Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học - Tập 27, Số 3/2022 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO LIPOSOME VẬN CHUYỂN α-MANGOSTIN ỨNG DỤNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Đến soạn 14-10-2022 Nguyễn Thành Dương, Phạm Thu Uyên, Viện Kỹ thuật nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Đồn Duy Tiên, Lưu Đức Phương, Bùi Thị Hồng Mơ, Bá Thị Dương Viện Hố học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Email: phamuyenpjj@gmail.com SUMMARY SYNTHESIS OF α-MANGOSTIN – LOADED – LIPOSOMES FOR APPLICATION IN CANCER TREATMENT α-Mangostin is a product that is isolated from the mangosteen with diverse biological activities, including cytotoxicity against cancer cells However, the drawback of this compound is its high cytotoxicity and poor solubility in water In this study, α-mangostin-loaded liposomes are prepared to improve water solubility and reduce the side effects of α-mangostin in cancer treatment The liposomal membrane consisted of soybean lecithin (Lec) and Cholesterol (Chol), at a molar ratio of 8/1 Experimental results show that liposomes fabricated in this way had a mean size of 115.5 nm, and a polydispersity index (PDI) of 0.122 The encapsulation efficiency of α-mangostin in liposomes is 50.3 % Further, α-mangostin-loaded liposomes show lower cell viability than free α-mangostin This formulation has expected the potential to be developed into an improved drug delivery system for αmangostin Keywords: Liposome, lecithin, α-mangostin, DLS, cancer MCF-7 (vú), AsPC-1 Capan-2 (tuyến tụy) [5–7] Hoạt tính ức chế cao số hoạt chất biết đến trước C75, EGCG curcumin [8] Tuy nhiên, việc sử dụng α-MG có hai hạn chế lớn làm ảnh hưởng tới khả ứng dụng điều trị bệnh Thứ nhất, tính tan nước hợp chất (2,03 x 10−4 mg/L) [9] Do môi trường nội ngoại bào phần lớn nước, việc sử dụng α-MG dạng tự nhiên điều trị cho hiệu thấp [10] Thứ hai, hoạt tính gây độc mạnh α-MG ảnh hưởng tới tế bào lành, gây độc tính sử dụng [11] Chính vậy, việc ứng dụng α-MG điều trị ung thư nhiều hạn chế Để giải vấn đề này, liposome MỞ ĐẦU Mangosteen (quả măng cụt) loại trái phổ biến khu vực châu Á, tiếng với hương vị nhiệt đới đặc trưng Măng cụt từ lâu sử dụng y học với nhiều công dụng khác hỗ trợ điều trị chấn thương, nhiễm trùng da đau bụng [1] αMangostin (α-MG), hoạt chất có màu vàng phân lập từ măng cụt lần vào năm 1855, biết đến xanthone chiết xuất từ vỏ quả, có hoạt tính sinh học cao khả chống viêm [2], chống oxi hóa [3] tiêu diệt tế bào ung thư [4] Nhiều nghiên cứu ra, α-MG có khả gây ức chế hoạt động hình thành khối u nhiều loại tế bào HT-29 (ruột kết), 218 coi giải pháp có khả khắc phục hạn chế α-MG Liposome cấu trúc dạng túi gồm nhiều lớp màng kép phospholipid bao xung quanh khoang chứa nước Việc sử dụng liposome có nhiều ưu điểm vượt trội