiều khi bào tử dính vào chân côn tring dé phát tán tới những nguồn thức ăn khác và khi có điều kiện thuận tiện, bào tử nây mầm cho ra một khuẩn ty mới
Không giống như những loài khác trong giống Mucor, Mucor rouxii có bào tử
_ nấy mầm như nấm men trong điều kiện ky khí, đặc biệt khi có sự hiện diện của khí _CO2; tuy nhiên , khi có đủ oxi thì bào tử nây mầm cho ra một khuẩn ty bình thường
2.2.3 Kefir |
Cac hat kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt, hình dạng không ổn định và thường kết chùm với nhau với đường kính trung bình 0,3 — 2, 0cm Hạt kefir có chứa vi _ khuẩn lactic và nắm men Hạt kefir không tan trong nước và hầu hết các dung môi , -
Khi thả vào sữa thì hạt keñr thấm nước (sữa) và trở nên có màu trắng đục Đôi khi,
người ta còn tìm thấy cả vi khuẩn 4 acefi và 4 racens (Trần Thị Ánh Nguyệt, 2006)
Ngoài các tế bào vi sinh vật hạt kefir còn chứa protein (chiếm khoảng 30% tong
chất khô) va carbohydrate (25 — 50%)
2.2.4 Vĩ khuẩn lên men lactic |
Vi khuẩn lên men lactic bao gồm nhiều giống và nhiều loài khác nhau Chúng
bao gồm vi khuẩn gram duong, gram âm, tăng trưởng trong điều kiện vi hiểu khí đến |
điều kiện ky khí bắt buộc Những vi khuẩn này là thành phần chính của các starter sử
dụng trong các quá trình lên men đặc biệt trong sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa
Trang 12
_ Ngoai ra mét sé chung con dong vai trd quan trong trong hệ vi sinh đường ruột - ' Trong sữa và các sản phẩm sữa lên men thì họ Lacfobaciilus đóng vai trò quan trọng
góp phần cải thiện sức khỏe của người tiêu dùng (Coeuret et al, 2003)
Trong phomat, lactobacilli déng vai trd là starter trong quá trình lên meh phomat cứng Một số chủng lactobacillus khác lại có vai trò trong quá trình ủ chín _ phomat đặc biệt là rút ngắn thời gian ủ chín phomat Còn trong sữa chua và các sản phẩm sữa lên men, có sự hiện diện của rất nhiều chủng Lactobacillus khac nhau giúp _ tạO hương vị cho sữa chua
Trang 13
CHUONG III: VAT LIEU VA PHUONG PHAP 3.1 Địa điểm va thời gian
- _ Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh - Khoa Môi trường & Công nghệ sinh học
- _ Thời gian: từ tháng 03/2008 — 12/2008 | |
3.2 Vật liệu
3.2.1 Môi trường phân lập
- Môi trường Cao thịt - pepton - - Môi trường Hansen
Môi trường Czapek Môi trường Sabouraud - Môi trường Gauze 1 - Môi trường MRS - Stra tươi không đường 3.2.2 Dụng cụ - Thiết bị | - Dia petri - Ong nghiém - Day cay vong - Todm - Bé diéu nhiét - Autoclave
a 3.3 Phan lap cac ching vi sinh vật phục vụ cho công tác giảng dạy thực hành | môn Vi sinh đại cương
3.3.1 Phân lập Bacillus sp 3.3.1.1 Nguồn phân lập
- Cỏ khô
3.3.1.2 Môi trường phân lập
Môi trường Cao thịt - pepton
3.3.1.3 Cách thức phân lập
- _ Cỏ khô cắt nhỏ cho vào bình tam giác
Trang 14- _ Đun sôi 15 — 30 phút để diệt các tế bào sinh đưỡng và các tế bào không sinh bào tử, — — | - Day nut bong va dé th 4m 25 — 26°C C trong vong 48 ~ 72h 3.3.1.4 Cách thức giữ giống
- _ Để giữ giống, pha môi trường thạch nghiêng cao thịt - pepton để tiến hành giữ giống và bảo quản trong điều kiện lạnh (4°C)
- _ Sau thời gian 1 tháng, tiến hành cấy chuyển tiếp sang môi trường cao thịt -
| pepton | a
3.3.2 Phan lap nim men Saccharomyces cerevisiae
3.3.2.1 Nguồn phân lập `
- Nấm men bánh mì, nắm men cơm rượu
- Các loại nước trái cây lên men
3.3.2.2 Môi trường phân lập:
Môi trường Hansen 3.3.2.3 Cách thức phân lập
Có 2 cách phân lập: a Cấy trải
- - Từ nguồn phân lập như bánh men cơm rượu hay nước trái cây lên men, tiến:
hành pha loãng mẫu theo những độ pha loãng khác nhau như 102, 103, 10
| ca Từ mỗi độ pha loãng, hút 1001 dịch pha loãng cho vào giữa đĩa môi trường
Hansen | |
