Nghiên cứu nhận dạng pháp y bằng phương pháp hình thái học và phân tích ADN một số locus STR ở người Việt

Nghiên cứu nhận dạng pháp y bằng phương pháp hình thái học và phân tích ADN một số locus STR ở người Việt

1 Bộ giáo dục v đo tạo Bộ quốc phòng học viện quân y Nguyễn văn Lợi Nghiên cứu nhận dạng pháp y phơng pháp hình thái học v ph©n tÝch ADN mét sè locus STR ë ng−êi ViƯt Chuyên ngành: Giải phẫu ngời Mà số: 62.72.01.10 Tóm tắt luËn ¸n tiÕn sÜ y häc Hμ néi - 2009 Công trình đợc hoàn thành Học Viện Quân Y Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: PGS.TS Ngun Träng Toàn TS Nguyễn Trần Chiến Phản biện 1: GS.TS Vũ Ngọc Thụ Phản biện 2: GS.TS Lê Đình Lơng Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Văn Huy Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà nớc họp tại: Học viện Quân y vào hồi 30 ngày 24 tháng năm 2009 Có thể tìm hiểu luận án tại: Th viện quốc gia Th viện Học Viện Quân Y Đặt vấn đề Nhận dạng cá thể ngời pháp y trình phân tích đặc điểm đặc trng ngời để xác định cá thể nhóm đối tợng định Trong trình giám định pháp y nhận dạng cá thể bớc quan trọng nhằm xác định xác cá thể trớc tiến hành giám định thơng tổn Có nhiều phơng pháp nhận dạng khác Việc sử dụng phơng pháp tuỳ thuộc vào trờng hợp cụ thể Phơng pháp hình thái học vào đặc điểm hình thái thể ngời, phơng pháp phân tích ADN dựa đặc trng cấu trúc tính đa hình phân tử ADN để nhận dạng cá thể ngời Phơng pháp ADN có độ xác cao áp dụng đợc cho nhiều loại mẫu sinh phẩm pháp y, đặc biệt với mẫu sinh phẩm không nguyên vẹn, số lợng ít, chất lợng bị suy giảm - mà phơng pháp hình thái học thực đợc Việt Nam nhiều nhà khoa học có công trình nghiên cứu nhận dạng cá thể ngời hình thái học locus ADN phục vụ cho giám định nhận dạng pháp y hình Nhng số lợng công trình nghiên cứu đợc ứng dụng nhận dạng pháp y cha nhiều, công tác nhận dạng hình thái häc ch−a thùc sù thèng nhÊt vµ trë thµnh hƯ thống, cha có tác giả công bố nghiên cứu locus TH01 D16S539 ngời Việt (Kinh) ứng dụng nhận dạng cá thể Vì để không ngừng hoàn thiện kỹ thuật, làm chủ công nghệ, đồng thời triển khai đợc rộng rÃi, tiết kiệm thời gian, kinh phí đem lại hiệu cao công tác giám định nhận dạng, tiến hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu: - Đánh giá hiệu nhận dạng cá thể phơng pháp hình thái học - Tối u hoá thành phần phản ứng PCR đơn, PCR phức, tạo thang allele khảo sát tần suất phân bố allele hai locus TH01 D16S539 ngời Việt (Kinh) sử dụng nhận dạng cá thể ý nghÜa thùc tiƠn vμ ®ãng gãp cđa luận án Đề tài có tính cấp thiết thực tiễn, đà có đóng góp cho khoa học nhận dạng cá thể ngời pháp y Việt Nam Về kết luận án: Đà đánh giá đợc hiệu quả, mức độ, phạm vi giá trị nhận dạng cá thể ngời phơng pháp nhận dạng thông qua khám nghiệm hình thái, qua