tính tương thích sinh học cao sinh khả dụng tốt [12] Hơn nữa, thành phần màng liposome cịn thay đổi để kiểm sốt q trình vận chuyển kiểm sốt giải phóng phân tử thuốc [13,14] Hiện tại, nhiều loại thuốc dạng liposome cho phép Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), ví dụ Myocet (ung thư vú), Doxil (ung thử tử cung),và Marqibo (bệnh bạch cầu tăng lympho bào cấp tính) [15, 16] Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành bào chế hệ phân tán liposome từ Lecithin đậu nành (Lec) Cholesterol (Chol) Hợp chất αMG phân lập từ vỏ măng cụt Một số đặc điểm liposome chứa α-MG kích thước, số phân bố (polydispersity index - PDI) liệu suất liposome hóa α-MG nghiên cứu Sau đó, hệ phân tán liposome chứa α-MG thử nghiệm hoạt tính tế bào A549 để đánh giá hiệu giải pháp điều trị bệnh α-MG THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên vật liệu Lecithin đậu nành (Lec) tách chiết từ hạt đậu nành Cholesterol (Chol) mua hãng Sigma Aldrich (Hoa Kỳ) Màng polycarbonate kích thước lỗ 100 nm cung cấp Avanti® Polar Lipids (Alabaster, US) α-MG phân lập từ vỏ măng cụt phịng thí nghiệm Ngồi ra, số hố chất khác chloroform đặt mua từ cơng ty Chemsol (Việt Nam), methanol Merck (Đức), nước cất từ máy cất nước hai lần hãng Sartorius (Đức), màng thẩm tách kích thước lỗ 14.000 Da hãng Sigma Aldrich (Hoa Kỳ) Tế bào ung thư phổi (A549) American Type Culture Collection, (Manassas, VA, USA), Ethyl acetate (EtOAc), n-Hexan, Methanol (MeOH), Chloroform (CHCL3), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS) PenicillinStreptomycin (PS) mua SigmaAldrich (St Louis, Missouri, USA) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết phân lập α-MG từ vỏ măng cụt Vỏ măng cụt thu thập sấy khô nghiền thành kg bột mịn trước ngâm dung dịch ethanol (2L x lần) nhiệt độ phòng ngày Hỗn hợp dung dịch thu lọc làm khô áp suất thấp thu phần cặn có màu nâu sẫm khối lượng khoảng 154,3 g Sau hòa tan vào nước cất, hỗn hợp chiết n - hexan (2 lần × 250 mL) ethyl acetate (EtOAc) (4 lần × 250 mL) Dịch chiết n -hexan EtOAc hấp phụ chạy sắc ký cột với hỗn hợp dung mơi n - hexan/EtOAc (tỷ lệ thể tích từ 10:0 đến 2:1) Sắc ký cột sử dụng để phân đoạn tinh chế α-MG dẫn xuất cách sử dụng cột thủy tinh (đường kính cm; chiều dài 30 cm) chứa đầy silica gel có kích thước 230-400 mesh thu phân đoạn chiết (E1 - E4) Phần E3 (38,5 g) kết tinh lại thu lấy α-mangostin (2,2 g) phần (E-3.2 E-3.3) Phân đoạn E-3.2 (4,26 g) tiếp tục chạy sắc ký với hỗn hợp dung mơi n - hexan/EtOAc (tỷ lệ thể tích 3:1), thu 4,26 g α-MG Tương tự với phân đoạn E-3.3 chạy sắc ký cột với hỗn hợp dung môi n - hexan/axeton (5:1) thu αmangostin (7,15 g) Cấu trúc hoá học αmangostin sản phẩm xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân Hiệu suất phân lập αmangostin tính theo cơng thức sau: Hiệu suất = × 100% 2.2.2 Bào chế hệ phân