-_ Dùng que cấy trang trải đều dịch pha loãng và đợi đến khi khô rồi đi ủ ở
30°C trong 48h
- Chọn những khuẩn lạc đặc trưng của nắm men: tròn, lỗi, bóng, có màu trắng
sữa cấy chuyên sang môi trường Hansen để tạo dòng thuần
b Cay ria | |
-_ Đối với mẫu phân lập từ bánh men bánh mì, tiến hành chuyển mẫu từ dạng
rắn sang dạng lỏng Đối với mẫu phân lập từ nước trái cây lên men thì không cần pha
loãng
- _ Sử dụng que cấy vòng lấy một ít sinh khối cấy trên môi trường Hansen, ủ và
chọn những khuẩn lạc đặc trưng của nắm men 13
Trang 15
3.3.2.4 Cách thức giữ giống
- Tiến hành giữ giống trên môi trường Hansen thạch nghiêng Thời gian bao - quản là 1 tháng Sau thời gian đó tiễn hành cấy chuyền
3.3.3 Phân lập nắm mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger 3.3.3.1 Nguôn phân lập | |
- Com ngudi dé trong noi cé d6 4m cao trong thời gian 4 — 5 ngay
- - Thông qua màu sắc của mốc nhận diện:
e Méc cé mau tring: Mucor hoc Rhizopus e Méc cé mau den: Aspergillus niger
e Mốc có màu xanh lục: Penicillum italicum
© Méc cé mau vang hoa cau: Aspergillus oryzae
3.3.3.2 Môi trường phân lập
So Môi trường Czapek Môi trường Sabouraud 3.3.3.3 Cách thức phan lập - Dùng que cấy hình thước thợ lấy một ít sợi tơ nấm cấy chuyển vào môi Mã trường Czapek hoặc Sabouraud Đem ủ 30°C trong 48h 3.3.3.4 Cách thức giữ giống | - Su dung mdi trường thạch nghiêng Czapek hoặc môi trường Sabouraud - Thời gian bảo quản là 1 tháng Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyển
3.3.4 Phân lập xạ khuẩn Actinomycefes
nỉ -3.3.4.L Nguồn phân lập
| - Dat vuon
3.3.4.2 Môi trường phân lập
Môi trường Gauze I 3.3.4.3 Cách thúc phân lập
C6 2 cách phân lập tương tự như phân lập xạ khuẩn: a Cấy trải
- _ Từ nguồn phân lập đất vườn, tiến hành pha loãng mẫu theo những độ pha
loãng khác nhau như 102, 10?, 10
Trang 16- Từ mỗi độ pha loãng, hút 100 uÌ dịch pha loãng cho vào giữa đĩa môi | trường Gauze ] - Dùng que cấy trang trải đều dịch pha loãng và đợi đến khi khô rồi đi ủ ở 30°C trong 48h
- Chọn những khuẩn lạc đặc trưng của xạ khuẩn: tròn, lỗi, bông xốp cay chuyền sang môi trường Gauze I dé tạo dòng thuần
b Cấy ria
- _ Cũng từ mẫu phân lập là đất vườn, tiến hành chuyển mẫu từ đạng rắn sang
dang lỏng | |
-ò Sử dụng que cấy vòng lấy một ít sinh khối cấy trên môi trường Gauze I, Uva chọn những khuẩn lạc đặc trưng của xạ khuẩn
3.3.4.4 Cách thức giữ giống
_ = Su dụng môi trường thạch nghiéng Gauze I
- _ Thời gian bảo quản là 1 thang Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyển
¬ 8.3.5, Phân lập Escherichia Coli
3.3.5 1 Nguôn phân lập
Nước thải sinh hoạt 3.3.5.2 Môi trường phân lập
- - Môi trường BGBL broth
- Môi trường EMB
_—=_ Môi trường TSA
- _ Môi trường trypton
- - Môi trường MR-VP
- Môi trường simnons citrate - _ Các loại thuốc thử
3.3.5.3 Cách thức phân lập
- _ Mẫu nước thải sinh hoạt sau khi lấy về, hút 100 HÌ cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường BGBL broth và có chứa một ống Durnham úp ngược và đem ủ ở 'ˆ
44°C trong 24h
Trang 17
- Sau khi ủ, chọn những ống có đặc điểm là môi trường đục, có sinh hơi là
những ống dương tính Tiếp tục cay chuyển sang môi trường EMB, đây là môi trường
phân lập E Coli và ủ 37°C trong 24h
- Những đĩa cho kết quả E.Coli duong tinh trên môi trường EMB có các đặc điểm là khuẩn lạc tròn, lồi, đỏ đến đỏ đậm và có ánh kim tím, khuẩn lạc có đường kính < 0,5mm Chọn những khuẩn lạc này cấy chuyển sang môi trường TSA và ủ ở 37°C _ trong 24h
- Sau đó lấy sinh khối của E.Col thực hiện thử nghiệm sinh hóa (sử dụng : nghiệm pháp IMViC) với 4 thử nghiệm: thử nghiệm Indol trên môi trường trypton broth, thử nghiệm methyl red trên môi trường MR-VP, thử nghiệm Voges-Proskauer trên môi trường MR-VP, thử nghiệm citrate trên môi trường Simmons citrate
