ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc

Trong chọn tạo giống cây trồng việc gây đột biến thực nghiệm để đa dạng hoá nền di truyền của các vật liệu khởi đầu đã được coi là một trong những kỹ thuật có tính ứng dụng cao.. Hơn nữa

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020

-

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI:

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ĐỘT BIẾN IN VITRO TRONG CHỌN TẠO GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG,

MỤC LỤC

Mục lục i

Danh mục các ký hiệu viết tắt iv

Danh mục bảng vi

Danh mục hình xii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng 3

1.1 Nguồn gốc, phân loại 3

1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng 3

1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng 4

1.4 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước 5

II Giới thiệu chung về cây hoa cúc 7

2.1 Nguồn gốc và phân loại cây hoa cúc 7

2.2 Giá trị của cây hoa cúc 9

2.3 Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới và Việt Nam 10

III.Ứng dụng của đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc 12 3.1 Khái niệm về đột biến 12

3.2 Các tác nhân gây đột biến 12

3.3 Ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc 16

3.5 Ứng dụng các phương pháp chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây hoa cẩm chướng, hoa cúc 22

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.2 Nội dung nghiên cứu 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 31

2.3.2 Các phương pháp xử lý đột biến in vitro 32

2.3.3 Các phương pháp chọn lọc cá thể đột biến sau xử lý 33

2.3.4 Phương pháp khảo nghiệm dòng đột biến 37

2.3.6 Phương pháp phân tích số liệu 39

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

1 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY CẨM CHƯỚNG 40

1.1 Thu thập và lựa chọn mẫu giống nghiên cứu 40

1.2 Nghiên cứu nuôi cấy, tái sinh in vitro cây cẩm chướng 42

1.3 Nghiên cứu tạo cây cẩm chướng gấm đa bội bằng xử lý colchicine in vitro 54

1.4 Nghiên cứu tạo đột biến bằng xử lý EMS (Ethyl methanesulfonate) in vitro cho cây cẩm chướng 71

1.5 Nghiên cứu tạo cây cẩm chướng đột biến bằng xử lý chiếu xạ in vitro 96

1.5.1 .Nghiên cứu xử lý chiếu xạ tia gamma, tái sinh và nhân nhanh mẫu sau xử lý chiếu xạ in vitro 97

1.5.2 Chọn lọc các dạng đột biến 101

1.5.3 Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột biến đã chọn lọc sau xử lý in vitro 107

1.5.4 Đánh giá sự ổn định di truyền của các dòng cẩm chướng đột biến đã được chọn lọc 109

1.6 Nghiên cứu chọn tạo giống cẩm chướng đột biến bằng xử lý EMS kết hợp với tia gamma in vitro 114

1.6.1 Nghiên cứu xử lý đột biến, tái sinh và nhân nhanh mẫu sau xử lý kết hợp tia gamma và EMS 114

1.6.2 Chọn lọc các dạng đột biến 119

1.7 .Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng cẩm chướng sau xử lý đột biến in vitro bằng chỉ thị phân tử SSR 122

1.7.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 122

1.7.2 Đánh giá sự khác biệt di truyền các dòng cẩm chướng đột biến với giống gốc bằng chỉ thị SSR 122

2 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY CÚC 129

2.1 Thu thập và lựa chọn mẫu giống cúc 129

2.2 Xây dựng hệ thống tái sinh thích hợp cho các giống hoa cúc 131

2.2.1 Kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu 131

2.2.2 Kết quả tạo callus 132

2.2.3 Kết quả nghiên cứu tái sinh cây từ callus 134

2.2.4 Kết quả nhân nhanh đối với chồi hoa cúc 136

2.2.5 Kết quả nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 138

2.3 Nghiên cứu xử lý đột biến bằng chiếu xạ tia gamma, tái sinh và chọn lọc cây hoa cúc đột biến sau chiếu xạ gamma 140

2.3.1 Kết quả xử lý đột biến bằng tia gamma 140

2.3.2 Kết quả ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma đến khả năng tái sinh của callus 141

2.3.3 Chọn lọc cây hoa cúc đột biến sau chiếu xạ gamma 143

2.4 Nghiên cứu xử lý đột biến bằng chiếu xạ tia X, tái sinh và chọn lọc cây hoa cúc đột biến sau chiếu xạ X 146

2.4.1 Kết quả xử lý đột biến bằng chiếu xạ tia X 146

2.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ tia X đến khả năng tái sinh của callus 147

2.4.3 Chọn lọc cây hoa cúc đột biến sau chiếu xạ X 148

2.5 Trồng và đánh giá các dòng cúc đột biến qua các thế hệ 150

2.5.1 Kết quả đánh giá đặc tính nông sinh học của các dòng cúc đột biến ở thế hệ M1V12 150

2.5.2 Kết quả đánh giá về sâu bệnh của các dòng cúc đột biến 155

2.5.3 Kết quả đánh giá về năng suất hoa của các dòng cúc đột biến 156

2.5.4 Đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các dòng cúc đột biến bằng chỉ thị RAPD 161

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 166

4.1 Kết luậnchung: 166

4.1.1 Về khối lượng công việc và mục tiêu của đề tài 166

4.1.2 Về các nội dung khoa học của đề tài 166

4.2 Đề nghị: 168

TÀI LIỆU THAM KHẢO 169

15 EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic acid

16 EMS Ethylmethane sulphonate

17 EtBr Ethidium Bromide

19 HPLC High-performance liquid chromatography

20 HSN Hệ số nhân

21 IAA 3- Indoleaxetic axit

22 IBA 3-Indolebutyric axit

28 mRNA Messenger Ribonucleic acid

29 MS Murashige and Skoog

30 M1V12 Mutant 1- Vegetative 12

37 SDS Sodium Dodecyl Sulphate

38 SSR Simple sequence repeats

39 TBE Tris – boric acid – EDTA

40 TE Tris – EDTA

41 THT Than hoạt tính

42 TL Tỷ lệ

43 TB Trung bình

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Các giống gốc và các dòng đột biến sử dụng trong phân tích

khác biệt di truyền bằng chỉ thị phân tử 27

Bảng 2.2: Các mồi RAPD sử dụng trong phân tích 29

Bảng 2.3: Các mồi SSR sử dụng trong phân tích 30

Bảng 3.1 Một số đặc điểm của các giống cẩm chướng thu thập 40

Bảng 3.2a: Ảnh hưởng của xử lý đơn chất HgCl2 0,1% đến khả năng sống và vô trùng của mẫu cấy (sau 4 tuần nuôi cấy) 43

Bảng 3.2b: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp HgCl2 0,1% và Javen (4%) đến khả năng sống và vô trùng của mẫu cấy (sau 4 tuần nuôi cấy) 43

Bảng 3.3a: Ảnh hưởng của BA tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Trắng viền tím (sau 4 tuần theo dõi) 44

Bảng 3.2b: Ảnh hưởng của BA tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Đỏ (sau 4 tuần theo dõi) 44

Bảng 3.4a: Ảnh hưởng của Kinetin tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Trắng viền tím (sau 4 tuần theo dõi) 46

Bảng 3.4b: Ảnh hưởng của Kinetin tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Đỏ (sau 4 tuần theo dõi) 46

Bảng 3.5a: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và Kinetin tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Trắng viền tím (sau 4 tuần theo dõi) 47

Bảng 3.5b: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và Kinetin tới khả năng tái sinh, sự sinh trưởng và hệ số nhân chồi giống Đỏ (sau 4 tuần theo dõi) 48

Bảng 3.6b Ảnh hưởng của α NAA và than hoạt tính trong môi trường MS tới khả năng ra rễ của chồi in vitro cây cẩm chướng giống Đỏ 49

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của thời gian xử lý HgCl2 1% tới tỷ lệ sống và vô trùng của giống cẩm chướng gấm (theo dõi sau 4 tuần) 51

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và Ki đến sự phát sinh hình thái của đoạn thân có chồi nách (theo dõi sau 4 tuần nuôi cấy) 52

Bảng 3.9: Nghiên cứu khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của cây cẩm chướng gấm (sau 3 tuần nuôi cấy) 53

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý cochicine in vitro

đến khả năng sống, tái sinh và nhân nhanh mẫu (sau 4 tuần xử lý) 55 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của xử lý colchicine đến sự biến dị của các chồi tái

sinh (sau 4 tuần xử lý) 55 Bảng 3.12: Sự sinh trưởng của các dạng chồi biến dị sau xử lý colchicine in vitro 56 Bảng 3.13: Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng cây sau xử lý colchicine

in vitro ngoài tự nhiên 58 Bảng 3.14: Tỷ lệ các dạng biến dị phân lập được 59 Bảng 3.15: Sự sinh trưởng của các dạng biến dị thu được sau xử lý

colchicine 60 Bảng 3.16: Một số chỉ tiêu đánh giá khả năng đa bội của các dạng cây 61 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của cytokinin đến sự sinh trưởng phát triển và hệ số

nhân in vitro của dòng cẩm chướng D7 và D9 (sau 4 tuần theo dõi) 63 Bảng 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến khả năng ra rễ in vitro của

dòng cẩm chướng D7 và D9 (sau 3 tuần theo dõi) 64 Bảng 3.19 Một số chỉ tiêu sinh trưởng sinh dưỡng của các dòng cẩm chướng