tán liposome chứa αMG Hỗn hợp gồm mL Lec Chol (với tỷ lệ số mol tương ứng 1:1; 4:1; 8:1; 16:1) 100 μL α-MG 0,003 M chuẩn bị ống eppendorf 1,5 mL Lắc 60 giây để trộn thành phần với Hỗn hợp sau chuyển sang bình cầu 100 mL, cô quay để từ từ loại bỏ dung mơi (nhiệt độ bể 30°C, áp suất bình 600 mbar, tốc độ quay 2) Một lớp màng mỏng gồm Lec, Chol, α-MG hình thành đáy bình Bổ sung 219 mL nước cất siêu âm bể (40°C, phút) để bóc lớp màng mỏng khỏi đáy bình Kết thu huyền phù đục, có chứa liposome mang α-MG α-MG tự Để loại bỏ α-MG tự hỗn hợp, huyền phù liposome thô thẩm tách Liposome chuyển từ bình cầu sang màng thẩm tách 14000 Dalton (20 cm x 10 cm) bịt kín hai đầu để cốc thuỷ tinh dung tích 2L Thể tích nước cất dùng L Quá trình thẩm tách kéo dài 24 giờ, nước thay Để giảm độ đa phân tán đưa liposome kích thước chung, hỗn hợp đùn ép qua màng polycarbonate 100 nm Sau đùn ép xong, mẫu chuyển sang lưu giữ ống eppendorf để nhiệt độ phịng (25°C) Ngồi ra, liposome trắng thực quy trình tương tự khác thay dung dịch chứa α-MG dung dịch đệm phosphate 2.2.3 Xác định hiệu suất liposome hóa Để xác định hiệu suất liposome hóa, mẫu liposome chuyển sang bình cầu 100 mL quay (nhiệt độ bể nước 45°C, áp suất bình mBar, tốc độ quay 3) tất nước loại bỏ khỏi mẫu Lớp màng lipid - α-MG cịn lại đáy bình hịa tan mL hệ dung môi MeOH/CHCl3 (3/1; v/v) siêu âm bể (2 phút, 45°C) để phá hủy liposome giải phóng α-MG chứa bên Sau đó, 100 μL dung dịch chuyển vào lọ thủy tinh mL, bổ sung thêm 2900 μL MeOH/CHCl3 (3/1; v/v), lắc 30 giây Dung dịch chuyển từ lọ sang cuvette thủy tinh mL, độ hấp thụ đo 243 nm, với cuvette chuẩn chứa mL MeOH/CHCl3 (3/1; v/v) Từ giá trị độ hấp thụ quang tính nồng độ α-MG mẫu phương trình đường chuẩn Từ giá trị nồng độ α-MG mẫu giá trị nồng độ α-MG ban đầu, tính hiệu suất liposome hóa 2.2.4 Nghiên cứu độ ổn định hệ phân tán liposome chứa α-MG Các liposome chứa α-MG bảo quản theo dõi kích thước hạt độ phân tán kích thước hạt sau ngày, ngày, ngày 10 ngày kỹ thuật tán xạ ánh sáng động máy Horiba SZ-100 25⁰C Khả giải phóng α-MG từ liposome môi trường pH 5,5 7,4 khảo sát phương pháp thẩm tách Các liposome chứa αMG đặt vào túi thẩm tách có trọng lượng phân tử 14 000 Da Hệ đặt dung dịch đệm có pH 5,5 7,4 có bổ sung 0,5% Tween 80 khuấy với tốc độ 100 vòng/phút 37⁰C Sau khoảng thời gian cụ thể, mL hỗn hợp rút thay thể tích đệm Các mẫu phân tích máy quang phổ để tính lượng tích lũy α-MG giải phóng Kết thu giá trị trung bình lần lặp lại 2.2.5 Thử nghiệm hoạt tính hệ phân tán liposome chứa α-MG Tế bào ung thư phổi (A549) nuôi cấy môi trường DMEM có bổ sung FBS 10% PS 1% Tế bào nuôi tủ ấm 37⁰C với nồng độ CO2 trì 5% Độ độc tính α-mangostin, liposome chứa αmangostin đánh giá khảo nghiệm MTT ((3-(4,5-dimethyl-2thiazolyl)-2,5diphenyl-2H-tetrazolium bromide)) Cụ thể, tế bào gieo với nồng độ × 104 tế bào