| - Két qua: nghiệm pháp IMViC có kết quả là (+) (+) (-) (-) thì kết luận mẫu
s nước thải này có E Coii và chúng ta lấy lại đĩa TSA chứa sinh khối Đó chinh 1a E.Coli "
| chúng ta thu được | | s
3.3.5.4 Cách thức giữ giống _
- Sử dụng môi trường TSA ©
- _ Sau 1 tháng bảo quản trong tủ lạnh tiến hành cấy chuyển để tiếp tục bảo _
_ quản | | :
7 3 4 Phân lập các chúng vi sinh vật và hoàn thiện quy trình phục vụ cho thực - hành Vi sinh ứng dụng và Công nghệ lên men 7
3.4.1 Nam men va ứng dụng lên men rượu
3.4.1.1 Phân lập nam men từ trái cdy
- Trai cdy được rửa sạch với nước cất vô trùng, trên bề mặt t được khử trùng với _ cồn 70° và xắt lát mỏng Trải đều các lát này trong 48h nhằm mục đích “bẫy” tế bào |
nắm men "
_=_ Sau đó nước trái cây được chiết vô trùng từ trái cây và được pha loãng dén 10° bằng nước cất vô trùng Nắm men được phân lập bằng cách trải đĩa với 0,1 ml dd pha loãng ở nồng độ thích hợp trên môi truong malt extract agar va môi trường PGA
(potato dextrose agar) được bổ sung acid tartric |
- U6 30°C trong 48h Chọn những khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển bằng phương -
To pháp cấy ria trên môi trường thạch nghiéng Malt Extract và giữ ở nhiệt độ -4°C
Trang 18
- Tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bao gồm thử nghiệm lên men đường, cố
định C và N, thử nghiệm Urease, khả năng tăng trưởng ở các nhiệt độ 25, 30, 37 và 50,
khả năng phân giải gelatin | - 8.4.2 NẤm mốc trong các ứng dụng thấy phân
3.4.2.1 Nguôn phân lập
- _ Từ các cơ sở sản xuất
- _ Từ các sản phẩm
3.4.2.2 Phân lập mốc Aspergillus oryzae
| | Từ mẫu sau khi đem về từ các cơ sở sản xuất hay sản phẩm, tiến hành nghiền
mẫu và pha loãng nếu cần thiết |
Cấy chuyển trên môi trường PGA và ủ ở nhiệt độ 30°C trong 48h :
_ 3.4.2.3 Phan lap méc Aspergillus niger _ Cách làm tương tự như phân lập A oryzae -
3.4.3 Vi khuẩn lactic trong các ứng dụng lén men lactic
3.4.3.1 Phan lép vi khudn lactic |
a Nguồn phân lập
- - Sữa tươi, sữa chua, yoghourt - Rau quả lên men chua
- Các thực phẩm lên men chua như: nem chua, mắm tôm chua
b Môi trường phân lập
Môi trường MRS c Quy trình phân lập
— sk Chuẩn bị mẫu
- Từ các nguồn thực phẩm khác nhau, cân n 25 g vao cac bich nylon vé tring và:
đồng nhất mẫu trong 225ml dung dịch pha loãng (BPW) sả Phân lập và xác định các đặc điểm kiểu hình
- _ 5 độ pha loãng liên tiếp của dịch đồng nhất được cấy vào đĩa môi trường MRS | _ được bổ sung thêm acid acetic dé đạt pH 5.7 và ủ ở 32°C trong 48h
- Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường MRS
- _ Từ các khuẩn lạc đặc trưng tiến hành nhuộm gram, quan sat các đặc diém hinh thái, thử nghiệm Catalase va Oxidase để khẳng định |
Trang 193.44 Phân lập vi khudn Acetobacter xylinum |
- Vi khudn Acetobacter cé thé duge phan l4p từ giấm, rượu, bia, hoa qua, |
chuối chín, váng giấm Ví dụ: muốn phân lập vi khuẩn 4cefobacfer từ không khí, " người ta pha rượu thành dung dịch 5-6% (hoặc theo kinh nghiệm dân gian, chi can lay’
một phần rượu hoà với 7 phần nước lã, đựng trong cốc miệng rộng, giữ ở tủ ấm 30°C :
trong 2-3 ngày Rượu sẽ đục và trên bề mặt xuất hiện một váng mỏng Lấy váng mỏng
này pha loãng ra, và phân lập trên môi trường thạch đĩa |
- Dé tic ché sy phat triển của các loại nắm men Mycoderma (thường phát triển đồng thời với sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter), người ta bổ sung vào môi
trường phân lập 1-1.5% acid acetic | Do những ưu điểm vượt trội của ching Acetobacter xylinum nén chủng được
- ứng dụng trong sản xuất thạch dừa - : ˆ ˆ |
Trang 20
CHUONG IV: KET QUA