D7 và D9 (vụ Xuân Hè 2010 tạiViện Sinh học Nông nghiệp) 65 Bảng 3.20 Một số chỉ tiêu về năng suất và chất lượng hoa của hai dòng cẩm

chướng gấm đa bội (vụ Xuân Hè 2010 tại Viện Sinh học Nông nghiệp) 66 Bảng 3.21 Tỉ lệ sâu bệnh hại trên các dòng cẩm chướng 67 Bảng 3.22: Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống và tái sinh chồi in vitro

của giống Đỏ 71 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ và sự sinh trưởng của

chồi giống Đỏ xử lý 1h (sau 4 tuần theo dõi) 73 Bảng 3.24: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ và sự sinh trưởng của

chồi giống Đỏ xử lý 2h (sau 4 tuần theo dõi) 73 Bảng 3.25: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ và sự sinh trưởng của

chồi giống Đỏ xử lý 3h (sau 4 tuần theo dõi) 74 Bảng 3.26: Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống và tái sinh của chồi in

vitro giống Trắng viền tím 75 Bảng 3.28: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến sinh trưởng và phát triển của

các dạng chồi giống Trắng viền tím xử lý 2h (sau 4 tuần theo dõi) 77

Bảng 3.29: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến sinh trưởng và phát triển của

các dạng chồi giống Trắng viền tím xử lý 3h (sau 4 tuần theo dõi) 78 Bảng 3.30: Sự sinh trưởng, phát triển của các dòng cẩm chướng sau xử lý

EMS ở điều kiện tự nhiên 80 Bảng 3.31: Tỷ lệ biến dị của một số dòng cẩm chướng sau xử lý EMS 81 Bảng 3.32: Một số đặc điểm nông sinh học của các dạng đột biến và

giống gốc 83 Bảng 3.33: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng (BA và Ki) đến khả năng

nhân nhanh của các dòng cẩm chướng đột biến sau xử lý EMS in vitro 84 Bảng 3.34: Nghiên cứu khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của 2 giống

cẩm chướng MDC- 1 và MDC-2 (sau 3 tuần nuôi cấy) 85 Bảng 3.35: Đặc điểm nông sinh học của dòng cẩm chướng đột biến và

giống gốc trồng tại Đại học Nông nghiệp Hà Nội vụ Đông xuân (2009 – 2010) 86 Bảng 3.36: Đặc điểm nông sinh học của dòng cẩm chướng đột biến và

giống gốc trồng tại Đà Lạt GAP – Lâm Đồng vụ Hè thu 2010 87 Bảng 3.37: Đặc điểm nông sinh học của dòng cẩm chướng đột biến và

giống gốc trồng tại Sapa – Lào Cai vụ Hè thu 2010 87 Bảng 3.38: Tình hình sâu bệnh hại trên dòng cẩm chướng MDC-1 và MDC-2

(vụ Đông - Xuân 2009 - 2010, tại Đại học Nông nghiệp Hà Nội) 89 Bảng 3.39: Tình hình sâu bệnh hại trên dòng cẩm chướng MDC-1 và

MDC-2 (vụ Hè Thu 2010, tại Đà Lạt, Lâm Đồng) 89 Bảng 3.40: Tình hình bệnh hại trên dòng cẩm chướng MDC-1 và MDC-2

(vụ Hè Thu 2010, tại Sapa - Lào Cai) 90 Bảng 3.41 Thu nhập thuần của trồng hoa cẩm chướng tại Đà Lạt năm 2010

(tính trên một sàoBắc bộ/vụ) 92 Bảng 3.42 Diện tích trồng thử nghiệm cẩm chướng MDC-1 và MDC-2 tại

các địa phương 92 Bảng 3.43: Ảnh hưởng của tia gamma đếnkhả năng sống,tái sinh và nhân

nhanh của giống Trắng viền tím (sau xử lý 4 tuần) 97 Bảng 3.44: Ảnh hưởng của tia gamma đếnkhả năng sống,tái sinh và nhân

nhanh của giống Đỏ (sau xử lý 4 tuần) 97

Bảng 3.45: Đặc điểm các dạng chồi tái sinh của giống Đỏ thu được sau xử

lý chiếu xạ (sau 4 tuần) 100 Bảng 3.46: Đặc điểm các dạng chồi tái sinh của giống Trắng viền tím thu

được sau xử lý chiếu xạ (sau 4 tuần) 100 Bảng 3.47: Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các dòng cẩm chướng sau

xử lý tia gamma in vitro của giống Trắng viền tím 101 Bảng 3.48: Tỷ lệ các dạng biến dị ở các dòng cẩm chướng Trắng viền tím

sau xử lý tia gamma in vitro 102 Bảng 3.49 Một số đặc điểm nông sinh học của các dạng biến dị và giống gốc 104 Bảng 3.50 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các dòng cẩm chướng Đỏ

sau xử lý tia gamma in vitro 105 Bảng 3.51: Tỷ lệ biến dị của các dòng cẩm chướng Đỏ sau xử lý tia

gamma in vitro 106 Bảng 3.52: Ảnh hưởng của cytokinin đến sự sinh trưởng phát triển và hệ số nhân

của hai dòng cẩm chướng SP2 và SP4 in vitro (sau 4 tuần theo dõi) 107 Bảng 3.53: Khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng SP2 và SP4

(sau 3 tuần nuôi cấy) 108 Bảng 3.54: Đặc điểm nông sinh học của hai dòng cẩm chướng biến dị SP2,

SP4 và giống gốc tại một số địa điểm trồng khảo nghiệm 109 Bảng 3.55: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp tia gamma và EMS đến khả năng

sống, sự sinh trưởng in vitro giống Đỏ (sau 4 tuần) 114 Bảng 3.56: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp tia gamma và EMS đến khả năng

sống,sự sinh trưởng in vitro giống Trắng viền tím(sau 4 tuần) 114 Bảng 3.57: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp gamma và EMS đến sự phát sinh

biến dị và sinh trưởng của các chồi in vitro giống Đỏ (sau 4 tuần) 117 Bảng 3.58: Ảnh hưởng của xử lý kết hợp gamma và EMS đến sự phát sinh

biến dị và sinh trưởng của các chồi in vitro giống Trắng viền tím (sau 4 tuần) 118 Bảng 3.59.Đặc điểm của các dòng cẩm chướng Đỏ sau xử lý tia gamma kết

hợp EMS theo dõi trong vườn sản xuất 120 Bảng 3.60: Đặc điểm của các dòng cẩm chướng Trắng viền tím sau xử lý

tia gamma kết hợp EMS theo dõi trong vườn sản xuất 120

Bảng 3.61: Tỷ lệ biến dị của các dòng cẩm chướng Đỏ sau xử lý tia gamma

kết hợp EMS 121 Bảng 3.62: Tỷ lệ biến dị của các dòng cẩm chướng Trắng viền tím sau xử lý tia

gamma kết hợp EMS 121 Bảng 3.63: Hệ số PIC, số alen và tống số băng DNA trên từng cặp mồi 126 Bảng 3.64: Tỷ lệ khuyết số liệu(M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống

cẩm chướng gốc và các dòng đột biến 127 Bảng 3.65 Hệ số tương đồng di truyền của các dòng, giống cẩm chướng

nghiên cứu 128 Bảng 3.67: Kết quả khử trùng mẫu đối với giống cúc Vàng Pha lê 131 Bảng 3.68 Kết quả khử trùng mẫu của giống cúc Tím sau 1 tuần nuôi cấy 132 Bảng 3.69: Sự hình thành callus trên các môi trường khác nhau của giống

cúc vàng Pha lê sau 4 tuần nuôi cấy 133 Bảng 3.70 Sự hình thành callus trên các môi trường khác nhau của giống

cúc Tím sau 4 tuần nuôi cấy 133 Bảng 3.71 Kết quả tái sinh chồi của callus cây hoa cúc sau 6 tuần nuôi cấy 135 Bảng 3.72 Kết quả nhân nhanh chồi hoa cúc giống Pha lê (sau 4 tuần nuôi cấy) 137 Bảng 3.73: Kết quả tạo rễ của chồi hoa cúc giống Pha lê (sau 3 tuần) 138 Bảng 3.74: Ảnh hưởng của chiếu xạ đến khả năng sống của callus 141 Bảng 3.75: Ảnh hưởng của chiếu xạ đến khả năng tái sinh callus hoa cúc 142 Bảng 3.76: Các kiểu biến dị của hoa cúc sau khi được chiếu xạ tia gamma 144 Bảng 3.77 Ảnh hưởng của tia X đến khả năng sống của callus hoa cúc 146 Bảng 3.78 Ảnh hưởng của chiếu xạ tia X đến khả năng tái sinh của callus

hoa cúc 147 Bảng 3.79 Các kiểu biến dị của hai giống cúc sau khi xử lý chiếu xạ in

vitro bằng tia X 148 Bảng 3.80: Động thái tăng trưởng chiều cao cây của các dòng cúc (cm) ở

thế hệ M1V12, vào vụ xuân 2010 tại Tây Tựu, Hà Nội 151 Bảng 3.81.Thời gian sinh trưởng của các dòng cúc đột biến vào vụ xuân 2010 152 Bảng 3.82: Mét sè chØ tiªu vÒ chÊt l−îng hoa vụ xuân 2010 (Tây tựu, Hà

nội) 153 Bảng 3.83 Mức độ sâu hại của hoa cúc vụ xuân 2010 (Tây tựu, Hà nội) 155

Bảng 3.84 Năng suất và hiệu quả kinh tế của các giống hoa gốc và các

dòng hoa đột biến tại Tây Tựu, Từ Liêm, Hà Nội vụ xuân 2010 157 Bảng 3.85 Đặc tính nông học chính của dòng cúc VCM-2 158 Bảng 3.86: Đặc tính nông học chính của dòng cúc VCM-3 159 Bảng 3.87 Diện tích trồng thử nghiệm cúc VCM-2 và VCM-3 tại các địa

phương 161 Bảng 3.88 Kết quả thống kê số băng DNA xuất hiện ở các mồi RAPDs 162 Bảng 3.89 Hệ số tương đồng di truyền giữa 16 mẫu hoa cúc 164

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hoá [17] 15

Hình 3.1 Chồi in vitro giống Trắng viền tím được nuôi cây trong các môi trường tạo rễ khác nhau 50