đặc điểm mô tả, phơng pháp phân tích vân da, phơng pháp lồng ảnh gơng bán mạ, phơng pháp phân tích ADN phơng pháp kết hợp hình thái phân tích ADN Đà có đóng góp cho công tác nhận dạng cá thể kỹ thuật ADN: tối u hoá đợc phản ứng PCR đơn, PCR phức hợp hai locus, tạo đợc thang allele khảo sát tần suất phân bố allele hai locus TH01 D16S539 ngời Việt (Kinh) sử dụng nhận dạng cá thể Những kết đóng góp mang tính hệ thống làm sở để hoàn thiện phơng pháp hình thái học ADN nhận dạng cá thể nhằm nâng cao hiệu công tác giám định ph¸p y ë ViƯt Nam CÊu tróc cđa ln ¸n Luận án gồm 140 trang Phần đặt vấn đề trang Chơng 1: Tổng quan, 29 trang; chơng 2: Đối tợng phơng pháp nghiên cứu, 18 trang; chơng 3: kết nghiên cứu, 31 trang; chơng 4: bàn luận, 35 trang Phần kết luận trang, kiến nghị trang Luận án có 19 bảng, biểu đồ, 33 hình, 149 tài liệu tham khảo (tiếng việt 29, tiếng Anh 107, tiÕng §øc 3, tiÕng Nga 3, web internet 7) Ch−¬ng 1: Tỉng quan tμi liƯu 1.1 Nhận dạng cá thể giám định pháp y Công tác nhận dạng việc so sánh thuộc tính, đặc điểm mẫu sinh phẩm thu đợc với tiêu chuẩn, tiêu đà biết để xác định cá thể so sánh thuộc tính, đặc điểm mẫu nghi ngờ với mẫu đối chứng để xem mức độ phù hợp hay không phù hợp xác định chúng có nguồn gốc hay không Nếu đặc tính đợc xác định mẫu nghi ngờ mẫu so sánh giống điều có nghĩa hai mẫu có chung nguồn gốc Nếu đặc tính khác có nghĩa mẫu nghi ngờ mẫu so sánh có nguồn gốc khác Độ tin cậy phơng pháp nhận dạng đợc tính toán thông qua tần suất xuất dấu hiệu nhận dạng quần thể xem xét Vì việc nghiên cứu tần suất phân bố dấu hiệu nhận dạng quần thể ngời định đóng vai trò quan träng Khi tÇn st xt hiƯn qn thĨ dấu hiệu cao giá trị nhận dạng thấp Ngợc lại, dạng gặp (tần số thấp) giá trị nhận dạng cao nghĩa mẫu thuộc vài đối tợng quần thể nghiên cứu 1.2 phơng pháp nhận dạng cá thể ngời pháp y 1.2.1 Phơng pháp hình thái học Phơng pháp dựa đặc điểm hình thái học mang tính đặc trng thể ngời để nhận dạng Các phơng pháp gồm: * Nhận dạng cá thể ngời thông qua đặc điểm mô tả Phơng pháp thông dụng, đợc ứng dụng rộng rÃi không lĩnh vực pháp y hình mà nhiều lĩnh vực khác Trong pháp y hình phơng pháp đợc ứng dụng để xác định nạn nhân, truy tìm tung tích kẻ phạm tội, truy tìm đối tợng nghi ngờ dựa vào đặc điểm hình thái khuôn mặt, mắt, mũi, môi, miệng, tai Tuy nhiên, độ xác phơng pháp phụ thuộc nhiều vào tính toàn vẹn mẫu giám định, mức độ biến đổi khuôn mặt yếu tố chủ quan ngời mô tả * Phơng pháp ghép ảnh Chủ yếu đợc sử dụng để phác thảo nhanh hình dạng khuôn mặt đối tợng nghi ngờ dựa ảnh có sẵn đà đợc phân loại Phơng pháp đòi hỏi phải tập hợp đợc album ảnh lớn, phân loại đày đủ chi tiết đem lại hiệu Độ xác phụ thuộc nhiều vào yếu tố chủ quan ngời mô tả ảnh có sẵn * Phơng pháp tái tạo lại khuôn mặt