4.1 Phân lập các chủng vỉ sinh vật phục vụ cho môn học Vi sinh đại cương
ALLL Phan lp Bacillus sp
Sau khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, kết quả thu được như sau:
e Xuất hiện lớp váng xám có nhiều vi khuẩn Đacilius sp vì cỏ khô bao giờ _ 'cũng xuất hiện bào tử của vi khuẩn này
e Trên kính hién vi: Té bao vi khudn Bacillus sp có hình que, dai, bào tử
_ hình ovan nằm ở xa tâm hay gần tâm khuẩn lạc Tế bảo có kích thước 3 — 5 x 0,6 m
Hinh 4.1: Té bao Bacillus sp quan sát dưới kính hiển vi
- _ Từ bình tam giác chứa sinh khối của Bacillus sp., tiến hành cây chuyển s sang môi trường thạch cao thịt - pepton để tạo dòng thuần chủng
- Sau 48h tiến hành cấy chuyển sang môi trường lỏng cao thịt — pebton để tăng sinh
Do kết quả phân lập này chủ yếu dựa vào sự quan sát đại thể và quan sát vi thể
nên chỉ có thể kết luận đây là trực khuẩn thuộc họ Bacciius sp Kết quả này cần phải
được tiếp tục cấy chuyển trên môi trường đặc trưng cho Bacillus va sau 46 khing định
lại bằng cách thử nghiệm sinh hóa để có thể xác định chính xác đến loài và có thể sử
dụng kỹ thuật PCR để định danh chính xác
4.1.2 Phân lập nấm men
- Sau khi ủở nhiệt độ thích hợp, chọn những khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường |
Hansen, đó là các khuân lạc tròn, lồi, có màu trắng sữa
- - Từ những khuẩn lạc đó, lấy ít sinh khối 1 quan sát dưới kính hiển vi: tế bào nấm men có hình trứng, có nây chôi
Trang 21
Hình 4.2: TẾ bào nắm men quan sát dưới kính hiển vi
- _ Từ các khuẩn lạc đặc trưng đó, tiến hành cấy chuyền vài lần dé tạo dòng thuần chủng
Kết quả phân lập nấm men có thể xác định được loài đó là Saccharomyces: cerevisiae vì chúng tôi tiễn hành phân lập từ nguồn là bánh men cơm rượu và từ nước
trái cây lên men và khi quan sát dưới kính hiển vi thấy một số đặc điểm đặc trưng cho
S cerevisiae Tuy nhién, để có thể chắc chắn cần phải tiến hành một số thử nghiệm
sinh hóa để có thê xác định chính xác _ 4.1.3 Phân lập nấm mắc
- Quan sat dai thé: nhận diện các chủng nấm mốc thôrig qua màu sắc như sau:
e_ Mốc có màu trắng: Ä⁄/cor hoặc Rhizopus e© Mốc có màu đen: Aspergillus niger
e_ Mốc có màu xanh luc: Penicillum italicum
Trang 22
Sau khi ủ ở nhiệt độ 30°C trong 48h, trên đĩa thạch môi trường Gauze L tìm
những khuẩn lạc đặc trưng của xạ khuẩn, đó là các khuẩn lạc tròn, lồi, bông xốp
_ Từ những khuẩn lạc đặc trưng, tiến hành làm tiêu bản quan sát dưới kínhhiển -
Hình 4.4: Xạ khuẩn quan sát dưới kính hiển vỉ
Đối với xạ khuẩn, đây là kết quả chỉ có tính chính xác tương đối Do đồ, cần phải có những nghiên cứu chuyên sâu hơn về xạ khuẩn vì đây là nhóm vi sinh vat có
khả năng ứng dụng rất cao trong thực tế
4.1.5 Phân lập E Coli
| | Kết quả phân lập E Coli nhu sau: "
- _ Trên môi trường BGBL dương tính: có bọt khí trong ống Durnham
Hình 4.5: Kết quả dương tính trên BGBL
Trang 23
7 4.2 Phan lập các chúng vỉ sinh vật và quy trình ứng dụng dự kiến phục vụ cho
| 42.1 Phan lp Aspergillus niger
Hình 4.7: Thử nghiệm IM WïC (+)(+)(-)(-)
Kết quả phân lập E Coi¿ có mức độ chính xác cao vì quy trình phân lập Z Coli
được thực hiện từ bước tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Do đó, kết quả này |
có độ tin cậy cao Tuy nhiên trong quá trình giảng dạy có liên quan đến E Coli phai thực hiện hết sức cần than vi E Coli 1a vi sinh vat gay bénh
môn học Vi sinh ứng dụng và Công nghệ lên men
Trên môi trường Czapek, nắm mốc Aspergillus niger lúc ban đầu hình thành sợi tơ màu trắng, thời gian ủ sau 48h chuyển sang màu đen
Hình 4.8: Khuẩn lạc Aspergillus niger
Lấy một ít sinh khối nắm mốc quan sát dưới kính hiển vi
Hình 4.9: sợi nắm quan sát dưới kính hiển vi
Trang 24