Hình 3.2: Các dạng chồi sau xử lý colchicine in vitro giống Tím viền trắng 54

Hình 3.3: Dạng hoa đối chứng và đột biến 59

Hình 3.4: Dạng thân đối chứng và đột biến 59

Hình 3.5: Kích thước lá và hình dạng khí khổng của dạng cây đa bội và đối chứng 61

Hình 3.6: Xác định độ bội của giống đối chứng và dạng đột biến bằng máy Flow cytometry 62

Hình 3.7: Các dạng chồi biến dị sau xử lý EMS in vitro ở các nồng độ và thời gian khác nhau 72

Bảng 3.23: Ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ và sự sinh trưởng của chồi giống Đỏ xử lý 1h (sau 4 tuần theo dõi) 73

Hình 3.8: Các dạng chồi biến dị giống Trắng viền tím sau xử lý EMS in vitro ở các nồng độ và thời gian khác nhau 76

Hình 3.10: Một số biến dị về hoa 82

Hình 3.11: Các dạng chồi thu được sau xử lý chiếu xạ in vitro 99

Hình 3.12: Một số dạng biến dị thân, lá 103

Hình 3.13: Một số biến dị về hoa 104

Hình 3.14: Các dạng chồi thu được sau xử lý kết hợp tia gamma và EMS 116

Hình3.15: Nồng độ và chất lượng DNA của 16 dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu 122

Hình 3.16 Kết quả điện di các cặp mồi nhóm DCB 123

Hình 3.17 Kết quả điện di nhóm mồi CB và CF 124

Hình 3.18: Sơ đồ về quan hệ di truyền của một số dòng, giống cẩm chướng

nghiên cứu 129

Hình 3.19: Các callus hình thành từ nụ hoa 134

Hình 3.19: Cây hoa cúc tái sinh từ callus 136

Hình 3.20: Kết quả nhân nhanh chồi hoa cúcPha lê 138

Hình 3.21: Cây hoa cúc Pha lê trên môi trường tạo rễ 139

Hình 3.22 Cúc vàng Pha lê và các dạng đột biến sau khi xử lý đột biến tia gamma 145

Hình 3.23 Cúc Tím và các dạng đột biến sau khi xử lý đột biến tia gamma 145

Hình 3.24 Các dạng đột biến của giống cúc Vàng Pha lê và cúc Tím sau khi chiếu xạ tia X 149

Hình 3.25 Giống cúc VCM-2 và VCM-3 ngoài đồng ruộng 158

Hình 3.26 Giống cúc Vàng Pha lê gốc và dòng cúc VCM-2 159

Hình 3.27 Giống cúc Tím gốc và dòng cúc VCM-3 160

Hình 3.28 Kết quả điện di PCR-RAPD mồi OPA18 và mồi OPC10 163

Hình 3.29 Kết quả điện di PCR-RAPD mồi BIO12 và mồi OPM 163

Hình 3.30 Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các giống cúc 165

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cuộc sống càng phát triển nhu cầu về hoa ngày càng tăng nên ngành sản xuất và kinh doanh hoa ngày càng được coi trọng Theo báo cáo năm 2005 của FAO, giá trị sản lượng hoa cây cảnh của toàn thế giới năm 1995 đạt 35 tỷ USD, đến năm 2004 tăng lên 56 tỷ USD (tốc độ tăng bình quân năm là 20%); trong đó giá trị xuất khẩu đạt từ 8,5-10 tỷ USD/năm

Việt Nam là một nước nông nghiệp có nghề trồng hoa lâu đời, nhưng nó chỉ được coi là một ngành kinh tế và có giá trị hàng hoá từ những năm 1980 Theo số liệu thống kê đến nay, diện tích trồng hoa và cây cảnh ở nước ta đạt 13.400 ha, trong đó có khoảng hơn 4000 ha cây hoa Tuy nhiên, các giống hoa, cây cảnh trồng tại Việt Nam, chủ yếu là được nhập về từ nước ngoài bằng nhiều con đường khác nhau Điều này sẽ có ảnh hưởng lớn khi chúng ta không chỉ sản xuất nội tiêu mà còn xuất khẩu sang nhiều nước khác và đặc biệt là khi nước ta

đã là thành viên của Tổ chức Quốc tế về bảo vệ các giống cây trồng mới (UPOV) Do vậy việc tạo ra những giống hoa, cây cảnh có bản quyền Việt nam

là yêu cầu của thực tiễn sản xuất

Trong chọn tạo giống cây trồng việc gây đột biến thực nghiệm để đa dạng hoá nền di truyền của các vật liệu khởi đầu đã được coi là một trong những kỹ thuật có tính ứng dụng cao Hơn nữa, cùng với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật, công nghệ xử lý đột biến in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu trong tạo giống cây trồng bởi nó cho phép rút ngắn thời gian và giảm bớt chi phí trong chọn tạo giống cây trồng mới Công nghệ xử lý đột biến in vitro đặc biệt hiệu quả trong tạo các giống hoa mới Cho đến nay đã có 187 giống hoa cúc, 34 giống hoa thược dược, 27 giống hoa hồng, 8 giống hoa phượng tiên, 25 giống hoa thu hải đường, 18 giống hoa cẩm chướng được tạo bằng con đường đột biến, chủ yếu xử lý in vitro chồi mầm, callus, hạt phấn, bao phấn, phôi soma…(B.S Ahloowalia, M Maluszynski, 2001) Trong khi đó, ở nước ta việc xử lý đột biến

in vitro để tạo giống cây trồng hầu như chưa được quan tâm đúng mức Trên đối tương cây hoa cũng mới chỉ có một vài công bố về xử lý đột biến in vitro nhưng chưa đi đến kết quả cuối cùng là tạo ra giống hoa mới [6], [9], [13]

Trong các loại hoa được sản xuất hàng hoá, hoa cẩm chướng (Dianthus

spp) và hoa cúc (Chrysanthem ssp) là các loài hoa đẹp, đa dạng về mầu sắc, bền,

thuận lợi cho bảo quản và vận chuyển đi tiêu thụ Đây là những loại hoa cắt có giá trị nhất trên thị trường hoa tươi thế giới và Việt nam Hoa cẩm chướng, hoa cúc và hoa hồng chiếm tới 50% thị phần của thị trường hoa cắt Ở nước ta dù diện tích trồng hoa và kim ngạch xuất khẩu hoa chưa lớn, nhưng hoa cúc và cẩm chướng luôn đứng đầu danh mục các loại hoa xuất khẩu của Việt nam (http//:www.rauhoaqua.vn) Vì vậy, việc chọn tạo giống mới của hoa cẩm chướng và hoa cúc luôn được đặc biệt quan tâm nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường và mang lại lợi nhuận cao cho người sản xuất

Trong bối cảnh nêu trên, được sự đồng ý của chương trình Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, chúng tôi tiến

hành đề tài “Ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng

1.1 Nguồn gốc, phân loại

Cẩm chướng hay còn gọi là hoa Phăng có tên tiếng Anh: Carnation, tên

khoa học: Dianthus caryophyllus L, thuộc chi: Dianthus, họ: Caryophyllaceae, bộ: Sentrospenmea [8]

Cẩm chướng có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, bắt đầu được nuôi trồng để thưởng ngoạn từ thế kỷ XVI Lần đầu tiên vào năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm Năm 1846, họ đã trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại

và điều khiển cho chúng ra hoa quanh năm

Ở Việt Nam hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào trồng từ đầu thế

kỷ XIX, chủ yếu trồng ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, SaPa Những năm gần đây, cẩm chướng đã được trồng ở nhiều vùng trong cả nước [5]

1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng

- Rễ: Cẩm chướng có bộ rễ chùm, có rất nhiều nhánh phát triển mạnh để

hút nước, dinh dưỡng Chiều dài của rễ 15 - 20 cm, phân bố tập trung ở tầng đất mặt 20 cm, một số ít có khả năng ăn sâu tới 40 - 45 cm Ở trạng thái bình thường

rễ và tán cây theo tỷ lệ tương đương Nếu đất quá nhiều phân, nhiều nước rễ sẽ sinh trưởng không tốt Nhiệt độ đất cao cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của rễ

- Thân: Thân thảo, thân thẳng đứng, phân nhánh nhiều, chiều cao cây

khoảng 30 - 100 cm (tùy theo giống) và nửa hóa gỗ Thân rất dễ gẫy ở đốt Các đốt cẩm chướng thường gẫy khúc Thân thường có mầu xanh nhạt, bao phủ một lớp phấn trắng xung quanh Phấn có tác dụng chống thoát hơi nước và bảo vệ cây khỏi sâu bệnh

- Lá: Lá kép mọc từ các đốt thân, lá mọc đối Phiến lá dày hình lưỡi mác,

mép lá trơn Mặt lá nhẵn không có độ bóng Trên mặt lá có phủ một lớp phấn trắng, mỏng và mịn có tác dụng làm giảm sự thoát hơi nước Tốc độ sinh trưởng của lá phụ thuộc vào thời tiết: mùa xuân, mùa hè thường 4 - 5 ngày, mùa thu, mùa đông từ 7 - 10 ngày ra một đôi lá

- Hoa: Có hai dạng hoa chính: hoa chùm và hoa đơn Về cánh hoa có thể

xếp làm hai loại: hoa đơn hoa kép Hoa đơn mọc từng chiếc một, hoa chùm có nhiều hoa trên một cành Hoa nằm trên đầu cành và có nhiều mầu sắc khác nhau Ngay cả trên một hoa cũng có thể có 2 - 3 mầu khác nhau Hoa đẹp, có mùi thơm thoang thoảng Nụ hoa có đường kính 2 - 2,5 cm Khi hoa nở hoàn toàn có đường kính 6 – 7 cm Chiều cao bông hoa (tính từ đốt trên cùng của cành) khoảng 4 - 7,5 cm

