Nghiên cứu tạo enzyme tái tổ hợp thủy phân lignocelluloses phục vụ sản xuất cồn nhiên liệu

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO ENZYME TÁI TỔ HỢP THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSES PHỤC VỤ SẢN XUẤT CỒN NHIÊN LIỆU CNĐT : TÔ KIM ANH 8373 HÀ NỘI – 2010 TRƯ NG ð I H C BÁCH KHOA HÀ N I VI N CN Sinh h c-CN Th c ph m C NG HOÀ XÃ H I CH NGHĨA VI T NAM ð c l p - T - H nh phúc Hà N i ngày 20 tháng 11 năm 2010 BÁO CÁO TH NG KÊ K T QU TH C HI N ð TÀI I THƠNG TIN CHUNG Tên đ tài: Nghiên c u t o ch ph m enzyme tái t h p th y phân lignocellulose ph c v s n xu t c n nhiên li u Mã s ñ tài: KC.04.22/06-10 Thu c: - Chương trình: Chương trình KH & CN tr ng ñi m c p Nhà nư c, Mã s : KC.04/06-10 Ch nhi m ñ tài/d án: H tên: Tô Kim Anh Ngày, tháng, năm sinh: 29/07/1961 Nam/ N : N H c hàm, h c v : PGS TS Ch c danh khoa h c: Ch c v : Vi n trư ng Vi n CNSH-CNTP, trư ng ð i h c Bách khoa Hà N i ði n tho i: T ch c: 04.38682470, Nhà riêng: Mobile: 0904307476 Fax: 04.38682470 E-mail: tokimanh@mail.hut.edu.vn Tên t ch c cơng tác: Vi n CNSH-CNTP, trư ng ð i h c Bách khoa Hà N i ð a ch t ch c: S 1, ð i C Vi t, Hai Bà Trưng, Hà N i ð a ch nhà riêng: T ch c ch trì đ tài/d án: Tên t ch c ch trì đ tài: Vi n CNSH-CNTP, trư ng ð i h c Bách khoa Hà N i i ði n tho i: 04.38682470 Fax: 04.38682470 E-mail: biofotech@mail.hut.edu.vn Website: http://sbft.hut.edu.vn ð a ch : S 1, ð i C Vi t, Hai Bà Trưng, Hà N i H tên th trư ng t ch c: PGS.TS Tô Kim Anh S tài kho n: 931.01.140 Khoa b c Hai Bà Trưng Hà N i, s 365 Tr n Khát Chân Tên quan ch qu n ñ tài: B Giáo d c ðào t o II TÌNH HÌNH TH C HI N Th i gian th c hi n ñ tài: - Theo H p ñ ng ñã ký k t: t tháng 1/ năm 2009 ñ n tháng 12/ năm2010 - Th c t th c hi n: t tháng 1/năm 2009 ñ n tháng 12/năm 2010 - ðư c gia h n (n u có): khơng Kinh phí s d ng kinh phí: a) T ng s kinh phí th c hi n: 2950 tr.đ, đó: + Kính phí h tr t SNKH: 2950 tr.đ + Kinh phí t ngu n khác: tr.đ ii b) Tình hình c p s d ng kinh phí t ngu n SNKH: S TT Theo k ho ch Kinh phí Th i gian (Tr.đ) (Tháng, năm) Th c t ñ t ñư c Th i gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 03/2009 11/2009 03/2010 09/2010 11/2009 07/2010 12/2010 Ghi (S đ ngh quy t tốn) 1155 495 910 390 607 1136 1207 c) K t qu s d ng kinh phí theo kho n chi: ð i v i đ tài: ðơn v tính: Tri u ñ ng S TT N i dung kho n chi Tr cơng lao đ ng (khoa h c, ph thông) Nguyên, v t li u, lư ng Thi t b , máy móc Xây d ng, s a ch a nh Chi khác T ng c ng Theo k ho ch T ng SNKH Ngu n khác Th c t ñ t ñư c T ng 1156 1156 1471 1471 323 2950 SNKH Ngu n khác 323 2950 Các văn b n hành q trình th c hi n ñ tài/d án: (Li t kê quy t ñ nh, văn b n c a quan qu n lý t cơng đo n xác đ nh nhi m v , xét ch n, phê t kinh phí, h p ñ ng, ñi u ch nh (th i gian, n i dung, kinh phí th c hi n n u có); văn b n c a t ch c ch trì đ tài, d án (đơn, ki n ngh u ch nh n u có) S S , th i gian ban TT hành văn b n S 1468/Qð- Tên văn b n V vi c phê t t ch c, cá nhân iii Ghi BKHCN ngày 16/7/2008 S 2025/QðBKHCN ngày 16/9/2008 S 22/2009/HððTCTKC.04/06-10 ngày 4/1/2009 S 384/QðBKHCN ngày 20/3/2009 S 944/QðBKHCN ngày 05/06/2009 S 222/QðBKHCN ngày 27/02/2010 trúng n ch trì th c hi n đ tài khoa h c cơng ngh th c hi n năm 2009 thu c Chương trình “Nghiên c u, phát tri n ng d ng công ngh sinh h c”, mã s KC.04/06-10 Phê t kinh phí 06 đ tài, 01 d án s n xu t th nghi m b t ñ u th c hi n năm 2009 thu c Chương trình KH&CN tr ng ñi m c p Nhà nư c giai ño n 2006-2010 “Nghiên c u, phát tri n