Đây là chủng nắm mốc được ứng dụng khá nhiều trong lĩnh vực thực phẩm cũng như trong việc tách chiết các enzyme ngoại bào như protease, amylase Do đó, dé có thê xác định chính xác cần phải có phải có những thử nghiệm khác để đảm bảo : - an toàn trong quá trình sử dụng cũng như giảng day thí nghiệm
4.2.2 Phân lập Aspergillus oryzae
Trên môi trường Czapek, nắm mốc Aspergillus oryzae lic ban đầu hình thành sợi tơ màu trắng, thời gian ủ sau 48h chuyên sang vàng hoa cau Hình 4.10: khuẩn lạc A oryzae trên môi trường Czapek A Att at As A ^ £ re wy ok ˆ Lây một ít sinh khôi nắm mốc và quan sát dưới kính hiển vi
Hình 4.11: sợi nắm quan sát dưới kính hiển vi
Đây là chủng nắm mốc được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ lên men-thực phẩm và được ứng dụng trong công nghệ sản xuất tương Tuy nhiên, để có thể Ứng _ dụng được trong giảng dạy thì cần phải có những nghiên cứu chuyên sâu hơn để có thể định danh chính xác vì nắm mốc này có hình thái rất giống với A /lavus — là loại n nắm
mốc sản sinh ra độc tố aflatoxin
4.2.3 Phan l@p Acetobacter xylinum
Trên môi trường thích hợp, khuẩn lạc dic trung cho Acetobacter xylinum có
các đặc điểm: có hình dạng tròn, nhay, tron bóng trắng trong hoặc trắng sữa, rìa mép
khuẩn lạc nhẫn, sau 4 ngày nuôi cấy đường kính đạt 2-5 mm `
Lẫy một ít sinh khối và quan sát dưới kính hiển vi: vi khuẩn Gram âm, có dạng
hình que, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi
-
Trang 25
Hinh 4.12: Vi khudn Acetobacter xylinum quan sát dưới kính hiển vi
Từ các khuẩn lạc có những đặc điểm này, tiến hành một số thử nghiệm sinh hóa để có thê xác định chính xác Kết quả như sau: thành thành rony acetan nâu trên + ethanol + CO2 và H2O
Acetobacter xylinum dugc ‘img dung trong công nghệ sản xuất bacterial
cellulose Sản phẩm này được ứng dụng rất nhiều trong cuộc sống như sản xuất Nata
de Coco (thạch dừa), ứng dụng như vật liệu trị bỏng
4.2.4 Phân lập Lactobacilius sp
_Trên môi trường MRS có bổ sung acid acetic, khuẩn lạc đặc trưng cho các _ chủng vi khudn Lactobacillus bulgaricus: khuẩn lạc tròn, phẳng, màu xám và không
có viễn xác định |
Từ những khuẩn lạc đặc trưng của Lacfobaciiius trên môi trường MRS, lấy một ` Ất sinh khối thực hiện nhuộm gram, quan sát hình thái tế bao, thực hiện phản ứng
/ catalase va oxidase Két qua cac chung Lactobacillus 1a cac ching gram duong, hinh
" _que, catalase (-) và oxidase (-)
Hình 4.13: Hình thái của vi khuẩn Lactobacilius
Trang 26
| CHUONG V: KET LUAN VA DE NGHI
5.1 Kết luận
— Thụ được 5 chủng vi sinh vật phục vụ cho giảng dạy thực hành Vi sinh đại cương
— Thu được 6 chủng vi sinh vật có thể phục vụ cho giảng dạy thực hành Vi sinh ứng
dụng và Công nghệ lên men |
5.2 Dé nghi |
- Do gidi han cia dé tài nên nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức phân biệt vi sinh vật chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái (quan sát đại thể và vi thể) Do đó, cần phải thực
hiện các nghiên cứu sâu hơn để có thé xác định đến loài, cụ thể là thực hiện tiếp tục
các thử nghiệm sinh hóa, và có thể sử dụng kỹ thuật PCR để định danh
- _ Tìm hiểu và phân lập thêm một số chủng vi sinh vật có lợi dé ứng dụng cho giảng _ đạy các môn thực hành khác như Vị sinh kỹ thuật môi trường, phân tích đánh giá chất
ò lượng thực phẩm
Trang 27
PHY LUC
Phụ lục 1: Thanh phần một số môi trường phân lập Môi trường cao thịt — pepton
- Cao thit: 5g
- Pepton: 10g
- Nuc cat: 1000ml
Môi trường Hansen
Trang 29
Phu luc 2: Quy trình ứng dụng của một số chúng vi sinh vật tố 1, Quy trình sản xuất rượu vang từ S cerevisiae
a, Nguyên liệu sỉ
- - Trái cây dùng để sản xuất rượu có hai dạng: dạng chỉ dùng nước chiết (đứa,
điều .) và dạng dùng cả vỏ lẫn hạt (nho, mơ, táo .)
- - Nguyên liệu dùng lên men cần tránh trái thối, dập nát Muốn tăng hượng
vị của sản phẩm cân đợi cho trái cây chín muỗi b Quy trình sản xuất
a Sản xuất rượu vang từ nước ép nho
Rượu vang là loại rượu được sản xuất từ lâu đời, từ nho băng phương -
pháp lên men tự nhiên, nhờ hệ VSV có sẵn trong vỏ và thịt quả nho chín lên men dịch -
ép quả nho thành rượu ethylic và CO; Độ rượu lên men vang tự nhiên là 9 — 10%
Đây là loại rượu không qua chưng cất | |
Lén men gồm 2 giai đoạn:
- - Lên men chính: 3 ngày
- Lén men phu: 3 — 4 tháng hoặc lâu hơn (nhằm mục đích tăng hương vị và độ trong của rượu) Rượu vang tồn trữ càng lâu càng ngon |
Lén men phy theo phương pháp tự nhiên thường có độ rượu thấp, dễ bị
nhiễm khuẩn (do có nhiều hệ vi sinh vật tham gia chuyên hóa đường, do vậy sản phẩm
không tỉnh khiết, nhiều sản phẩm phụ làm ảnh hưởng đến chất lượng thơm ngon của -
rượu thành phẩm
Để khắc phục nhược điểm trên và tạo sản phẩm chất lượng tốt, dn định
trong công nghiệp, người ta phải sử dụng chủng nắm men thuần khiết Nắm men được tuyển chonj để dùng trong lên men đượ nuôi cây bằng phương pháp nhân giống với thé tích tăng dần trong điều kiện vô trùng, Dịch nắm men giống đạt khoảng 10 tế bao/ml Luong giống nắm men cung cấp là 2 — 3% so với nước ép quả nho
Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, người ta thường sử dụng các chủng nắm men _ như §2ccharomyces cerevisiae, S ellipsoides Loại này có tốc độ lên men mạnh, tạo x
sản phẩm chứa 18 — 20% ethanol
sẻ Sản xuất rượu vang từ nước ép dứa
Trang 30
- Chọn trái dứa chín vàng, không bị đâp nát Gọt vỏ va rửa lại bằng
chlorur vôi nồng độ 5mg/1 (để sát trùng sơ bộ), sau đó rửa sạch bằng nước nhiều lần
- Để ráo nước, cho vào máy nghiền ép lấy nước, lọc trong, bỏ bả và tạp chất
- Cho thêm đường với nồng độ 15 — 20% Với loại trái cây có hàm - lượng đường thấp, cần phối chế thêm nước đường 70% để đạt khô 26% (tùy theo loại
trái cây mà đòi hỏi lượng đường thêm vào nhiều hay ít) Tuy nhiên, trong một số trường hợp, lượng đường có thể tăng lên để rượu trở thành rượu ngọt phù hợp với khẩu vị của người chưa quen uống rượu Có thể thêm đường vào trước khi lên men hoặc và sau quá trình lên men
- Điều chỉnh pH: pH tự nhiên của các loại trái cây phù hợp cho việt chế biến rượu vang 1a 2,8 — 3,8, tốt nhất là 3,2 — 3,5 Nếu pH quá cao có thể thêm acid citric, acid tartric ., ngugc lai, pH thấp có thể thêm carbonate calci
- _ Đun sôi 80C trong vài phút rồi làm lạnh thật nhanh dén 30°C
- _ Cấy dịch lên men giống theo tỷ lệ 2 — 3%
- _ Thường sau 4 — 12h, nước trái cây bắt đầu lên men Bọt nhỏ ở dưới, lên cao hợp với nhau thành bọt to hơn (có khi sôi ung uc) Quá trình lên men quá mạnh không tốt vì nhiệt độ sẽ lên cao phá hủy mùi hượng và tạo vị đẳng Ngoài ra, bot
trào sẽ kéo theo vỏ xác của trái cây che phủ bề mặt, tạo nguồn nhiễm của các loài vi _ - khuẩn khác
- _ Trời nóng thì cần 3 — 4 ngày là lên men xong
- Sau khi lên men chính, dịch lên men được chuyển sang thiết bị lên _ men phụ ở nhiệt độ thấp 3 — 4°C trong thời gian 3 tháng, mục đích tăng hượng vị va dé lắng trong rượu vang
- Sau cing, loc bằng máy lọc khung bản ở nhiệt độ 59C
—- Sản phẩm đóng chai được thanh trùng Pasteur ở 60°C Yéu cầu của,
sản phẩm phải trong suốt, màu vàng nhạt và có hương đặc trưng của thơm Hàm lượng
rượu 14 -15% Nồng độ đường 4 - 8% Hàm lượng acid khoảng 6 — 8g/I
| - Déi voi mot SỐ rượu vang trái cây, căn cứ vào tiêu chuẩn thành phẩm và yêu cầu của người tiêu dùng có thể bổ sung thêm một số phụ gia như: acid citric,
rượu, đường, chất thơm, mau
2 Quy trình sản xuất tương từ A oryzae
Trang 31
a Chuẩn bị đậu nành
Đậu nành rang hoặc không rang, ngâm nước đãi bỏ vỏ Nấu cho đến khi _ hạt đậu mêm và có mùi thơm
Đỗ ra nia cho ráo nước Phần nước đậu cho thêm nước cho đủ 3 lít/ lke đậu, nâu sôi, cho muối tỷ lệ 20% Cho vào keo và đem phơi ngoài năng
b
30 phút
Bột mì rang kỹ, đem trộn với đậu (áo ngoài)
Mốc giống
Cơm đã nấu chín cho vào bình tam giác Khir tring 6 121°C, latm trong
Cay mốc giống A oryzae đã phân lập thuần khiết
Ủ ở nhiệt độ phòng
Sau 4 ngày tơ nắm phủ kín hạt cơm với các bào tử đính màu vàng Đem - trộn với bột mì rang, đem sấy khô ở nhiệt độ 40C Xay thành bột nhuyễn và thu được - bột bào tử Cc 4 ˆ ngập thơm Ủ mốc
Mốc được rải lên đậu theo tỷ lệ 10 — 20g cho 1 kg đậu, trộn đều