- Hạt: Hạt cẩm chướng nhỏ, nằm trong quả Mỗi quả thường có từ 300 -

600 hạt

1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng

- Ánh sáng: Cẩm chướng là cây ưa sáng và thích hợp với thời gian chiếu

sáng ngày dài Thời gian chiếu sáng trong ngày càng dài, cây càng nhanh phân hóa hoa, hoa nở đều, chất lượng hoa tốt Lượng chất khô và tốc độ sinh trưởng của cây tương quan thuận với cường độ ánh sáng Cường độ ánh sáng thích hợp

là 1500 – 3000 lux, tối thích: 2000 – 2500 lux

Trong quá trình phát triển, nếu cường độ ánh sáng cao (> 3000 lux) cây sẽ

ra hoa sớm, nếu cường độ ánh sáng thấp (< 1000 lux) quá trình ra hoa sẽ muộn

Ở thời kỳ ra hoa rộ vào mùa nóng, lúc giữa trưa, cường độ ánh sáng mạnh, cần che bớt ánh sáng cho cây vì ánh sáng quá mạnh sẽ làm cho cánh hoa dễ bị nhạt mầu và cháy, ảnh hưởng đến chất lượng hoa

- Nhiệt độ: Cẩm chướng là cây ôn đới nên thích hợp với khí hậu mát mẻ Nhiệt độ thích hợp cho cây từ 15 - 200C, nhiệt độ tối ưu là 19 - 210C Trong khoảng nhiệt độ từ 10 - 150C cây vẫn sinh trưởng bình thường và cho chất lượng

hoa tương đối tốt Nếu nhiệt độ vượt quá 300C hoặc dưới 100C thì cây sinh trưởng kém, thân lá, hoa nhỏ, sản lượng và chất lượng hoa giảm, tuổi thọ ngắn Chênh lệch nhiệt độ ngày, đêm có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng hoa Nhìn chung chênh lệch nhiệt nhiệt độ ngày đêm khoảng 100C là tốt nhất, mức chênh lệch nhiệt độ ngày, đêm quá cao hoặc quá thấp sẽ làm chất lượng hoa kém, số hoa mù cao

- Nước: Hàm lượng nước trong lá cẩm chướng chiếm khoảng 70 - 80%, trong cành 68 - 70%, trong rễ 80% Nước có vai trò vô cùng quan trọng đối với cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói riêng Ẩm độ thích hợp 60 - 70%, ẩm độ tối thích 70% Nếu độ ẩm ổn định sẽ tạo điều kiện cho cây hút chất dinh dưỡng và muôi khoáng một cách thuận lợi, cây sinh trưởng tốt, năng suất

1.4 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước

1.4.1 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới

Trên thế giới, cẩm chướng là hoa cắt cành được trồng phổ biến tại châu

Âu, châu Á, châu Mỹ

Cẩm chướng cũng là loại hoa phát triển mạnh ở Kenya Diện tích trồng hoa cẩm chướng của Kenya chủ yếu tập trung ở Ritf Valley Cây cẩm chướng cảnh được trồng ngoài đồng không bảo vệ ở độ cao khoảng 1800 m và cẩm chướng thường được trồng trong nhà plastic ở độ cao 2700 m so với mực nước biển [23]

Ở châu Á, hoa cẩm chướng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Malaysia, Srilanka,… Ở Trung Quốc, hoa cẩm chướng cùng hoa hồng là hai loại hoa phổ

biến nhất Cẩm chướng chiếm khoảng 25% tổng lượng hoa trên thị trường tại Bắc Kinh và Côn Minh Trung tâm sản xuất hoa cẩm chướng tập trung ở Côn Minh và Thượng Hải Hầu hết các giống của Trung Quốc được nhập từ Israel,

Hà Lan và Đức [49] Tỉnh Vân Nam của Trung Quốc có kim ngạch xuất khẩu hoa cắt cành ngày càng cao, theo thống kê tháng 11 năm 2006 đạt 10,4 triệu USD với sản lượng 4,3 nghìn tấn, trong đó cẩm chướng là một trong 3 loại hoa xuất khẩu chủ lực [67]

Tại Malaysia, sản lượng hoa cẩm chướng đứng thứ ba sau cây hoa hồng

và hoa cúc, chiếm 9,02% tổng sản lượng hoa Ở đây, hoa cẩm chướng được trồng bao gồm cả loại hoa chùm và hoa đơn [11]

Ở Philippin, cây cẩm chướng trồng được rất ít và phải nhập khẩu từ các nước khác Tỷ lệ nhập khẩu hoa cẩm chướng đứng thứ hai trong tổng giá trị nhập khẩu hoa với 22,05% chỉ đứng sau hoa cúc (36,98%) Năm 1996, lượng hoa cẩm chướng nhập khẩu của Philippin từ Hà Lan là 7691 kg (khoảng 620000 cành), từ Malaysia 5097 kg (khoảng 260000 cành), từ Australia 638kg (khoảng

32000 cành) và New Zealand 80 kg (khoảng 4000 cành) [46]

Tại Srilanka, hoa cẩm chướng là cây hoa ôn đới quan trọng nhất Hoa cẩm chướng được trồng chủ yếu để xuất khẩu, còn các loại hoa khác chỉ tiêu thụ được ở nội địa Hai giống cẩm chướng châu Mỹ và cẩm chướng Địa Trung Hải của Srilanka rất nổi tiếng trên thị trường thế giới Một phần diện tích cẩm chướng khá lớn được trồng trong môi trường bảo vệ hoàn toàn [25]

Ixraen có 150 ha hoa cẩm chướng chiếm 7,5% tổng diện tích trồng hoa, mỗi năm nước này xuất khẩu đạt 119 triệu USD [5]

1.4.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam

Ở Việt Nam, hoa cẩm chướng được trồng rộng rãi ở Hà Nội, Hải Phòng,

Đà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh Các vùng chuyên hoa như An Hải (Hải Phòng), Tây Tựu - Từ Liêm, Phú Thượng - Tây Hồ (Hà Nội) trồng nhiều hoa cẩm chướng Trước đây, vào mùa hè, hoa cẩm chướng trên thị trường nước ta chủ yếu phải nhập từ Côn Minh (Trung Quốc) và Hà Lan, vài năm gần đây, để đáp

Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, trong 8 tháng đầu năm

2009 có 17 thị trường nhập khẩu hoa tươi và khô của Việt Nam, tăng 6 thị trường so với cùng kỳ 2008 Trong đó, Nhật Bản vẫn là thị trường nhập khẩu hoa lớn nhất của Việt Nam với kim ngạch đạt 6,2 triệu USD, tăng 50,6% so với cùng kỳ 2008 Kim ngạch xuất khẩu sang thị trường này chiếm tới 84% tổng kim ngạch xuất khẩu hoa các loại Sản phẩm hoa xuất khẩu chủ yếu là hoa cúc, hoa cẩm chướng Trong đó sản lượng hoa cẩm chướng đứng thứ 2 sau hoa cúc, với đơn giá xuất khẩu trung bình 0,19 USD/cành Cùng với hoa cúc và hoa hồng, cẩm chướng là một trong 3 chủng loại hoa xuất khẩu chính vào Nhật Bản

- thị trường xuất khẩu hoa lớn nhất của nước ta [67]

Như vậy có thể thấy cẩm chướng là một loại hoa có tiềm năng phát triển rất lớn, và có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phát triển ngành sản xuất hoa của nước ta nói riêng và thế giới nói chung

II Giới thiệu chung về cây hoa cúc

2.1 Nguồn gốc và phân loại cây hoa cúc

Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum do nhà thực vật học người

Thụy Điển Carl Linné đặt tên vào năm 1793 Chrysanthemum bắt nguồn từ tiếng

Hy Lạp: Chrysos có nghĩa là vàng (gold) và Anthemon có nghĩa là bông hoa

Theo hệ thống phân loại thực vật cây hoa cúc thuộc lớp hai lá mầm

(Dicotyledoneae), phân lớp Hoa cúc (Asterydae), bộ cúc (Asterales), họ cúc (Asteraceae), phân họ hoa cúc (Asteroidae) và chi hoa cúc (Chrysanthemum) [3]

Theo nghiên cứu của Langton (1989) cho biết trên thế giới có hơn 7000 giống cúc đã được đưa vào sử dụng với chủng loại và màu sắc đa dạng [29]

Qua hai cuộc hội thảo quốc tế về họ Asteraceae năm 1994 đã có sự thống

nhất tương đối về hệ thống học của họ này Họ cúc trên thế giới được xếp trong

2 phân họ, 13 tông (K Bremer., 1994) Ở Việt Nam có 2 phân họ và 12 tông nhưng hiện tại chia làm 17 tông Họ cúc có khoảng 1550 chi với 23.000 loài (Takhtajan., 1997)

Theo Soreng và cs (1991) thì hoa cúc có rất nhiều giống nhưng cho đến nay việc phân loại vẫn chưa được thống nhất, còn theo Nguyễn Quang Thạch và Đặng Văn Đông (2002) đã dựa vào các cách sau để phân loại hoa cúc ở Việt Nam Dựa vào hình dạng hoa để phân biệt cúc đơn hay cúc kép [14]:

Cúc đơn: Thường là dạng hoa nhỏ đường kính hoa từ 2-5 cm, chỉ có 1-3 hàng cánh ở vòng ngoài cùng còn vòng trong là cánh hoa rất nhỏ thường được gọi là cồi hoa

Cúc kép: Hoa có đường kính từ 5-15 cm, có nhiều cánh xếp từng vòng sít nhau, có loại cánh dài cong, có loại cánh ngắn

Dựa vào hình thức nhân giống: Dựa vào hình thức nhân giống vô tính như giâm cành, tỉa chồi hoặc nhân giống bằng phương pháp hữu tính như gieo hạt

Dựa vào thời vụ trồng: dựa vào đặc tính chịu nhiệt của hoa cúc để phân loại và thường phân ra làm hai loại đó là cúc đông và cúc hè Cúc đông là là cây

có nguồn gốc ôn đới, có tính chịu lạnh và trồng chủ yếu vào mùa đông Cúc hè

là một số giống chịu nhiệt độ cao trồng được vào mùa hè

Để dễ dàng với người sản xuất và tiêu dùng các giống cúc ở Việt Nam chủ yếu phân thành hai loại cúc đơn (1 bông/ cành) và cúc chùm (nhiều bông/ cành)