giếng đĩa 96 giếng bổ sung 100 μL môi trường nuôi cấy Sau 24 dung dịch α-mangostin, liposome chứa αmangostin nhóm đối chứng có nồng độ từ đến 20 μM thêm vào đĩa nuôi cấy ủ 24 Sau đó, mơi trường giếng loại bỏ bổ sung vào 50 μL dung dịch thuốc thử MTT 1,0 mg/mL Tế bào ủ tiếp 37°C trước đọc kết hệ thống DTX 880 Backman Coulter (Hoa Kỳ) KẾT QUẢ VÀ KHẢO LUẬN 3.1 Chiết xuất α-MG từ vỏ măng cụt α-Mangostin phân lập từ chiết xuất EtOAc loại bột vơ định hình màu vàng với điểm nóng chảy 180-181⁰C (lý thuyết 181,6-182,6⁰C) [17] Từ phổ 1H NMR hình 1, đỉnh đơn vị trí δ = 13,80 (1-OH) cho thấy diện nhóm hydroxyl phân tử Hai tín hiệu mức đơn δ = 6,25 δ = 6,80 đặc trưng cho hai proton thơm cô lập vị trí C-4 C-5 Trong đó, hai đỉnh tín hiệu đơi δ = 3,46 (J = 7,5 Hz) δ = 4,10 (J = 7,3 Hz) cho nhóm methylene benzylic C-11 C-16 Một đỉnh δ = 5,26 tích hợp với hai proton proton vinylic C-12 C-17 Ngồi ra, bốn tín hiệu mức 1,71; 1,82; 1,84 1,68 H-14, H-15, H-19 H-20 Từ kết so sánh 220 bảng thấy hợp chất thu có tín hiệu quang phổ tương đồng với tín hiệu thu phổ 1H NMR ɑ-MG báo cáo nghiên cứu Vivi cộng [18] Tổng lượng α-mangostin từ kg pericarp khô G mangostana tính 18,62 g, để thu 1,86% với pericarp khô 0,38% với trái tươi Bảng Các tín hiệu phổ 1H NMR hợp chất phân lập từ vỏ măng cụt nghiên cứu α-mangostin từ nghiên cứu đối chứng α-mangostin [18] Vị trí Hợp chất 13,80, s 13,80, s (OH) 6,13, s (OH) 6,12, br (OH) 6,25, s 6,27, s 4a 6,80, s 6,81, s 6,30, s (OH) 6,27, s (OH) 11 3,46, d (J=7.5 Hz) 3,45, d (J=7,3 Hz) 12 5,26, t (J=7.0 Hz) 5,25, t (J=7,3 Hz) 14 1,71, s 1,75, s 15 1,82, s 1,81, s 16 4,10, d (J=7,3 Hz) 4,07, d (J=7,0 Hz) 17 5,26, t (J=7 Hz) 5,28, t (J=7,3 Hz) 19 1,84, s 1,82, s 20 1,68, s 1,67, s 3-OMe 7-OMe 3,81, s 3,79, s Hình Phổ 1H NMR hợp chất phân lập từ vỏ măng cụt 3.2 Hệ phân tán liposome chứa α-MG Các liposome chứa α-MG thu sau bào chế có kích thước 110,7 nm, 101,6 nm, 115,5 nm 118,0 nm ứng với tỷ lệ Lec/Chol 1/1, 4/1, 8/1 16/1 Độ phân tán mẫu 0,12; 0,14; 0,14 0,23 Hiệu suất liposome hóa (Encapsulation Efficiency - EE) tính sau: EE(%) = (Fs/Fi) × 100, Fs lượng α-MG liposome sau thẩm tách (mol), Fi lượng α-MG dùng ban đầu (mol), cố định tất mẫu Kết cho thấy hiệu suất liposome hoá tỷ lệ tương ứng 52,8%; 57,1%; 56,1% 55,3% Các hiệu suất cho thấy tiềm sử dụng liposome để vận chuyển α-MG tốt nhằm giải đề hạn chế α-MG điều trị bệnh, điều trị ung thư Hình Sự thay đổi kích thước liposomes theo thời gian với tỷ lệ Lec/Chol (tỷ lệ mol 1/1), Lec/Chol (tỷ lệ mol 4/1) Lec/Chol (tỷ lệ mol 8/1) Lec/Chol (tỷ lệ mol 16/1) 221 vòng 12h với tỉ lệ giải phóng thuốc mơi trường pH= 5,5 35,1% pH = 7,4 27,2 % Sau 24 giờ, khả giải phóng αMG từ liposome pH = 7,4 5,5 40,2 % 56,4% Sau đó, việc giải phóng α-MG hai mức pH bị chậm lại trì với tốc độ ổn định 96 Tuy nhiên khả giải phóng thuốc pH = 5,5 đạt 