Đậy lại bằng giấy báo (tránh ruồi và giữ ẩm)
Sau 24 giờ đảo trộ để mốc phát triển đều
Ngày thứ 3, mốc phủ đều hạt đậu, chuẩn bị giai đoạn kế tiếp -
Hãm mốc |
Cho đậu đã phủ mốc vào lọ nước đậu có hàm lượng muối là 20% Để ¬
Dem phơi nắng 7 — 10 ngày Đậu ngả sang màu sậm, đồng thời có mùi
Chat lay nước và thêm 3 lít nước muối mới 8% Ủ thêm 3 — 5 ngày
Ngả tương
Nước chắt lần 1 và 2 được trộn chung để nấu thành nước tương, còn đậu
tách riêng ra để nấu thành đậu tương hay tương hột
Nước tương: dùng đường vàng nấu thành nước màu Sau đó, đổ hỗn hợp nước màu, nước chiết lần 1 và lần 2 thêm 200g đường (chho 6 lít nước tương) Nấu sôi
Trang 32
30 phút và vớt bỏ bọt Cho thuốc chống mốc benzoat natri 0,1% Đóng chai và thanh trung Pasteur
- _ Tương hột: cho 600g đường vào 2 lít nước, nấu thật sôi Đổ phần xác đậu vào và nâu cho sôi trở lại Để nguội và cho thêm thuốc chống mốc để bảo quản lâu f Giống gốc Bột bào tử giống
Trang 33ngap > Đường > Hanh la _ > Nudc Cách tiến hành l0g 3 —ố nhánh 1000ml
Dưa cải và hành lá phơi héo, cắt khúc rửa sạch và để ráo nước
Pha 1 lít nước cùng với 30g muối và 10g đường, nấu sôi và để nguội Đồ từ từ dung dịch nước muối — đường vào keo đựng dưa cho đến khi _
Dùng vỉ tre hay bịch nylon có đựng nước để nén xuống, không để cho nguyên liệu nôi trên mặt nước
c
Đậy nắp keo lại
Sau 3 ngày dưa vàng chín, có vị chua hấp dẫn Chú ý
Dưa muối có hành lá thường có vị thơm ngon hơn do tác dụng diệt khuẩn và các hương vị đặc biệt của hành
- _ Muốn có dưa dùng nhanh có thé thay một phần nước muối dưa bằng một lượng nước đưa củ (còn tốt) để muối đưa
- =_ Có thể thay đường bằng 2 thìa canh nước cơm (chat ra lic com đang sôi)
Các nguyên liệu muối dưa nếu có lượng đường thấp dưới 1 — 2% cé thé
bổ sung thêm đường so với công thức Kypek J A Ché biên măm tôm chua a Nguyên liệu Tôm tươi Đường Bột thính gạo Rượu trắng lkg 250 — 350 kg 100 ~ 200g 100 — 200ml Tỏi, ớt, gừng thái chỉ tùy vào khẩu vị Cách tiến hành
Tôm cắt đâu, rửa sạch, đề ráo -
Dùng rượu trắng tráng qua tôm và bỏ nước đi
Trang 34
- Bé.sung thém nguyén liệu: 100ml rượu trắng đường muối, thính Trộn các nguyên liệu thật đều
- Gài nén chặt, đậy nắp keo và đem phơi nẵng trong 7 — 15 ngày để quá trình lên men lactic diễn ra từ từ
- _ Bồ sung vào keo: tỏi, ớt gừng thái chỉ và để thêm 1 — 2 ngày, ta thu được tôm chua thành phẩm
c Yêu câu
Sản phẩm có màu đỏ tươi, có vị chua, ngọt, mặn, hài hòa với mùi thơm
đặc trưng của mắm tôm chua Sau khi thành phẩm có thê bảo quản trong tháng 4 Quy trình sản xuất Nata de coco a Chuẩn bị giống > Giống Acetobacter xylinum được nuôi trong môi trường thạch nghiêng, thành phần gồm: SA 8g DAP 2g Saccharose 20g ` Agar _— 20g "Nước dừa 1l
>_ Các ống nghiệm chứa môi trường thanh trùng ở 121°C trong 20 phút
> Cay gidng , dé trong tu ấm 3- 4 ngày
> Tiến hành nhân giống, có thể qua I cấp hoặc hai cấp hoặc nhiều hơn tuỳ theo qui mô sản xuất Thành phần môi trường nhân giống như trên nhưng không có Agar gọi là môi trường dịch thể Môi trường được khử trùng ở 100°C trong 30 phút Để nguội đến 30°C, cây giống theo tỉ lệ 10% Lắc hay sục khí trong thời
Trang 36a Hod chat - Acid acetic - Agar - Cao thit - Glucose - Saccharose - Sulphate amon - Pepton - Phosphate amon
tk Aôi trường: trong quá trình sản xuất thạch dừa, nhà sản xuất thường sừ dụng 3 môi trường: môi trường sản xuất, môi trường giữ giống và môi trường nhân giống
> Môi trường sản xuất: thường là môi trường lỏng, gôm có môi trường nude | dừa già, môi trường nước cốt dừa, môi trường hỗn hợp và môi trường cao thit
e M6i trudng nước dita gia: | — Nước dửa già:10 lit
— (NH¿);SO¿: 20g — (NH¿);HPO,:20g
- Saccharose 700g
- pH: 3-3.5(chinh bang acid acetic 40%), mdi truéng dugce thanh tring |
bằng cách đun sôi nhẹ trong thời gian 15-20 phút)
e© Mơi trường nước cốt dừa:
~_ Dừa nạo : 250g vắt thành 10 lit nước cốt
- (NH¿;§SO,:20g |
—_ (NH¿);HPO,:20g ~ Saccharose 700g
- pH: 3-3.5(chinh bang acid acetic 40%), môi trường được thanh trùng bằng cách đun sôi nhẹ trong thời gian 15-20 phú) | e Môi trường hỗn hợp:
Trang 37~ Nuc cét dita: 0.4 lit
- (NH4)2HPO,:20g
- Saccharose 700g
— pH: 3-3.5(chinh bang acid acetic 40%), mdi trường được thanh trùng - | bang cách đun sôi nhẹ trong thời gian 15-20 phút) | | ® Mơi trường cao thịt- pepton
- Cao thit: 10g !