Cây hoa cúc thuộc dạng thân thảo, nhỏ, có nhiều đốt, giòn, có khả năng phân cành mạnh, cây dạng đứng hoặc dạng bò Kích thước cây thân cao hay thấp, đốt dài hay ngắn còn tuỳ thuộc vào giống Cây có thể cao từ 30- 80 cm thậm chí có thể cao đến 2m Rễ của cây hoa cúc thuộc loại rễ chùm, rễ ít ăn sâu

mà phát triển theo chiều ngang Lá của hoa cúc có dạng xẻ thuỳ, có răng cưa, lá đơn mọc so le nhau, mặt dưới lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn và có gân hình mạng lưới Phiến lá to hay nhỏ, dày, mỏng, xanh đậm hay nhạt, là tuỳ thuộc vào từng giống khác nhau Hoa cúc thuộc loại hoa lưỡng tính hoặc đơn tính có nhiều màu sắc khác nhau, đường kính hoa khoảng từ 1,5- 25 cm Hình

dạng cánh hoa ngắn hay dài, cong hay thẳng, hoa đơn hay kép là do các giống Hoa cúc có 4 đến 5 nhị đực dính vào nhau bao quanh vòi nhụy mảnh hình chỉ chẻ đôi Khi hạt phấn chín bay ra nhưng nhụy vẫn còn non chưa có khả năng tiếp nhận hạt phấn vì thế hoa cúc tuy là hoa lưỡng tính nhưng thường tự bất hoà hợp nghĩa là không thể tự thụ phấn trên cùng một hoa, nếu muốn lấy hạt phải thụ phấn nhân tạo Do đó trong việc sản xuất giống cây con chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp nhân giống vô tính Quả của cây hoa cúc là quả bế khô, hình trụ, hơi dẹt, chỉ chứa một hạt Hạt cúc chỉ có một phôi thẳng và không có nội nhũ [56] Các giống cúc thông thường có bộ nhiễm sắc thể là phức hợp lục bội với số lượng các nhiễm sắc thể trung bình là 54

2.2 Giá trị của cây hoa cúc

Hoa cúc là một trong những loài hoa cắt cành phổ biến nhất và được thương mại hoá nhiều thứ hai trên thị trường hoa thế giới chỉ sau hoa hồng [42] Hoa cúc là một loại hoa đa dạng về màu sắc, hình dáng và kích thước Ngoài những ưu điểm về màu sắc và hình dạng cây hoa cúc còn có một đặc điểm nữa là dễ trồng, hoa lâu tàn

vì vậy hoa cúc rất được ưa chuộng Hoa cúc được sử dụng ở cả hai dạng hoa cắt cành và hoa chậu

Hiện nay hoa cúc rất được phổ biến tại Mỹ và được xem như là “Nữ Hoàng” của các loài hoa mùa thu, người ta thường tặng hoa cúc cho nhau trong những cuộc thăm viếng

Đối với người Nhật Bản hoa cúc tượng trưng cho ngôi vua, vương miện và dấu ấn của vua có mang hình hoa cúc Ngoài ra người Nhật còn có ngày hoa cúc quốc gia hay còn gọi là ngày lễ Hạnh phúc (Festival of Happiness)

Ở Trung Quốc hoa cúc cũng có một vai trò quan trọng, điển hình là các hình ảnh về hoa cúc có rất nhiều trong các bức tranh tứ quý hoặc trên các bình, chậu gốm sứ có từ thời xưa Giống cúc Chu- Hsien đã được đặt tên cho một thành phố

Hoa cúc không chỉ có giá trị về trang trí, làm đẹp cho cuộc sống mà nó còn

có giá trị trong y dược Ở Trung Quốc một loại cúc nổi tiếng có tên gọi là

Hangbai với hoa nhỏ như đồng xu, màu trắng ngà được sử dụng như một dược phẩm và theo ngành y học cổ truyền thì tắm với nước hoa cúc Hangbai sẽ chữa được bệnh dị ứng da, uống trà hoa cúc thường xuyên làm giảm bệnh nhức đầu và làm mắt sáng hơn Y học hiện đại đã phân tích và xác định trong lá và hoa cúc Hangbai có trên 20 hoạt chất khác nhau có thể chữa trị các bệnh gây ra bởi siêu vi

khuẩn, huyết áp cao và các bệnh về mắt Giống hoa cúc Chrysanthemum

grandiflorum (Ramat) được sử dụng để sản xuất một loại trà thảo dược và cũng

được sử dụng để tạo ra các loại thuốc trừ sâu thân thiện với môi trường Tinh dầu

và các hoạt chất có hoạt tính chiết xuất từ các loài hoa cúc được cho là có tính kháng khuẩn và có thể là chất chống virus HIV [44] Một số giống cúc còn được

sử dụng làm thực phẩm

Ở Việt Nam hoa cúc cũng được trồng từ lâu đời và rất được coi trọng Hoa cúc xuất hiện ở khắp các nơi như vườn hoa, công viên, trong phòng khách, bàn làm việc, trong các cuộc thăm viếng Không những thế hoa cúc còn đem lại những lợi nhuận kinh tế đáng kể cho người nông dân Kim ngạch xuất khẩu hoa cúc quý 3 năm 2008 của Việt Nam đã đạt hơn 1.400 nghìn USD [67]

2.3 Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới và Việt Nam

2.3.1 Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc trên thế giới

Hoa cúc là một trong những loài hoa hàng năm phổ biến nhất trên thế giới,

do đặc điểm của hoa cúc có thể điều khiển được sự ra hoa của cây nên người ta

có thể tạo ra nguồn sản phẩm liên tục và ổn định quanh năm Chính vì thế mà ở Bắc Mĩ, Tây Âu và Nhật Bản hoa cúc đang đứng ở vị trí thương mại thứ hai sau cây hoa hồng Quốc gia xuất khẩu hoa cúc dẫn đầu là Hà Lan, phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm 80 nước trên thế giới với diện tích trồng hoa cúc chiếm tới 30% tổng diện tích trồng hoa tươi Sau Hà Lan, Colombia là nước đứng thứ hai trên thế giới về xuất khẩu hoa cúc, mỗi năm xuất khẩu 600 triệu cành tiếp theo là Italia, mỗi năm sản xuất được 500 triệu cành và Mỹ là 300 triệu cành

Từ lâu, công nghệ nhân giống in vitro đã được ứng dụng để sản xuất cây

con Năm 1986 Hà Lan đã sản xuất được 73 650.000 cây giống in vitro Công

nghệ nhân giống tiên tiến này đã trở thành nền tảng cho ngành sản xuất hoa và cây cảnh của Hà Lan cũng như các nước sản xuất hoa trên thế giới Bằng phương pháp này người ta đã sản xuất được một số lượng lớn cây giống khoẻ, sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền

2.3.2 Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc ở Việt Nam

Việt Nam có điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi có thể trồng được rất nhiều loại hoa và cây cảnh Hiện nay diện tích trồng hoa cây cảnh của nước ta trên 15.000 ha và diện tích trồng hoa cúc chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa cây cảnh trên cả nước Nhiều chủng loại hoa cúc đã được trồng phổ biến khắp nước ta, vùng sản xuất chính là Hà Nội, Hải Phòng, Sa Pa, thành phố Hồ Chí Minh và Lâm Đồng, trong đó Đà Lạt là nơi lý tưởng cho việc trồng và nhân giống của hầu hết các loại cúc Vùng hoa công nghệ cao Đà Lạt, hoa hồng và hoa cúc là hai loại hoa chủ đạo, hoa cúc có 40 loại khác nhau, chia thành ba nhóm lớn là cúc đại đoá, cúc giống nhỏ

và cúc tia có muỗng

Tại vùng trồng hoa Tây Tựu, Từ Liêm, Hà Nội hoa hồng và hoa cúc là hai loại hoa có diện tích trồng và sản lượng cao nhất Hoa cúc của Tây Tựu không chỉ được tiêu thụ tại thị trường phía Bắc mà đang được đưa vào thị trường phía Nam và xuất khẩu sang Trung Quốc theo con đường tiểu ngạch

Tại các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc diện tích trồng hoa diện tích trồng hoa cúc đã có 14,5 ha với sản lượng 5 triệu cành/ năm [67]

Theo đánh giá của các chuyên gia ngành hoa của Nhật Bản và Tây Âu thì Việt Nam hiện đang có cơ cấu hoa phù hợp với thị hiếu của các thị trường hoa cao cấp trên thế giới Tuy nhiên để đáp ứng được yêu cầu về chất lượng mẫu mã

và an toàn thực vật cao của thị trường này các nhà sản xuất hoa của Việt Nam phải có kế hoạch đầu tư và phát triển một cách thích hợp đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống và nhân giống cũng như là các biện pháp canh tác, công nghệ đóng gói bảo quản để nâng cao năng suất và chất lượng hoa

III Ứng dụng của đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc

3.1 Khái niệm về đột biến

Đột biến (mutation) là những biến đổi di truyền hợp thành cơ sở di truyền của tính biến dị, nó là hiện tượng thường xuyên gắn liền với sự sống và tiến hoá của sinh vật Tác động của các đột biến rất đa dạng, nó có thể gây ra những biến đổi bất kỳ tính trạng nào với những mức độ khác nhau, từ những biến đổi rõ rệt, đến những sự sai lệch rất nhỏ khó nhận thấy Một số đột biến được biểu hiện ra kiểu hình có thể quan sát được, nhưng cũng có những đột biến chỉ ảnh hưởng đến sức sống Có những đột biến lặn, nhưng cũng có những đột biến trội Sự thay đổi kiểu hình do đột biến có thể biểu hiện ra ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau như phôi, hạt, cây con, cây trưởng thành [17]