ng d ng công ngh sinh h c”, Mã s KC.04/06-10 H p ñ ng nghiên c u khoa h c phát tri n công ngh V vi c phê t k ho ch ñ u th u mua s m v t tư, hóa ch t c a đ tài KC.04.22/06-10 thu c Chương trình “Nghiên c u, phát tri n ng d ng công ngh sinh h c”, mã s KC.04/06-10 V vi c ñi u ch nh k ho ch ñ u th u mua s m v t tư, hóa ch t c a đ tài KC.04.22/06-10 thu c Chương trình “Nghiên c u, phát tri n ng d ng công ngh sinh h c” mã s KC.04/06-10 V vi c phê t k ho ch ñ u th u mua s m v t tư hóa ch t c a đ tài KC.04.22/06-10 thu c Chương trình “Nghiên c u, phát tri n ng d ng công sinh h c”, mã s KC.04/06-10 T ch c ph i h p th c hi n ñ tài, d án: S TT Tên t ch c ñăng ký theo Thuy t minh Tên t ch c ñã tham gia th c hi n N i dung tham gia ch y u iv S n ph m ch y u ñ t ñư c Ghi * Vi n Công ngh Sinh h c, Vi n Khoa h c Công ngh Vi t Nam Vi n Công ngh Sinh h c, Vi n Khoa h c Công ngh Vi t Nam Phân l p, tách dòng, bi u hi n, thu nh n nghiên c u đ c tính endoglucan ase, exoglucana se Vi n Cơng Tách dòng, bi u hi n, nghi p Th c ph m thu nh n nghiên c u ñ c tính xylanase + 02 dịng gen endo-, exo-glucanase + 02 ch ng vi khu n tái t h p t ng h p enzyme endo-, exoglucanase + 02 Ch ph m k thu t enzyme endo-, exo-glucanase + 02 Quy trình lên men t ng h p ch ph m enzyme endo-, exo-glucanase + 02 quy trình thu h i chê ph m enzym endo, exo-glucanase + dòng gen xylanase + ch ng vi tái t h p t ng h p xylanase + Ch ph m k thu t enzyme xylanase + Quy trình s n xu t ph m enzyme ch xylanase + Quy trình thu nh n ch ph m xylanase - Lý thay ñ i: N i dung t o ch ng thu nh n ch ph m enzym xylanase chuy n t PGS TS Tr n Liên Hà (theo thuy t minh ðT) chuy n sang PGS TS Vũ Nguyên Thành th c hi n theo ñi u ki n th c t Cá nhân tham gia th c hi n ñ tài, d án: (Ngư i tham gia th c hi n ñ tài thu c t ch c ch trì quan ph i h p, không 10 ngư i k c ch nhi m) S TT Tên cá nhân ñăng ký theo Thuy t minh Tô Kim Anh Tên cá nhân ñã tham gia th c hi n Tô Kim Anh N i dung S n ph m ch y u tham gia đ t đư c Ch nhi m - Quy trình th y ðT phân Nghiên c u lignocellulose ph i h p - Báo cáo ñánh giá v Ghi * enzyme ñi u ki n th y phân lignocellul ose Trương Qu c Thư ký đ Phong tài Tách dịng bi u hi n betaglucosidase ð ng Th Thu Phân l p, nghiên c u thu nh n đ c tính laccase Trương Qu c Phong ð ng Th Thu Nguy n Th Xuân Sâm Nguy n Th Xuân Sâm Tr n Liên Hà Tr n Liên Hà Lê Quang Hòa Lê Quang Hòa Tr n ðình Tr n ðình hi u qu th y phân lignocellulose b ng ch ph m enzyme tái t h p thu đư c - Tách dịng gen beta-glucosidase - T o ch ng n m men tái t h p t ng h p enzyme beta-glucosidase - Ch ph m k thu t enzyme laccase tái t h p - Quy trình s n xu t ch ph m laccase tái t h p - quy trình thu h i chê ph m laccase Phân l p - Ch ph m k nghiên c u thu t enzyme thu nh n beta-glucosidase đ c tính tái t h p beta- Quy trình s n xu t glucosidase ch ph m betaglucosidase tái t h p - quy trình thu h i chê ph m betaglucosidase Phân l p, Tách dòng gen tách dòng xylanase xylanase Tách dòng - Tách dòng gen bi u laccase hi n - T o ch ng n m laccase m c tái t h p t ng h p enzyme laccase Phân l p, + tách 02 dòng gen vi M n (ñ i di n) 10 M n (ñ i di n) Vũ Nguyên Thành tách dòng, bi u hi n, thu nh n nghiên c u ñ c tính endo-, exoglucanase endo-, exoglucanase + 02 ch ng vi khu n tái t h p t ng h p enzyme endo-, exoglucanase + 02 Ch ph m k thu t enzyme endo, exo-glucanase + 02 Quy trình s n xu t ch ph m enzyme endo-, exoglucanase Tách dòng, + dòng gen bi u hi n, xylanase lên men, + ch ng vi n m thu nh n men t