~ Pepton: 10g - |
- Glucose: 70g
—_ Nước: 1 lit
_— pH: 3-3.5(chỉnh bằng acid acetic 40%), môi trường được thanh trùng _
bằng cách đun sôi nhẹ trong thời gian 15-20 phút) "
> Môi trường giữ giống: thường là môi trường thạch pepton- cao thịt
Môi trường cao thịt được bổ sung 2% agar, nấu cho tan hoàn toàn, sau đó phân phối vào các ống nghiệm, thanh trùng ở 121°C trong thời gian 20 phút _ rồi chỉnh pH 3-3.5 bằng acid acetic nồng độ 40% lúc môi trường chưa kịp
đặc, sau đó để nguội cho môi trường đặt lại Môi trường đặc này dùng để phân |
lập và giữ giống
>_ Môi trường nhân giống: thường là môi trường nước dừa già có bổ sung muối
dinh dưỡng
d Thuyết mỉnh quy trình công nghệ : Bước 1:Chudn bị môi trường:
s* Nước dừa già được thu nhận ở các nhà máy sản xuất cơm dừa nạo sấy
Thành phần gồm: đường, protein, dầu béo, khống ,vitamin hồ tan và
một số tạp chất khác | |
ro Ding vải lọc dé loại bỏ tạp chất Vải lọc được cố định trên rổ lọc.Dịch nước dừa sau khi lọc được thu vào thùng chứa Cặn trên vải lọc được tách ra
ngoai " "
Trang 38
s* Môi trường sau khi bổ sung dinh dưỡng được thanh trùng bằng cách đun sôi khoảng 10- 15' để tiêu diệt các vi sinh vật có trong môi trường Sau đó
làm nguội ˆ
“* Dung acid acetic 40% chinh về pH = 3 - 3,5, chỉnh nhiệt độ đến 28-31°C
(pH, nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men) Bước 2: Lên men
Đỗ môi trường vào các dụng cụ, cấy giống theo tỷ lệ 1:10 Đậy thau, chậu
bằng vải mỏng hoặc giấy báo Giữ nhiệt độ phòng ở 28-31°C trong vòng 48
| giờ Trong thời gian này tránh khuấy động môi trường đề tránh ảnh hưởng đến lớp thạch đang hình thành
Bước 3: Thu nhận và hoàn thiện sản phẩm
* Dùng vợt đề vớt khối cellulose ra khỏi dịch lên men Sau đó rửa khối
cellulose bằng nước lạnh
* Dùng máy cắt để cắt khối cellulose tạo các miếng nhỏ, đều đặn |
# Ngâm sản phẩm trong dung djch Na,CO; 3-5% trong 10° dé trung hoa acid
acetic còn sót bên trong thạch Sau đó xá lại bằng: nước lạnh ® ÐĐun sơi để làm trong sản phẩm và tao độ dai bằng cách bổ sung chất tạo
đai
* Ngâm đường tạo đô ngọt và tăng độ trong cho sản phẩm
Trang 39
TAI LIEU THAM KHAO
Coeuret V., Dubernet S., Bernardeau M., Gueguen M., Vernoux J P., 2003 Isolation,
characterisation and identification of lactobacilli focusing mainly on cheeses and
other dairy products Lait, Vol 83, p 269 — 306
Erdourul O., Erbulur F., 2006 Isolation and Characterization of Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus casei from Various Foods Turk J Biol, Vol 30, pp
39 —44 |
Lu Z., Breidt F., Fleming H P:, Alterman E., Klaenhammer T R., 2003 Isolation and
characterization of a Lactobacillus plantarum bacteriophage, AJL-1, from a cucumber fermentation International Journal of Food Microbiology, Vol 84, ‘p
225 ~ 235 | cóc
Ndip R N., Akoachere J F K T., Dopgima L L., Ndip L M., 2001 Characterization
of Yeast Strain of Wine Production Applied Biochemistry and’ Biotechnology,
‘Vol 95 | | | |
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 2000 Vi sinh vat hoc NXB
Giáo dục, 519 trang, |
Nwachuwu I R., Ibekwe V I, Nwabuaze R N., Anyanwu B N,., 2006 Characterisation of palm wine yeast isolate for industrial utilisation African Journal of Biotechnology, vol 5 (19), pp 1725 — 1728
Trần Thị Ánh Nguyệt, 2006 Bước đầu nghiên cứu khả năng nhân sinh khối của hạt
kefir và ứng dụng hạt kefir trong chế biến kefir sữa dừa Luận văn tốt nghiệp, 59 | , trang
_ Vuong Thi Việt Hoa, 2002 Giáo trình thực tập Vi sinh thực phẩm Tủ sách Đại học Nong Lam, trang 1 — 16