Căn cứ vào sự biến đổi cấu trúc di truyền người ta có thể phân ra làm các loại đột biến khác nhau như: đột biến gen: Biến đổi rất nhỏ trên một đoạn ADN, thường liên quan đến 1 hay 1 cặp nucleotide; đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể: tái sắp xếp, lặp đoạn, mất đoạn, Các đột biến này còn có thể gọi là sai hình nhiễm sắc thể [7]

Trong điều kiện tự nhiên, tần số xuất hiện đột biến thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại cây trồng và của từng gen riêng biệt, tuy nhiên tần số đột biến rất thấp (khoảng 10-6) và khó phát hiện [1], số đột biến có lợi cho sản xuất và đời sống lại càng thấp hơn Ngày nay các nhà chọn giống không thể chỉ trông chờ vào việc sử dụng các dạng đột biến tự phát Vì vậy, việc nghiên cứu đột biến nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhằm tăng tần xuất xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây trồng nói riêng Mặc dù còn nhiều hạn chế nhưng đột biến thực nghiệm đã và đang đóng góp rất lớn cho việc cải tiến giống cây trồng trên thế giới [7]

3.2 Các tác nhân gây đột biến

Tác nhân gây đột biến thường sử dụng trong ứng dụng chọn tạo giống cây trồng là các tác nhân vật lý hay hoá học

- Tác nhân vật lý: Sử dụng tác nhân phóng xạ: phóng xạ hạt và phóng xạ điện từ Phóng xạ hạt là dòng chuyển động của những hạt cơ bản: nơtron, proton, Phóng xạ điện từ là các sóng điện từ như tia gamma, tia X

Tia gamma và tia X là 2 dạng tia được sử dụng như nguồn chiếu xạ cơ bản trong các thực nghiệm, phổ biến nhất là tia gamma với nguồn Co60 và Cs137

Do có bước sóng rất ngắn và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích, không bị lệch trong điện trường và có sức xuyên khá lớn

- Tác nhân hóa học: Các chất đồng đẳng của bazơ nitơ như 5- bromuracil, 2-aminopurin Các hợp chất alkyl hoá như EI (ethylene imin), EMS (ethyl methane sulfonate) Các hợp chất này có khả năng alkyl hoá các nhóm phosphate trong phân tử DNA cũng như các bazơ purin hay pyrimidine dẫn đến

sự đột biến Các chất ôxi hoá khử và các gốc tự do như peroxyt, HNO2, aldehyd…gây đột biến liên quan đến sự dezamin hoá các gốc purin và pyrimidine của DNA và RNA Ngoài ra, các chất nhuộm màu thuộc nhóm acridin, các chất này khi phản ứng với DNA thì tạo thành một phức hệ làm rối loạn sự tái sinh bình thường của DNA

3.2.1 Tính chất và cơ chế tác động của colchicine

a Tính chất

Colchicine là một alkaloid có ở nhiều loài thực vật nhưng có chủ yếu ở trong củ và hạt loài colchicum autumnale Colchicine có công thức phân tử là

C22H25O6N, khối lượng phân tử là l 399.4dv C

Colchicine khi kết tinh có dạng tinh thể hình kim ngắn, có màu vàng nhạt Nhiệt độ nóng chảy là 155oC, tan trong rượu, clorofoc, nước lạnh, hầu như không tan trong ete [57]

Cơ chế tác động

Colchicine có tác dụng đến sự phân bào bằng cách ức chế sự hình thành thoi vô sắc ở kì giữa, ngăn cản các nhiễm sắc thể con phân ly ở hậu kì Ở pha này, các nhiễm sắc thể được nhân lên nhưng thoi vô sắc không hình thành nên

c Cơ chế hình thành đa bội

Phân chia tế bào nguyên nhiễm, giảm nhiễm là cơ chế phân chia chính xác

về số lượng nhiễm sắc thể, đảm bảo cho loài được ổn định về bộ nhiễm sắc thể qua các thế hệ Tuy nhiên trong một số trường hợp sự phân chia bình thường của các tế bào bị phân huỷ dẫn tới hình thành các tế bào đa bội Sự nhân đôi của các nhiễm sắc thể xảy ra trước phân bào, thế nhưng các sợi tơ vô sắc bị phân huỷ dưới tác động của các yếu tố gây đột biến, làm cho các sợi nhiễm sắc không chạy về hai cực của tế bào Cuối cùng, lượng vật chất di truyền đã nhân đôi tồn tại ở một tế bào, hình thành nên tế bào được đa bội hoá: từ 2n trở thnh 3n, 4n

Có thể xảy ra trường hợp là các sợi nhiễm sắc được vận động về hai cực của tế bào, song ở giữa tế bào không hình thành vách ngăn để phân đôi hai tế bào con,

tế bào trở thành đa bội [15]

3.2.2 Cơ chế tác động và ứng dụng của EMS trong công tác chọn tạo giống cây trồng

EMS có tên khoa học là Ethylmethane sulphonate, công thức hóa học:

CH3 – CH2 – O – SO2 – CH3 (Eldon John Gardner, Michael J.Simmons, D.Peter Snustad, 1984)

● Cơ chế tác động của EMS:

EMS gây alkyl hóa với bazơ nitơ thường xuất hiện ở vị trí O6 của Guanin khiến cho nó sau đó có thể kết cặp với Thymine và dẫn đến sự đồng hoán giữa các bazơ nitơ (đồng hoán – transition – là sự thay thế một purin này bằng một purin khác hoặc một pyrimidin này bằng một pyrimidin khác, hoặc sự thay thế một cặp bazơ này bằng một cặp bazơ khác mà vẫn giữ nguyên định hướng của purin và pyrimidin) [12]

Người ta còn phát hiện rằng dimethylsulphoxide (DMSO) là một chất mang

có chức năng thúc đẩy hiện tượng phát sinh đột biến gen của EMS Xử lý chất này làm giảm sự sinh trưởng 30 - 40% có khả năng tạo nên đột biến ở tần suất tối hảo cho cây trồng thuộc nhóm mễ cốc [2]

Hình 1.1 Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hoá [17]

3.2.3 Cơ chế tác động và ứng dụng của đột biến phóng xạ trong chọn tạo giống cây trồng

3.2.3.1 Tác nhân phóng xạ gây đột biến

Nhờ sự phát hiện mới trong vật lý nguyên tử đã mở rộng phạm vi nghiên cứu, ứng dụng phóng xạ trong tạo giống cây trồng Có 2 dạng phóng xạ là phóng

3.2.3.2 Cơ chế gây đột biến của tác nhân bức xạ:

Theo lý thuyết của A.M.Kuzin cơ chế của quá trình tương tác gây đột biến gồm 3 giai đoạn chính:

- Giai đoạn 3: Có tính chất sinh học là giai đoạn phát huy tác dụng của các phản ứng lên hoạt động của các tế bào sống Tức là các biến đổi hoá học gây nên

do bức xạ dưới mức tế bào, chẳng hạn làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào

Quá trình tác động qua nhiều giai đoạn như thế gọi là tác động gián tiếp của bức xạ lên tế bào sống Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy các tia bức xạ còn gây ra tác động trực tiếp lên một số cấu trúc dưới tế bào gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tổng hợp ADN và tổng hợp protit trong tế bào sống đặc biệt là các biến đổi trong cấu trúc ADN, làm phát sinh đột biến di truyền

Tia gamma không có khả năng điện ly trực tiếp mà chỉ có tác dụng gián tiếp Nó có khả năng biến các nguyên tử phân tử thành những phân tử mang điện tích và tạo nên sự ion hoá Nhờ sự ion hoá mà trong tế bào xảy ra những biến đổi về mặt hoá học vật liệu di truyền và những chất khác khi hấp thụ năng lượng bức xạ Kết quả quá trình này dẫn tới những biến đổi trong phân tử ADN, gây ra đột biến điểm, đôi khi gây ra sự gẫy đứt tạo nên đột biến cấu trúc NST

3.3 Ứng dụng công nghệ đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, hoa cúc

3.3.1 Ứng dụng công nghệ gây đột biến đa bội bằng xử lý colchicine in vitro

Bằng phương pháp chọn giống đa bội thể người ta đã tạo ra nhiều dạng cây trồng có giá trị ở những nhóm cây lấy củ, cây làm thức ăn gia súc, cây lấy hạt, cây lấy dầu, cây ăn quả, cây làm cảnh,…

a Trên thế giới

- Năm 2002, Wu J-H Mooney, bằng việc xử lý colchicine với nồng độ 0,05%; 0,1% và oryzalin ở nồng độ 0,01%; 0,05%; 0,1% trên callus tạo ra từ nuôi cấy phôi soma invitro ở cây có múi đã tạo ra thể quýt lai cam đường nhị bội kép cùng loài

- Nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự tại trường Đại học Kyushu-Nhật Bản (2004) đã tạo thành công dạng tứ bội trên cây Alocasia x Amazonica bằng xử lý colchicine và oryzalin [34]

- Năm 2005, các nhà khoa học tại Đại học Nông nghiệp Pakistant nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý colchicine trên cây lúa mì giai đoạn cây 5 – 7

lá Kết quả đã tạo ra giống lúa mì vừa có khả năng tự thụ phấn cao, vừa được đa bội hóa bộ NST [26]

- Mercedes Soriano và cs, 2005 cũng tiến hành các thí nghiệm nghiên

cứu ảnh hưởng của colchicine đến nuôi cấy bao phấn cây lúa mì Triticum

aestivum L Và kết luận ở nồng độ 300 ppm trong 48h đã làm tăng gấp đôi tỷ

lệ kiểu hình đơn bội kép [32]

- Năm 2006, X.M.Yang và cộng sự đã xử lý colchicine trên cây nho

(Vitis vinifera L.) nhằm tạo giống nho đa bội Kết quả nhận được 5/29 cá thể tứ

bội hoàn toàn bằng phương pháp đếm NST [48]