h p t ng nghiên c u h p xylanase + Ch ph m k ñ c tính xylanase thu t enzyme xylanase + Quy trình s n xu t ch ph m enzyme xylanase + Quy trình thu nh n enzym - Lý thay ñ i: N i dung t o ch ng thu nh n ch ph m enzym xylanase chuy n t PGS TS Tr n Liên Hà (theo thuy t minh ðT) chuy n sang PGS TS Vũ Nguyên Thành th c hi n theo ñi u ki n th c t Tình hình h p tác qu c t : S TT Theo k ho ch (N i dung, th i gian, kinh phí, đ a ñi m, tên t ch c h p tác, s ñoàn, s lư ng ngư i tham gia ) ðoàn vào tham d h i th o, 3/2009, 17 tri u ñ ng, ðHBKHN, 10 khách tham d Th c t ñ t ñư c (N i dung, th i gian, kinh phí, đ a m, tên t ch c h p tác, s đồn, s lư ng ngư i tham gia ) ðoàn vào H i th o, 3/2009 tháng 9/2010, 22,58 tri u ñ ng, ðHBKHN, 41 khách tham d vii Ghi * ðoàn vào d h i th o “Enzyme s n xu t ethanol t sinh kh i th c v t”, 11/2010, 17 tri u đ ng, ðHBKHN ðồn tham d h i th o, 11/2010, Châu Âu, 160 tri u đ ng, ngư i ðồn vào d H i th o "Valorisation des sous-produits agricoles par le développement de biotechnologies blanches pour la production de biocarburants de 2ème génération"; 9/2010, 18,32 tri u ðoàn tham d h i th o, Venice 2010 Biomase for energy, 611/11/2010, Venice-Italy, 160 tri u ñ ng, ngư i Kinh ðào t o k thu t chuy n bi u phí hi n gen th ch n m m c t i Phịng thí nghi m N m m c, t có INRA, Marseille, Pháp Nh n chuy n giao h bi u hi n n m m c Tình hình t ch c h i th o, h i ngh : Theo k ho ch Th c t ñ t ñư c S (N i dung, th i gian, kinh (N i dung, th i gian, TT phí, đ a m ) kinh phí, đ a m ) H i th o “Bioethanol t H i th o: “Bioethanol: nguyên li u sinh kh i”, status and future”, 3/2009, 17 tri u ñ ng, 3/2009, ðHBKHN ðHBKHN H i th o “Enzyme H i th o "Valorisation s n xu t ethanol t sinh kh i des sous-produits th c v t”, 11/2010, 17 tri u agricoles par le ñ ng, ðHBKHN développement de biotechnologies blanches pour la production de ème biocarburants de génération"; 9/2010, ðHBKHN viii Ghi chú* T ch c ph i h p T ch c ph i h p Tóm t t n i dung, công vi c ch y u: (Nêu t i m c 15 c a thuy t minh, không bao g m: H i th o khoa h c, ñi u tra kh o sát nư c nư c ngoài) S TT I I.1 Th i gian (B t ñ u, k t thúc Ngư i, Các n i dung, công vi c - tháng … năm) ch y u quan (Các m c ñánh giá ch y u) th c hi n Th c t Theo k ho ch ñ t ñư c N i dung 1: Nghiên c u t o 1Vi n CNSHch ng tái t h p t ng h p 10/2009 CNTP enzym thu phân Vi n CNSH lignocellulose Tách dịng gen mã hóa enzym 3-4/2009 Vi n CNSHCNTP Vi n CNSH 1-2/2009 1-2/2009 Vi n CNSHCNTP Vi n CNSH I Tách dòng gen mã hóa 3-4/2009 3-4/2009 Vi n CNSH, endoglucanase TS Tr n ðình M n I.1 Tách dịng gen mã hóa enzym 3-4/2009 3-4/2009 Vi n CNSH, exoglucanase TS Tr n ðình M n I.1 Tách dịng gen mã hóa beta3-4/2009 3-4/2009 Vi n CNSH4 glucosidase CNTP PGS Nguy n Th Xn Sâm, I.1 Tách dịng gen mã hóa laccase 3-4/2009 3-4/2009 Vi n CNSH5 CNTP TS Lê Quang Hòa I.1 Tách dịng gen mã hóa 3-4/2009 3-4/2009 Vi n CNSH6 xylanase CNTP PGS Tr n Liên Hà I.1 Tuy n ch n ch ng vi sinh v t t ng h p enzym c a ñ tài ix ml dung d ch Na2CO3 0.9 ml nư c c t, l c ñ u, ñ yên gi nhi t đ phịng M u ki m ch ng: l y ml nư c c t vào ng falcon 15ml Thêm 0.6 ml Folin 0.05N L c ñ u, ñ yên phút nhi t ñ phòng Thêm 1.5 ml dung d ch Na2CO3 0.9 ml nư c c t, l c ñ u, ñ yên gi ðo m t ñ quang nhi t ñ phòng 765 nm ñ i sánh v i m u ki m ch ng ð c k t q a d a ñư ng chu n v i acid gallic 0,25-0,75 mg/ml) Xác ñ nh hàm lư ng ethanol (Lê Thanh Mai cs, 2009): chưng c t ethanol 150 ml d ch lên men thêm kho ng 100 ml nư c c t Quá trình c