70% lớn so với pH = 7,4 Điều cho thấy liposome làm việc hiệu với tế bào ung thư giải phóng phân tử α-MG xung quanh tế bào thường 3.3 Đánh giá độ ổn định in vitro hệ phân tán liposome chứa α-MG Độ ổn định liposome đánh giá dựa giá trị kích thước bình qn, hệ số đa phân tán (PDI) Phương pháp sử dụng tán xạ ánh sáng động (DLS), thực máy Horiba SZ-100 25°C Ngày đo ngày mẫu chuẩn bị Các mẫu đo ngày 4,7 10 để theo dõi thay đổi Kết đo trình bày hình Các giá trị kích thước bình qn sử dụng làm tiêu chí đánh giá kích thước liposome Mẫu liposome có tỷ lệ Lec/Chol 1/1 có giá trị kích thước trung bình tương đối ổn định Sau ngày, kích thước trung bình giảm nhẹ từ 110 nm xuống cịn 103,3 nm Sau 10 ngày, kích thước trung bình mẫu 109,7 nm Trong mẫu liposome có tỷ lệ Lec/Chol 16/1 cho kết kích thước độ phân tán kích thước hạt lớn giữ 10 ngày Kích thước hạt tăng từ 118,0 nm lên 132,3 nm DPI tăng từ 0,23 lên 0,27 Điều cho thấy mẫu liposome có tỷ lệ Lec/Chol 16/1 có hàm lượng chất làm bền cholesterol thấp nên bền Hai tỷ lệ Lec/Chol 4/1 8/1 cho liposome có kích thước ổn định theo thời gian Tuy nhiên, mẫu liposome có tỷ lệ Lec/Chol 8/1 chọn để tiếp tục nghiên cứu cần lượng cholesterol nhỏ để bào chế, phù hợp với khả giải phóng α-MG sử dụng Các nghiên cứu ung thư trước cho thấy, mơi trường xung quanh tế bào ung thư có pH thấp môi trường xung quanh tế bào thường [19] Với tế bào thường, môi trường pH xung quanh 7,4 tế bào ung thư pH 6,0 môi trường giúp tế bào ung thư phát triển mạnh Đây yếu tố để xác định khả làm việc hệ thống vận chuyển thuốc Chính vậy, nghiên cứu đánh giá giải phóng liposome chứa α-mangostin lưu giữ dung dịch đệm có pH = 7,4 5,5 Theo hình 3, thấy đầu tiên, mơi trường có độ pH 5,5 cho thấy tỷ lệ giải phóng α-MG cao so với môi trường pH 7,4 tỷ lệ chênh lệch không đáng kể Sự khác biệt thấy rõ Hình Kết thử nhiệm khả giải phóng α-mangostin từ liposome chứa α-mangostin dung dịch đệm pH 7,4 5,5 3.4 Thử nghiệm hoạt tính Tế bào A549 sử dụng để nghiên cứu độ độc tính tế bào thơng qua xét nghiệm MTT với thời gian ủ 24 Các thử nhiệm tác dụng gây độc tế bào α-MG tự α-MG bọc liposome tế bào A549 thể hình Cả α-MG tự liposome chứa α-MG gây ức chế tăng sinh tế bào cách đáng kể phụ thuộc vào liều lượng sử dụng Như thấy hình 4, liposome trắng khơng gây độc tế bào cách rõ ràng với 80% tế bào sống sót cho dù nồng độ thử nghiệm lên đến 20 µM Ngược lại, liposome chứa α-MG α-MG tự có suy giảm đáng kể khả tồn tế bào nồng độ từ µM đến 20 µM Ở hai nồng độ 0,1 µM µM, thấy khả tiêu diệt tế bào α-MG tự tốt so với liposome chứa α-MG Tuy nhiên từ nồng độ µM, khả sống sót tế bào liposome 222 chứa α-MG thấp so với α-MG tự với khả sống sót tế bào tương ứng 50,3% so với 56,7 % Đối với α-MG tự do, nồng độ 10 µM 20 µM, khả sống sót tế bào 55% 41% Trong đó, khả liposome chứa α-MG 32% 27% Có khác biệt có ý nghĩa (p