- Cũng với phương pháp xử lý colchicine in vitro, năm 2007 Zhen Liu và Shanlin Gao đã chọn lọc được một số dòng cúc quan trọng mang đột biến đa bội [51]

- Năm 2009, Wang Feng-bao Fu Jin-feng Dong Li-feng đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý kết hợp colchicine 0,05% với DMSO 2% ở 24h, 48h

và 72h dưới các điều kiện nhiệt độ khác nhau trong việc gây tứ bội hóa ở cây đậu Hà Lan Kết quả cho thấy, sau 48h xử lý ở 150C và 160C cho tỷ lệ sống sót cao nhất, đồng thời thu được các dạng con có bộ NST được tứ bội hóa [47]

- Năm 2010, S M Shahinul Isla tại Banglades cũng nghiên cứu tạo cây lúa mì đơn bội kép bằng xử lý colchicine Kết quả đã làm tăng tỷ lệ này đến 81,73% so với đối chứng (72,4%) [41]

b Tại Việt Nam

- Hà Thị Thuý và cộng sự (2005) đã tạo thành công dạng tứ bội trên cây cam Xã Đoài, cam Vân Du bằng xử lý colchicine trên chồi invitro của các giống này Ngoài ra, tác giả còn tạo thành công dòng tứ bội của cây quýt Chum, cam

và bưởi Phúc Trạch khi xử lý colchicine trên cành invitro, xử lý thành công trên hạt của cây cam sành, cây bưởi đỏ [16]

- Nguyễn Thị Phương Hoa (2005) đã thành công khi xử lý colchicine trên chồi Đồng tiền invitro ở các nồng độ 0,01%; 0,05%; 0,1% ở các thời gian là 24h, 48h, 72h Kết quả thu được như sau ở các nồng độ và thời gian xử lý trên đều cho chồi biến dị Tuy nhiên, mức thời gian cho chồi biến dị cao nhất là 48h

và ở nồng độ 0,1% [6]

- Nghiên cứu trên lúa Đào Văn Khuê, Nghiêm Duy Thụy dùng mạ gieo được 30 ngày lấy dao khía một lát ở gốc mạ rồi đem gốc mạ ngâm vào dung dịch colchicine 0,02%-0,05% trong 8-14 ngày thì cũng thu được giống là đa bội

- Viện Nghiên cứu rau quả năm 2010 đã tiến hành nghiên cứu tạo dòng đơn bội kép ớt và dưa chuột phục vụ chọn tạo giống ưu thế lai bằng phương pháp xử lý colchicine (Trần Khắc Thi, 2010)

3.3.2 Ứng dụng công nghệ gây đột biến bằng xử lý EMS (Ethyl methanesulfonate) in vitro

Các tác giả Tulmann Neto và cộng sự (2004) đã nghiên cứu ảnh hưởng gây

đột biến của EMS lên giống cúc Dendranthema grandiflora Tzvelev Các tác giả

tiến hành thí nghiệm trên cuống nhỏ non của giống cúc cv Ingrid (màu hồng thẫm) được xử lý với dung dịch EMS nồng độ 0,77 % trong 1h và 45 phút, sau đó ngâm trong nước 15 phút và làm sạch bề mặt Tiếp theo đó, mẫu được cấy trên môi trường MS + 1 g/l hydrolyzed casein, 1 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP) and 2 mg/l indole-3-acetic acid (IAA) Ước lượng có khoảng 910 mẫu thu được từ

xử lý EMS cuống hoa cho kết quả ra hoa Thí nghiệm thu được khoảng 40 dạng

đột biến (chiếm 5,2 %) cho màu sắc cánh hoa khác nhau (màu hồng cam, màu hồng nhạt, màu đồng, màu trắng, màu vàng và màu cam) Hầu hết chúng (89,6 % tổng số) là đồng dạng về kiểu hình

Chen Wei và cộng sự (2004), nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS lên

các phôi tiểu bào tử in vitro họ cải bắp (Brassica napus) cho thấy: Khi xử lý các tiểu bào tử của B napusin vitro ở các nồng độ 0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; và 3,0 mM/l

và các khoảng thời gian 12, 24 và 36 giờ), kết quả chỉ ra rằng số lượng hầu hết các sản phẩm phôi tiểu bào tử đều giảm xuống, tăng dần ở các nồng độ xử lý và các khoảng thời gian xử lý

Tác giả Luan và cộng sự (2007), đã sử dụng EMS nhằm gây đột biến

tăng tính chịu mặn của các giống Khoai lang (Ipomoea batatas L.) [30] Mẫu mô

lá được sử dụng đem xử lý EMS ở nồng độ 0,5 % trong thời gian 0,0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 giờ; sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 4 lần Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS + 200 mM NaCl nhằm chọn lọc các dòng tế bào đột biến Các giống như ML1, ML2 và ML3 được phục tráng từ các dạng phôi vô tính thích hợp với xử lý EMS nồng độ 0,5 % trong 2 và 2,5 giờ Các giống chọn tạo được có đặc tính chịu mặn hơn hẳn các giống gốc

Năm 1998, các tác giả thuộc Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long đã gây đột biến thành công giống lúa thơm Jasmine 85 bằng xử lý hóa chất EMS trong nuôi cấy mô

Theo thời báo Nông nghiệp Việt Nam (2001), tại Malaysia bằng cách lấy đỉnh sinh trưởng nuôi cấy tạo mô sẹo rồi dùng các tác nhân gây đột biến có thể

là hóa chất như EMS 0,2% (Ethylmethane sulphonate), DMSO 2% (Dimethylsulfoxide) hoặc tia gama được điều chế từ Co60 đã chọn tạo thành công giống chuối FATON-1 có đặc điểm từ khi trồng tới lúc thu hoạch sớm hơn giống gốc là giống chuối Cavedish gần 6 tháng

3.3.3 Ứng dụng công nghệ gây đột biến bằng xử lý tia gamma in vitro

Trên thế giới nhiều quốc gia đã thành lập những trung tâm phóng xạ để phục vụ công tác tạo giống Thống kê của FAO/IAEA đến tháng 8/2008 đã có khoảng 3000 giống cây trồng tạo ra bằng phương pháp đột biến thực nghiệm

trong đó có 1206 giống cây ngũ cốc, 454 giống hoa, 198 giống cây lấy dầu, 203 cây họ đậu và 611 giống cây trồng khác [58] Đến năm 2010, cũng theo thống kê của IAEA, số lượng giống cây trồng đột biến tăng ổn định và đạt 3100 giống đột biến từ 170 giống gốc của các loại cây trồng khác nhau [61] Thành công của phương pháp chọn giống phóng xạ đã đạt được ở rất nhiều đối tượng cây trồng: cây lương thực, cây công nghiệp, cây ăn quả, cây cảnh, cây rau Những đặc tính được cải tiến sau khi gây đột biến như rút ngắn chiều cao, chín sớm; tăng cường chống chịu sâu bệnh, thích ứng với điều kiện bất lợi của môi trường; đa dạng màu sắc và kiểu hình ở hoa và cây cảnh Cùng với những phương pháp chọn tạo giống khác, xử lý đột biến phóng xạ đã trở thành công cụ hữu hiệu trong tạo giống cây trồng

Năm 2010, nhóm tác giả đại học Seoul – Hàn Quốc đã xử lý chiếu xạ tia gamma trên cây khoai lang với mục đích nhằm nâng cao năng suất và hàm lượng tinh bột trong củ Kết quả đã thu được 29 dòng khoai lang triển vọng được chọn lọc từ 600 dòng khoai lang nghiên cứu [37]

Tại Thái Lan năm 2005, nhóm tác giả Chontira Sangsiri, Worawit Sorajjapinun và Peerasak Srinives xử lý tia gamma nguồn Cs 137 ở liều 500 Gy trên hạt của các giống đậu xanh KPS 2, VC 6468-11-1B và thế hệ F1 và F2 của chúng Kết quả tần suất đột biến cao nhất nhận được ở F1 là 0,168%, tiếp theo là F2 và VC 6468-11-1B, KPS 2 lần lượt là 0,165%, 0,152%, và 0,142% Các biến

dị chủ yếu tập trung vào đặc điểm sai khác ở lá và hoa [21]

Năm 2005, D.Puchooa (đại học Mauritius) [24] đã nghiên cứu chọn tạo

giống hoa Hồng môn Anthurium andreanum bằng cách chiếu xạ tia gamma in vitro

trên vật liệu là callus tái sinh từ mô lá non Phản ứng tốt nhất nhận được ở liều 5Gy trong khi ở liều 15Gy đã gây chết mô callus trước khi tái sinh thành cây Các dạng biến dị nhận được cũng được kiểm tra đánh giá sai khác bằng chỉ thị RAPD

Năm 2010, tại Ba Lan, Małgorzata Zalewska, Natalia Miler, Alicja Tymoszuk, Barbara Drzewiecka, Janusz Winiecki đã sử dụng tia X và tia

gamma để gây đột biến trên mô lá, đốt thân cây hoa cúc Chrysanthemum ×

grandiflorum (Ramat.) Kitam với liều suất từ 15-25Gy Kết quả chỉ ra tia

gamma có hiệu quả hơn trong việc gây ra số lượng lớn các biến dị

Năm 2000 các nhà khoa học ở Thái Lan là S Lamseejan và cs đã tạo được một số dòng cúc đột biến từ giống cúc Chrysanthemum moriforium Ramat bằng cách chiếu tia gamma với liều chiếu từ 10- 110 Gy lên các chồi tái sinh từ cánh

hoa trong nuôi cấy in vitro [39] Năm 2001, M.Zalewska và các cộng sự người Phần Lan chiếu tia gamma lên chồi tái sinh từ lá của hoa cúc Dendranthema

grandiflora Tzvelev kết quả đã thu được tần số đột biến khá cao

Ở Trung Quốc, M.Sun và các cộng sự (2007) đã sử dụng nguồn phóng xạ là electron beam kết hợp với nuôi cấy mô tê bào để tạo ra các dòng đột biến từ giống hoa Cheng Yun và đã cho thấy ở liều chiếu từ 40- 60 Gy đã tạo được các đột biến về màu sắc từ màu vàng dần chuyển sang màu tím đỏ