t k t thúc lư ng d ch bình thu đ t 80-90 ml ð nh m c lên 100ml ðo nhi t đ sơi c a dung d ch Nhi t đ sơi c a dung d ch ethanol hòa tan nư c t l thu n v i n ng ñ ethanol Tra b ng nhi t đ sơi c a dung d ch, đư c n ng ñ c n tương ng 31 TRƯ NG ð I H C BÁCH KHOA HÀ N I C NG HOÀ XÃ H I CH NGHĨA VI T NAM VI N CN SINH H C – CN TH C PH M ð c l p - T - H nh phúc Hà N i, ngày 25 tháng 11 năm 2010 NH N XÉT V T CH C TH C HI N ð TÀI KHCN C P NHÀ NƯ C I Thơng tin chung: Tên đ tài/d án: Nghiên c u t o ch ph m enzym tái t h p thu phân lignocellulose ph c v s n xu t c n nhiên li u Mã s ñ tài/d án: KC.04.22/06-10 Thu c: - Chương trình KHCN tr ng ñi m c p nhà nư c : Nghiên c u, ng d ng phát tri n công ngh sinh h c- KC.04/06-10 Tên ch nhi m: PGS TS Tô Kim Anh Tên t ch c ch trì: Vi n Cơng ngh sinh h c-Cơng ngh th c ph m, trư ng ð i h c Bách khoa Hà n i T ng kinh phí th c hi n: 950 tri u đ ng - Trong đó, Kinh phí t ngân sách SNKH: Th i gian th c hi n: 950 tri u ñ ng - B t ñ u (theo h p ñ ng): t tháng năm 2009 - K t thúc (theo h p ñ ng): tháng 12 năm 2010 Tài li u kèm theo: Các k t lu n ki m tra ti n ñ th c hi n ñ tài xác nh n kh i lư ng công vi c xin xem ph l c II Nh n xét v t ch c th c hi n: Nh n xét v Ti n ñ th c hi n: - ð tài tri n khai n i dung nghiên c u n p h sơ nghi m thu ñ tài c p s ngày 23/11/2010, ñúng h n theo h p ñ ng ñã ký Nh n xét v tình hình s d ng huy đ ng ngu n kinh phí th c hi n - Nh n xét v tình hình s d ng kinh phí (s d ng kinh phí m c đích, khơng vi ph m nguyên t c qu n lý theo quy ñ nh - c theo báo cáo đ ngh quy t tốn): • ð tài s d ng kinh phí m c đích, th c hi n ñúng quy ñ nh qu n lý tài theo quy đ nh • ð tài th nhi m đ - Nh n xét v ð tài s khác c hi n kho n chi theo quy ñ nh thu chi n i b ñã ký gi a ch tài t ch c th c hi n nhi m v nghiên c u quy ñ nh c a B tìa tình hình huy ñ ng kinh phí theo cam k t d ng 100% v n ngân sách SNKH, khơng huy đ ng ngu n v n Nh n xét, k t lu n chung: - ð tài ñã t p h p đư c l c lư ng đơng đ o cán b có chun mơn hư ng nghiên c u c a s ñơn v nghiên c u m nh lĩnh v c - ð tài hoàn thành t t m i nhi m v nghiên c u cam k t, có giá tr khoa h c Các k t qu ñ tài thu nh n đư c có th so sánh ñư c v i k t qu ñã công b treent h gi i - K t qu ñ tài đóng góp s khoa h c k t qu có giá tr vi c nghiên c u phát tri n bioethanol t ngu n sinh kh i t i Vi t nam - ð tài góp ph n đào t o nâng cao l c ñ i ngũ nghiên c u c a ñơn v cúng ñơn v thành viên ñ tài, ñào t o nhân l c lĩnh v c lư ng sinh h c - ð tài góp ph n c ng c phát tri n quan h qu c t quan h gi a ñơn v nghiên c u nư c lĩnh v c ð ngh T p th nghiên c u m nh V n ñ nghiên c u có tri n v ng ð ngh ti p t c tri n khai v n ñ nghiên c u phát tri n bioethanol đ có s phát tri n công ngh t o s n ph m tương lai Th trư ng t ch c ch trì (H tên, ch ký đóng d u) (ðã ký đóng d u) TS Chu Kỳ Sơn B KHOA H C VÀ CÔNG NGH TRƯ NG ð I H C BÁCH KHOA HÀ N I CHƯƠNG TRÌNH KHCN C P NHÀ NƯ C KC04/06-10 BÁO CÁO TĨM T T K T QU KHOA H C CƠNG NGH ð TÀI Nghiên c u t o ch ph m enzym tái t h p thu phân lignocellulose ph c v s n xu t c n nhiên li u Mã s KC.04.22/06-10 Cơ quan ch trì đ tài/d án: Vi n Công ngh sinh h c-Công ngh th c ph m Ch nhi m đ tài/d án: Tơ Kim Anh Hà N i - 2010 B TRƯ NG ð I H C BÁCH KHOA HÀ N I KHOA H C VÀ CƠNG NGH CHƯƠNG TRÌNH KHCN C P NHÀ NƯ C KC04/06-10 BÁO CÁO TÓM T T K T QU KHOA H C CÔNG NGH ð TÀI Nghiên c u t o ch ph m enzym tái t h p thu phân lignocellulose ph c v s n xu t c n nhiên li u” Mã s KC.04.22/06-10 Ch nhi m đ tài/d án: Cơ quan ch trì ñ tài/d án (ký tên ñóng d u) (ký tên) PGS TS Tô Kim Anh TS Chu Kỳ Sơn Ban ch nhi m chương trình B Khoa h c Cơng ngh Văn phịng chương trình (ký tên đóng d u g i lưu tr ) (ký tên) Hà N i – 2010 M ð U Theo d đốn, s n lư ng d u m toàn th gi i s s t gi m kho ng 80% vào năm 2030 c n ki t hoàn toàn vào năm 2050 Trong gi i pháp tìm ngu n lư ng thay th , ethanol nhiên li u ñư c xem phương án r t đáng quan tâm có nhi u ưu m: góp ph n n đ nh an ninh lư ng, gi m thi u phát th i khí nhà kính đ n 60-80%, khai thác ngu n nguyên li u t ph ph m nông nghi p, góp ph n nâng cao thu nh p c a ngư i nông dân Vi c s n xu t ethanol t nguyên li u phi th c ph m nguyên li u lignocellulose ñang thu hút s quan tâm c a nhà khoa h c th gi i Hi n t i, nghiên c u phát tri n h enzym th y phân lignocellulose ñang hư ng t i h th p chi phí x lý nguyên li u nâng cao hi u qu trình th y phân, chưa có câu tr l i cu i ð góp ph n vào q trình hi n th c hóa vi c s n xu t bioethanol th h hai, chúng tơi th c hi n đ tài „Nghiên c u t o ch ph m enzym tái t h p thu phân lignocellulose ph c v s n xu t c n nhiên li u“ ð tài t p trung vào gi i quy t nhi m v sau: Phát tri n ch ng tái t h p thu nh n ch ph m enzym có th s d ng th y phân lignocellulose, bao g m enzym: - Endoglucanase - Exoglucanase - Beta-glucosidase - Xylanase - Laccase – Nghiên c u k thu t s d ng enzym cho th y phân nguyên li u lignocellulose ñánh giá hi u qu làm vi c c a ch ph m I THÔNG TIN CHUNG V ð TÀI Tên ñ tài: Nghiên c u t o ch ph m enzyme tái t h p th y phân lignocellulose ph c v s n xu t c n nhiên li u Mã s đ tài: KC.04.22/06-10 Thu c: Chương trình: Chương trình KH & CN tr ng m c p Nhà nư c, Mã s : KC.04/06-10 - D án khoa h c công ngh (tên d án): - ð c l p (tên lĩnh v c KHCN): Ch nhi m ñ tài/d án: H tên: Tô Kim Anh H c hàm, h c v : PGS TS Tên t ch c cơng tác: Vi n CNSH-CNTP, trư ng ð i h c Bách khoa Hà N i ð a ch t ch c: S 1, ð i C Vi t, Hai Bà Trưng, Hà N i T ch c ch trì đ tài/d án: Tên t ch c ch trì đ tài: Vi n CNSH-CNTP, trư ng ð i h c Bách khoa Hà N i ði n tho i: 04.38682470 Fax: 04.38682470 E-mail: biofotech@mail.hut.edu.vn Website: http://sbft.hut.edu.vn ð a ch : S 1, ð i C Vi t, Hai Bà Trưng, Hà N i H tên th trư ng t ch c: PGS.TS Tô Kim Anh S tài kho n: 931.01.140 Khoa b c Hai Bà Trưng Hà N i, s 365 Tr n Khát Chân Tên quan ch qu n ñ tài: B Giáo d c ðào t o II V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U Ngu n gen enzym: - Ch ng VLSH08 ñư c phân l p t m u ñ t vùng ng p nư c ven b t nh Nam ð nh có kh t ng h p endocellulase dùng tách dịng gene mã hóa endocellulase - Ch ng C fimi ATCC 484 ñã ñư c xác ñ nh có kh sinh exoglucanse dùng tách dịng gene mã hóa exocellulase - A niger PBC t b sưu t p c a vi n CNSH-CNTP, ð i h c Bách khoa Hà n i làm ngu n gen mã hóa betaglucosidase - A niger FEC130 dùng tách dịng gen mã hóa xylanase đư c phân l p t m u thân g m c, ñư c phân l p, ñ nh tên t i lồi có ngu n g c t Vi t Nam - T versicolor phịng thí nghi m đ i h c BOKU cung c p làm ngu n gen mã hóa laccase H th ng tách dịng bi u hi n - Ch ng E.Coli TOP10, E coli DH5α, E coli DH10b c a Invitrogen dùng tách dòng gen; - Các ch ng B subtilis 168M, P pastoris SMD1168, P pastoris X-33 A niger D15#26 dùng cho bi u hi n gen Các vector pPICZαA, Vector PCR2.1; PHV33 pGemT c a, Promega, - T bào kh bi n K lactis GG799 t bào kh bi n vi khu n NEB 5alpha F' Iq Competent E coli ñư c cung c p b i New England BioLabs - Ch ng n m m c A niger D15#26, vector pAN52-4 ñư c cung c p b i UMR Công ngh Sinh h