từ hộp sọ Phơng pháp nhằm phục chế lại hình ảnh khuôn mặt ngời trớc lúc chết xơng sọ đất sét kỹ thuật vi tính trờng hợp có mẫu xơng sọ giám định mẫu so sánh Yêu cầu phơng pháp xơng sọ phải tơng đối nguyên vẹn phải xây dựng đợc mối liên hệ phần khuôn mặt mối tơng quan chặt chẽ độ dày, mỏng mô mềm vùng mặt theo độ tuổi, giới tính *Phơng pháp lồng ảnh với xơng sọ Đợc áp dụng trờng hợp mẫu nhận dạng xơng hộp sọ tơng đối nguyên vẹn có ảnh chân dung ngời cần nhận dạng Có thể tiến hành lồng ảnh với xơng sọ hệ thống gơng bán mạ kỹ thuật vi tính Phơng pháp dễ tiến hành việc điều chỉnh kích thớc t sọ theo ảnh chân dung * Phơng pháp vân da Phơng pháp dựa đặc điểm vân da đầu ngón tay cá thể Phơng pháp nhận dạng qua so sánh đờng vân đợc sử dụng quan cảnh sát hình quan pháp y ë n−íc ta cịng nh− trªn thÕ giíi ViƯc nhËn dạng xác định xác cá thể trở nên dễ dàng có hồ sơ vân da lu trữ có đầy đủ dấu vân da tất mời đầu ngón tay 1.2.2 Cơ sở khoa học phân tích ADN nhận dạng cá thể Đặc tính cá thể đặc điểm hình thái mà thể cấu trúc phân tử ADN Nhận dạng cá thể ngời qua phân tích ADN chủ yếu đợc thực dấu thị ADN (marker DNA), khác trình tự kích thớc đoạn ADN cá thể Thực chất khác số lợng trình tự xắp xếp loại nucleotid (A, T, G, C) phân tử ADN cá thể Đó sở để xác định cá thể Nhiễm sắc thể đợc bảo toàn hệ đợc di truyền từ hệ qua hệ khác Con thừa hởng đặc tính di truyền thông qua 23 nhiễm sắc thể từ tinh trùng bố 23 nhiễm sắc thể từ tế bào trứng mẹ Đó sở để xác định quan hệ huyết thèng cha (mĐ) - 1.3 locus ADN sư dơng nhận dạng cá thể ngời 1.3.1 Khái niệm đoạn lặp STR Phân tử ADN tế bào có chứa trình tự lặp lại Trên locus ADN cá thể khác có số lợng trình tự lặp lại khác Các đoạn ADN có trình tự lặp từ 10 - 100 bp gọi lµ VNTR (variable number of tandem repeats), vÝ dơ locus D1S80 có đoạn lặp bội số 16 nucleotid, locus chứa allele từ số đơn vị lặp lại 14 lần đến 41 lần Trình tự lặp lại GAGGA CCACC AGGAA G Các đoạn ADN có cấu trúc lặp lại từ - bp đợc gọi đoạn lặp lại ngắn - STR (short tandem repeat) Các cấu trúc VNTR hay STR đợc di truyền qua hệ, mang tính bảo thủ cao tính đặc trng cá thể Để locus STR đợc sử dụng cho mục đích nhận dạng xác định cá thể phải thỏa mÃn yêu cầu là: - Khả phân biệt cao (lớn 0,9) dạng dị hợp tử quan sát đợc quần thể lớn 70% - Nằm vùng nhiễm sắc thể riêng biệt - Dễ dàng khuếch đại PCR - Đặc tính trợt allele PCR thấp - Đoạn ADN đợc khuếch đại khoảng 90 - 500 bp 1.3.2 Locus STR sử dụng nhận dạng cá thĨ ng−êi HƯ thèng locus STR sư dơng nhËn dạng đợc chia làm loại: - Loại thứ nhất: trình tự lặp lại đơn giản gồm loại trình tù lỈp, vÝ dơ: TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539 - Loại thứ hai: trình tự lặp lại đơn giản nhng số allele không thực đồng nhất, ví dụ: TH01, D18S51, D7S820 - Loại thứ ba: trình tự lặp lại kết hợp với allele không đồng nhất, ví dụ: vWA, FGA, D3S1358, D8S1179 - Loại thứ t: trình tự lặp lại phức tạp, ví dụ: D21S11, LPL * Locus TH01 có trình tự lặp lại nucleotide (TCAT) n»m ë vïng intron cđa gen Tyrosine hydroxylase trªn nhánh ngắn NST 11 Locus mang tên TH01 xuất phát từ chữ đầu enzym Tyrosine hydroxylase vùng intron (hay 01) TH01 mang tên khác TC11 HUMTH01 Locus TH01 thuộc loại thứ hai hệ thống STR sử dụng nhận dạng cá thÓ TH01 bao gåm allele (allele 11) xuÊt quần thể ngời có biến thể allele số 10 đợc gọi allele 9.3, allele số 10 bị bazơ * Locus D16S539 thc lo¹i thø nhÊt hƯ thèng STR Chóng cã trình tự lặp lại nucleotide (GATA) nằm nhánh dài NST 16 vị trí trình tự đơn số 539 Vì locus không nằm vùng mà hoá nhiễm sắc thể 16 nên mang tên D16S539 Chúng có 11 allele, allele số allele số đến allele 15 (rất allele số số 7) Chơng 2: Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tợng nghiên cứu 2.1.1.Đối tợng nghiên cứu phơng pháp giám định nhận dạng 193 cá thể ngời Việt đợc giám định nhận dạng Viện Pháp Y Quân đội, thời gian từ 2003 - 2007, có 188 nam nữ, tuổi từ 18 - 50 Tiêu chuẩn lựa chọn dựa vào phơng pháp giám định nhận dạng đà tiến hành: Phơng pháp nhận dạng hình thái học: 168 Phơng pháp nhận dạng phân tích ADN: 23 Phơng pháp nhận dạng hình thái học kết hợp ADN: 2.1.2 Đối tợng nghiên cứu số locus STR ngời Việt 280 mẫu máu tĩnh mạch ngời khoẻ mạnh quan hệ huyết thống đợc lấy đợt khám sức khoẻ ngời liên quan đến nạn nhân trận bÃo Chan chu (5/2006) Viện Pháp Y Quân đội cung cấp 2.2 Phơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phơng pháp nhận dạng cá thể ngời hình thái học 2.2.1.1 Xác định độ tuổi xơng sọ Sử dụng phơng pháp xác định độ tuổi xơng sọ Broca 2.2.1.2 Xác định giới tính xơng sọ Xác định giới tính xơng sọ dựa đặc điểm giới tính thể xơng hàm dới, gờ ổ mắt, xơng gò má, xơng chũm, vùng chẩm, vòm miệng, hốc mũi 2.2.1.3 Nhận dạng cá thể ngời đặc điểm mô tả Dựa phân loại hình thái khuôn mặt, dạng trán, lông mày, mắt, mũi, miệng, môi, tai 2.2.1.4 Phơng pháp lồng ảnh hệ thống gơng bán mạ Đặt xơng sọ, ảnh chân dung nạn nhân, máy ảnh, gơng bán mạ gơng phẳng theo sơ đồ đà định sẵn Đánh dấu điểm xơng sọ ảnh chân dung, điều chỉnh xơng sọ ảnh chân dung cho điểm đánh dấu trùng khớp với ảnh xơng sọ cách quan sát qua gơng bán mạ 2.2.1.5 Nhận dạng cá thể ngời vân da Phóng to in vân da cần nhận dạng in vân da lu trữ lên kích cỡ Đánh dấu điểm hai in vân da đặt chồng lên quan sát Nếu trùng khít tiếp tục đánh dấu điểm khác đặt chồng lên quan sát 10 2.2.2 Nghiên cứu locus TH01 D16S539 ngời Việt (Kinh) 2.2.2.1 Phơng pháp tách chiết ADN phenol/chloroform Phơng pháp tách chiết ADN từ máu toàn phần theo quy trình tách chiết AFDIL Comey C.T 2.2.2.2 Phơng pháp