Theo dữ liệu của Cơ quan Năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA), đến nay

đã có tới 256 giống hoa cúc và 26 giống cẩm chướng tạo ra nhờ phương pháp xử

lý đột biến phóng xạ và hoá chất

™ Những nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam các nhà khoa học đã ứng dụng nhanh chóng các phương pháp chọn giống đột biến vào công tác chọn giống cây trồng và đạt nhiều thành quả to lớn, góp phần nâng cao năng suất chất lượng cây lương thực, thực phẩm Hiện nay nước ta có hơn 70 giống cây trồng tạo ra nhờ các tác nhân gây đột biến tập trung trên đối tượng cây lương thực, cây công nghiệp nhưng trên cây hoa vẫn còn hạn chế

Năm 2002, Viện Di truyền nông nghiệp đã chọn tạo được giống DT22 là giống lúa nếp đột biến từ DT21/Đài loan có năng suất cao, chất lượng tốt Giống này đã được công nhận là giống sản xuất tạm thời Năm 2007, DT38 có đặc tính năng suất cao, cứng cây, kháng sâu bệnh được chọn lọc từ xử lý đột biến trên giống Khang dân 18 đã được công nhận là giống tạm thời (Kỷ yếu Hội thảo

Năm 2003, Đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh đã bước đầu tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống cúc bằng việc gây đột biến thực nghiệm từ việc chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) trên chồi in vitro

Năm 2005, Đào Thanh Bằng và cộng sự thuộc Viện DTNN đã chiếu xạ vào mô sẹo cây hoa cúc bằng tia gamma ở các liều lượng 1, 3, 5, 7 và 15K nhằm tăng phổ đột biến màu sắc hoa từ màu trắng ban đầu Kết quả thu được cho thấy liều gây chết 50% về khả năng tái sinh chồi là 5K và thu được 3 thể đột biến về màu sắc: hoa màu hồng, hoa vàng và hoa có chóp cánh màu xanh

Năm 2007, Viện Sinh học Nông nghiệp đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều gây chết là 12K và liều chiếu xạ có hiệu quả cho tỷ lệ sống và tỷ lệ đột biến cao là 6K Đồng thời các tác giả cũng đã chọn lọc được một số dòng đột biến có lợi như màu sắc hoa khác biệt giống gốc hay đột biến thể lùn thích hợp cho trồng chậu (Hoàng Thị Nga và cs,2009)[9]

Xử lý chiếu xạ trên cây hoa cẩm chướng ở nước ta đã có nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Vinh và cộng sự (1997) và Lê Đức Thảo (2010) [13] Tuy nhiên chưa có công bố tạo ra giống hoa cẩm chướng mới bằng phương pháp này

3.5 Ứng dụng các phương pháp chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây hoa cẩm chướng, hoa cúc

Một số chỉ thị phân tử thường dùng trong đánh giá sai khác di truyền hiện

nay: kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Rectriction Fragment

Length Polymorphism – RFLP); kỹ thuật đa hình các đoạn DNA khuếch đại

ngẫu nhiên (Randomly Amplified Polymorphic DNA: RAPD- PCR); kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản chọn lọc (Amplified Fragment Length

Polymorphism – AFLP); kỹ thuật xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu (Sequence Tagged Site – STS); kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats – SSR)…

* Sử dụng chỉ thị RAPD đánh giá đa dạng di truyền trên cây cẩm chướng:

Theo nghiên cứu của tác giả Takashi Onozaki và cộng sự, sự khuếch đại

đa hình ngẫu nhiên ADN (markers RAPD) liên kết với các gen kiểm soát kiểu

hoa đơn hay kép của cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) Vì vậy, tác giả đã

tách riêng 127 cây con cháu bắt nguồn từ lai chéo giữa 'Hoa cẩm chướng Nou số 1' (kép) và 'Pretty Favvare' (đơn) sử dụng để xây dựng bản đồ liên kết di truyền trong hoa cẩm chướng Các marker RAPD AT90-1000 đã được chuyển đổi thành công thành marker STS Phân tích cho thấy gen đơn này đã nằm trên 16 nhóm liên kết trong bản đồ di truyềnđã được xây dựng Tuy nhiên, STS marker

đã không được phát hiện thấy trong bốn giống cẩm chướng hoa đơn

Nhóm tác giả người Nhật Masafumi Yagi, Takashi Onozaki, Mitsuyasu Taneya, Hideki Watanabe, xây dựng một bản đồ liên kết di truyền cho các giống

hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) [31] về tính chống chịu với vi

khuẩn héo vàng trên cơ sở marker RAPD và marker SSR Các bản đồ liên kết bao gồm 137 marker RAPD và 9 marker SSR Nghiên cứu này là báo cáo đầu tiên về việc xây dựng một bản đồ liên kết của các hoa cẩm chướng

Nghiên cứu của nhóm tác giả Hàn Quốc dùng chỉ thị RAPD để điều tra

tiềm năng nguồn gen các loài Dianthus của Hàn Quốc và làm rõ mối quan hệ di truyền giữa Dianthus repens, D japonicus, D superbus var longicalycinus, và

D var superbus Mười một trong số hai mươi mồi RAPD cho sự đa hình AND

của tất cả các loài cẩm chướng nghiên cứu Hệ số tương đồng di truyền giữa bảy loài Dianthus Hàn Quốc và hai giống đã thương mại hoá là 0,43 ~ 0,88

* Sử dụng chỉ thị SSR đánh giá đa dạng di truyền trên cây cẩm chướng:

Năm 2000, M J M Smulders và cộng sự đã sử dụng một số marker SSR

và xác định đa dạng di truyền 26 loài Dianthus trong đó có chi Dianthus

caryophyllus

41 giống cẩm chướng, bao gồm cả các giống cẩm chướng đột biến đã được phân biệt thành công sử dụng 13 marker SSR này

* Sử dụng chỉ thị RAPD đánh giá đa dạng di truyền trên cây hoa cúc:

Năm 2000, Sheng Chung Huang và các cộng sự Đài Loan đã phân tích di truyền của các giống cúc lai bằng chỉ thị phân tử RADP Với 40 mồi RAPD được sử dụng để phân tích đã xác định có sự khác biệt về mặt di truyền của các con lai so với bố mẹ

Các nhà khoa học Tây Ban Nha là Carmen Martín, Elizabeth Uberhuaga và César Pérez (2002) đã ứng dụng chỉ thị RAPD trong phân tích các sự biến dị di truyền của các giống cúc sau khi nuôi cấy in vitro Bằng chỉ thị RAPD họ đã phát hiện được những phản ứng khác nhau của các giống cúc ở các thời kỳ nuôi cấy khác nhau [22]

Chỉ thị phân tử RADP cũng được J Chatterjee và các cộng sự (2005) sử dụng để phân tích sự đa dạng di truyền của 4 giống cúc đó là Pancho- Single whork, Little darling Orange, Satbhawana, Shizuka-one và đã phát hiện ra sự đa hình của các giống qua các băng DNA [27]

Theo J Chatterjee và các cộng sự Nhật Bản (2006) thì RAPD là chỉ thị hiệu quả để phân tích sự đa hình của 21 giống hoa cúc trong đó có 10 giống gốc và

11 giống đột biến Kết quả đã chỉ ra rằng sự khác biệt về màu sắc giữa các giống đột biến và các giống gốc có thể xác định được bằng chỉ thị RAPD

để xác định sự khác biệt di truyền của các giống hoa cúc đột biến ở Ấn Độ

Như vậy, các tài liệu nghiên cứu tổng quan được đã chỉ rõ: việc sử dụng phương pháp đột biến in vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng và hoa cúc

là hướng nghiên cứu đúng đắn và đã thu được nhiều thành công trên thế giới Đồng thời, ở Việt nam hướng nghiên cứu này còn rất mới mẻ và chưa được đầu

tư thích đáng Chính vì vậy đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ đột biến in

vitro trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng và hoa cúc” là cần thiết được tiến

hành nhằm không chỉ tạo ra những giống hoa mới có bản quyền, mà còn làm cơ

sở cho sự phát triển hướng nghiên cứu mới ở nước ta

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Giai đoạn tạo đột biến

a Vật liệu cây hoa cẩm chướng:

- Cẩm chướng cắt cành (Dianthus caryophyllus) gồm 2 giống có nguồn

gốc từ Hà lan, đã được trồng phổ biến ở Việt nam:

+ Giống hoa trắng viền tím: hoa đơn, cánh kép màu trắng, mép cánh viền tím và xẻ răng cưa; thân và lá màu xanh đậm, sinh trưởng khỏe

+ Giống hoa đỏ: hoa đơn, cánh kép màu đỏ cờ

- Cẩm chướng gấm (Dianthus chinensis): giống hoa Tím viền trắng

b Vật liệu cây hoa cúc:

Hoa cúc (Chrysanthemum.ssp) gồm hai giống hoa cúc được sản xuất trên

thị trường và được lưu giữ giống tại Viện Di truyền nông nghiệp:

+ Giống hoa cúc màu tím có nguồn gốc từ Đài Loan có đặc điểm hoa kép, màu tím, cánh phiến, đầu cánh tua, lá màu xanh đậm xẻ thùy nhiều, thân xanh tím sinh trưởng khỏe

+ Giống cúc vàng Pha Lê có nguồn gốc từ Đài Loan có đặc điểm hoa kép, màu vàng tươi, cánh ống, đầu cánh tròn, lá màu xanh, xẻ thùy, thân xanh

Giai đoạn phân tích đa dạng di truyền