c N m s i, INRA, C ng hòa Pháp - Ch ng n m m c T versicolor ñư c cung c p b i Phịng thí nghi m Cơng ngh Sinh h c Th c ph m, BOKU, Áo Thi t b Các thi t b , máy móc dùng nghiên c u bao g m: Máy l c n nhi t OSI (Pháp), máy l c n nhi t Thermocomfort (ð c), t m, t s y (Anh), máy ño pH MP200R (Th y Sĩ), cân ñi n Shimadzu (Nh t B n), cân phân tích Precisa XT 320M (Thu Sĩ), n i kh trùng t Tommy (Nh t), n i kh trùng khô (Anh), box c y (Pháp), máy làm ñá Brema (Italia), máy l c rung (ð c), máy PCR 9700 Applied biosystems (M ), b ñi n di BioRad (M ), máy soi DNA (M ), máy nh s Olympus 4000Z (Nh t), máy li tâm l nh cao t c Sorwall (M ), máy phá t bào Biospec (M ), s c ký l ng cao áp Shimadzu (Nh t), máy ñ c vi ñĩa Genios (Tecan, Áo), thi t b lên men, thi t b l c dòng ngang Qickstand (GE), thi t b ñông khô… Các nghiên c u thu c ñ tài đư c tri n khai t i: Phịng thí nghi m Công ngh sinh h c vi sinh v t, Vi n CNSH-CNTP, ðai h c Bách khoa Hà n i, Phịng Cơng ngh v t li u sinh h c Phịng Thí nghi m tr ng m công ngh gen Vi n Công ngh sinh h c, Phịng Vi sinh, Vi n Cơng ngh th c ph m Phương pháp nghiên c u - Gen mã hóa enzyme nghiên c u đư c tách dịng tr c ti p t DNA (endoglucanase exoglucanase) ho c t mRNA (beta-glucosidase, xylanase laccase) ñư c tách dịng Các ngu n gen sau đư c xác ñ nh trình t so sánh v i trình t lo i có s d li u ngân hàng gen - Các gen nghiên c u ñư c bi n n p vào t bào ch kh bi n ho c hình th c xung ñi n Các h th ng bi u hi n ñư c l a ch n bao g m: B subtilis (gen ngu n g c vi khu n), P pastoris A niger(gen ngu n g c n m m c) - Các quy trình lên men enzyme t ch ng nghiên c u ñư c xây d ng d a tìm hi u u ki n gi i h n s t ng h p enzyme b i th ch tái t h p Quy trình đư c t i ưu hóa d a y u t : pH, nhi t ñ , ch t c m ng, ch t h at hóa…Quy trình lên men đư c nghiên c u n đ nh quy mơ lít 50 lít - Enzym thơ t canh trư ng ñư c ly tâm, cô ñ c lo i mu i qua thi t b l c dòng ngang ñư c k t t a nh ethanol, k t t a đư c s y đơng khơ Ch ph m thu dư i d ng b t ho c d ng ch ph m l ng ñư c nghiên c u b sung ch t n ñ nh Enzym ñư c xây d ng tiêu chu n s - Bã mía đư c nghiên c u ti n x lý thích h p, phương pháp s d ng ki m ñư c l a ch n đ ti n x lý mã mía trư c th y phân b i enzyme H h p endoglucanase/exoglucanase/beta-glucosidase ñư c nghiên c u s d ng cho th y phân lignocellulose c a bã mía ti n x lý Laccase ñư c s d ng ñ h tr trình ti n x lý kh ñ c d ch th y phân cho lên men ethanol - Kh o sát thi t l p t l enzyme phù h p cho th y phân bã mía ti n x lý theo phương pháp l a ch n v i ch ph m enzyme thương m i Sau đó, áp d ng ch ph m enzyme c a ñ tài ñi u ki n, t l enzyme, ñánh giá hi u qu th y phân nguyên li u ñánh giá hi u qu thu h i ethanol sau lên men d ch ñư ng th y phân, so sánh v i công b qu c t c a enzyme thương m i ñi u ki n thí nghi m III DANH M C CÁC S N PH M C A ð TÀI Các s n ph m nghiên c u c a ñ tài bao g m: Các ch ng tái t h p bi u hi n enzym c a ñ tài - Bacillus subtilis 168MPHV33[Endo.Bsp] bi u hi n endoglucanase tích lũy ho t ñ 12 CMCase/ml - Bacillus subtilis 168MPHV33[Exo.Bsp] bi u hi n exoglucanase tích lũy ho t đ 9,87 U/ml - P pastoris SMD pPic9-168Mbgl bi u hi n beta-glucosidase, tích lũy ho t đ 9,5 U/ml - A niger D15#26pAN52-4lcc1 bi u hi n laccase, tích lũy ho t ñ 5,33 U/ml - P pastoris KM71H pPICZαA bi u hi n xylanase, tích lũy ho t ñ 80-100 U/ml Ch ph m k thu t enzyme tái t h p - endoglucanase: lít 96-100 FPU/ml - exoglucanase: lít 80-90 U/ml - beta-glucosidase 5kg 200 U/g - laccase 0,5kg 5000U/g - xylanase kg 240 U/g 05 Quy trình lên men thu h i enzym tái t h p - Quy trình lên men thu h i ch ph m k thu t endoglucanase tái t h p 50 lít/m : Lên men Bacillus subtlis 168M - PHV33[Endo.Bsp] môi trư ng LBPG (LB+tryptophan (0,08g)+Glucose(8g) +pepton (8g), cao n m men (4,5g) +KH2PO4 (0,5g) +K2HPO4 (0,5g)+ (NH4)3PO4 (0,8g), pH: 6,5, 250 vịng/phút; 60h; đ t 12U/ml Ly tâm thu d ch enzyme b ng l c qua màng l c 200-300 kDa, đ c lo i mu i thi t b l c dịng ngang v i đ m Na-acetate 0,1M pH 5, áp su t dòng 20 psi, kích thư c màng cutoff 10 kDa Ch ph m enzym thu đư c có ho t đ 96-100 CMCase/ml - Quy trình lên men thu h i ch ph m k thu t exoglucanase tái t h p 50 lít/m : Lên men Bacillus subtlis 168M - PHV33[Exo.Bsp] môi trư ng LBPG (LB+tryptophan (0,08g)+Glucose(8,5g)+ pepton (9g), cao n m men (5g)+KH2PO4 (0,5g) +K2HPO4 (0,5g)+ (NH4)3PO4 (0,8g), pH: 6,5, 60h; 250 vịng/phút; 72h đ t 9,87 FPU/ml Ly tâm thu d ch enzyme b ng l c qua màng l c 200-300 kDa, đ c lo i mu i thi t b l c dịng ngang v i đ m Na-acetate 0,1M pH 5, áp su t dịng 20 psi, kích thư c màng cutoff 10 kDa Ch ph m enzym thu ñư c có ho t đ 80-90 FPU/ml - Quy trình lên men thu h i ch ph m k thu t beta-glucosidase tái t h p lít/m : P pastoris SMD pPic9-168Mbgl t ng h p beta-glucosidase BMMY (1% YE, 2% peptone, 0,34% YNB, 100mM ñ m potassium phosphate, 4.10-5 % Biotin), pha ñ m 0,1 M phosphate, pH 7,5và c m ng b i methanol 1% -pH7,5 - OD ñ u 2, b sung methanol sau 6h, ñ nh kỳ 24gi /l n, n ng ñ cu i 1%, nhi t ñ nuôi 28oC, 60% ñ bão hòa oxy, t c ñ cánh khu y 240v/ph, 96 h, ñ t 9,5 U/ml Ly tâm thu d ch enzyme 10000v/ph th i gian 10 phút 40C, đ c lo i mu i thi t b l c dịng ngang v i đ m Na-acetate 0,1M pH 5, áp su t dòng 20 psi, kích thư c màng cutoff 10 kDa B sung ch t n đ nh đơng khơ 550 – 355 mmHg, thu ch ph m enzym có ho t ñ 200U/g - Quy trình lên men thu h i ch ph m k thu t laccase tái t h p lít/m : A niger D15#26pAN52-4lcc1 đư c ni c y mơi trư ng khống pH 6,1, glucose 2.51%, CuSO4 0.77% 300C, 200 vịng/phút, ngày, đ t 5,33 U/ml Ly tâm thu d ch enzyme b ng l c qua màng l c 300 kDa, cô ñ c lo i mu i thi t b l c dịng ngang v i đ m Na-acetate 0,1M pH 5, áp su t dịng 20 psi, kích thư c màng cutoff 10 kDa B sung ch t n đ nh đơng khơ 550 – 355 mmHg, thu ch ph m d ng b t 5000U/g - Quy trình lên men thu h i ch ph m k thu t xylanase tái t h p lít/m : Lên men P pastoris tái t h p BMMY (1% YE, 2% peptone, 0,34% YNB, 1% potassium sulphate, 4.10-5 % Biotin), pha ñ m 0,1 M phosphate, pH 30°C, khu y 400 v/ph, thơng khí v/v/min, b sung methanol t i 1%/ 24 h , 96h, ñ t 80-100 U/ml Ly tâm thu d ch enzym, đ c lo i mu i thi t b l c dòng ngang v i ñ m Na-acetate, kích thư c màng cutoff 10 kDa B sung ch t n đ nh đơng khơ 450 mmHg, thu ch ph m enzym có ho t đ 240 U/g Quy trình th y phân lignocellulose s d ng ch ph m enzyme c a ñ tài Quy trình th y phân lignocellulose s d ng ch ph m enzyme c a ñ tài quy mơ kg ch t/m : Bã mía s y H n h p enzyme bao 450C, nghi n nh t i kích thư c < 0,5 mm g m endocellulase /exocellulasse /betaglucosidase/laccase: CMCase /10,41 FPUase /30 U/70U/g bã mía đư c s d ng th nghi m chuy n hóa bã mía x lý ki m-nhi t (0,1g NaOH/g bã mía, 1210C, 1h) t l 1% cellulose, ñ t hi u qu th y phân tính theo cellulose 72,76%, hi u su t thu h i ethanol đ t 77% quy mơ phịng thí nghi m IV K T LU N VÀ KI N NGH K T LU N ð tài ñã thu ñư c k t q a sau ñây: Nghiên c u t o l p ch ng tái t h p thu nh n endoglucanase tái t h p: Ch ng tái t h p B subtilis 168M PHV33[Endo.Bspr] bi u hi n thành công endoglucanase t Bacillus sp VLSH08 v i quy trình lên men endoglucanase 37 oC, pH 6,5, 60h, ñ t ñư c 12U/ml Xác l p quy trình n đ nh thu h i enzym v i ho t tính 96-100 U/ml b n quy mơ phịng thí nghi m (5 lít) 50 lít Enzym ho t đ ng t i ưu 60oC pH 5,8 Ch ng tái t h p B subtilis 168M PHV33[Exo.Bspr] bi u hi n thành cơng exoglucanase t C fimi ATCC484 v i quy trình lên men exoglucanase 37 oC, pH 6,5, 72h, ñ t ñư c 9,87U/ml Xác l p quy trình n ñ nh thu h i enzym v i ho t tính 80-90 U/ml quy mơ phịng thí nghi m (5 lít) 50 lít Enzym ho t đ ng t i ưu b n 50oC pH 6,2 Ch ng tái t h p P pastoris SMD1186pPic9bgl bi u hi n thành công beta-glucosidase t A niger PBC v i quy trình lên men 37 oC, pH 7,5 c m ng b i methanol 1%, sau 96h ñ t ñư c 9,5U/ml Xác l p quy trình n đ nh thu h i enzym v i ho t tính 200U/g quy mơ phịng thí nghi m (5 lít) Enzym ho t đ ng t i ưu b n 50oC pH 5,5 Ch ng tái t h p P pastoris KM71H pPICzαAxynB bi u hi n thành công xylanase t A niger FEC130 v i quy trình lên men pH 6,0 c m ng b i methanol 1%, sau 96h ñ t ñư c 80-100U/ml Xác l p quy trình n ñ nh thu h i enzym v i ho t tính 240U/g quy mơ phịng thí nghi m (5 lít) Enzym ho t ñ ng t i ưu b n 40oC pH 5,0 Ch ng tái t h p A niger D15#26pAN52-4 lcc1 bi u hi n thành cơng laccase t T versicolor v i quy trình lên men pH 6,0 n ng ñ glucose c m ng 2.51%, n ng ñ CuSO4 0.77%, sau ngày ñ t ñư c 5333U/L Xác l p quy trình n đ nh thu h i enzym v i ho t tính 5000U/g ưu b n quy mơ phịng thí nghi m (5 lít) Enzym ho t ñ ng t i 50oC pH 4,0 Xác l p thành cơng quy trình th y phân bã mía tiên x lý v i ki m s d ng h n h p ch ph m enzym c a ñ 1210C, 60 phút, tài v i n ng ñ endoglucanase/exoglucanase/betaglucosidase/laccase: 5/10,41/30/70, enzym th p ñ t hi u su t th y phân 72,76% cellulose, hi u su t thu h i ethanol 77% Ch ph m enzym đ t hi u qu th y phân có th so sánh đư c v i cơng b s d ng ch ph m enzym thương m i Các k t qu khác: • Cơng b k t qu nghiên c u 11 báo báo cáo khoa h c • ðào t o tham gia ñào t o ti n s (01 ñã b o v -hư ng d n ph i h p), th c s (02 ñã b o v ), k sư (đã b o v ) • Xây d ng ñư c m ng lư i nghiên c u bioethanol nư c ñ y m nh h p tác khoa h c nư c qu c t 10 KI N NGH Do ñây m i ch nghiên c u bư c đ u cho vi c tìm ki m ñư ng s d ng biomase lignocellulose chuy n hóa chúng thành bioethanol, cịn c n r t nhi u nghiên c u ti p theo ñ phát tri n ti p k t qu ñã ñ t ñư c bư c ñ u c a ñ tài, bao g m: - C i t o nâng cao l c ho t tính c a ch ng tái t h p sinh enzym (g n thêm CBM, c i thi n đ c tính) - C i ti n quy trình t ng h p enzym nâng cao l c t ng h p enzym - Nghiên c u n ñ nh enzym - Tìm hi u phát tri n enzym “h tr ” trình th y phân lignocellulose - Nghiên c u k thu t ti n x lý k thu t chuy n hóa nguyên li u m r ng nguyên li u lignocellulose nghiên c u - ð ngh cho phép tri n khai n i dung nghiên c u ti p t c giai ño n 2011-2015 11 ... lignocellulose b ng ch ph m enzyme tái t h p thu ñư c - Tách dòng gen beta-glucosidase - T o ch ng n m men tái t h p t ng h p enzyme beta-glucosidase - Ch ph m k thu t enzyme laccase tái t h p - Quy trình... n) Tên ñ tài: Nghiên c u t o ch ph m enzyme tái t h p th y phân lignocellulose ph c v s n xu t c n nhiên li u Mã s : KC.04.22/06-10 Thu c: - Chương trình (tên, mã s chương trình): Nghiên c u phát... III.2.1 Nghiên c u t o ch ng tái t h p t ng h p exoglucanase 113 III.2.2 Nghiên c u thu nh n exoglucanase tái t h p 119 III.2.3 Nghiên c u quy trình thu h i exoglucanase 127 III.2.4 Nghiên c