PCR Thành phần PCR bao gồm: ADN khuôn; cặp mồi đặc hiệu locus; dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP); ADN - polymerase chịu nhiệt; dung dịch đệm (Buffer) MgCl2 PCR đợc thực qua giai đoạn chu kỳ: biến tính, gắn mồi tổng hợp Số chu kỳ PCR 25 - 40 Trình tự måi TH01: 5'- GTG ATT CCC ATT GGC CTG TTC CTC-3' 5'- GTG GGC TGA AAA GCT CCC GAT TAT-3' Tr×nh tù måi D16S539: 5'- GAT CCC AAG CTC TTC CTC TTC C-3' 5'- CGT TTG TGT GTG CAT CTG TAA G-3' 2.2.2.3 Phơng pháp điện di phát băng ADN Điện di sản phẩm PCR gel agarose nhuộm ethidium bromide để kiểm tra Điện di phân tách sản phẩm PCR gel polyacrylamide biến tính 5% nhuộm bạc để xác định kiểu gen cá thể 2.2.2.4 Phơng pháp chế tạo thang allele Phơng pháp chế tạo thang allele dựa kết hợp allele đợc lựa chọn nghiên cứu quần thể Các allele đợc pha trộn khuếch đại đồng thời để tạo sản phẩm PCR có chứa allele chung cần thiết locus STR Các bớc tiến hành chế tạo thang allele bao gồm: - Khảo sát tìm kiếm allele locus ADN nghiên cứu - Lựa chọn tiến hành phản ứng PCR allele cần thiết - Tinh allele - Xác định allele phơng pháp giải trình tự - Tạo thang allele phơng pháp trộn mẫu PCR 13 cho phép xác định cá thể trờng hợp khuôn mặt tử thi nguyên vẹn, cha bị biến đổi đặc điểm mô tả đợc phân tích cách chi tiết, có hệ thống Trong trờng hợp khuôn mặt tử thi đà bị biến đổi, phần khuôn mặt bị biến dạng tách rời nhận dạng cá thể đặc điểm mô tả khó khăn khả xác định cá thể không cao cần phải tiến hành phơng pháp nhận dạng khác để có kết luận cuối 3.1.7 Nhận dạng cá thể phơng pháp vân da Qua trờng hợp xác định cá thể phơng pháp vân da, thấy: Nhận dạng qua so sánh vân da phơng pháp thờng đợc tiến hành giám định nhận dạng cá thể áp dụng trờng hợp có mẫu vân da giám định mẫu vân da lu trữ Việc xác định cá thể trở nên dễ dàng nhóm đối tợng đợc khu trú có giới hạn Kết trùng khít đặc điểm vân da mẫu giám định mẫu so sánh cho phép xác định xác cá thể 3.1.8 Nhận dạng cá thể phơng pháp phân tích ADN Chúng đà sử dụng locus TH01 D16S536 nghiên cứu đợc bên cạnh locus khác để phân tích ADN mẫu giám định nhận dạng Qua 23 trờng hợp nhận dạng phơng pháp phân tích ADN thấy: - Phơng pháp đợc áp dụng trờng hợp tiến hành giám định nhận dạng phơng pháp hình thái học nhận dạng phơng pháp hình thái học nhng cha xác định đợc cá thể - Phơng pháp áp dụng với phần lớn mẫu sinh phẩm pháp y mẫu so sánh mẫu gián tiếp (mẫu ngời có quan hệ huyết thống) mẫu so sánh trực tiếp (mẫu sinh phẩm nạn nhân đợc lu trữ) - Phơng pháp phân tích ADN cho phép xác định xác cá thể 14 3.2 Nghiên cứu locus TH01 D16S539 sử dụng nhận dạng cá thể 3.2.1 Kết tối u hóa thành phần điều kiện PCR đơn locus TH01 D16S539 3.2.1.1 Tối u nồng ®é dNTPs cđa PCR ®¬n locus Nång ®é dNTP 0,2mM cho sản phẩm PCR băng ADN gọn, rõ nét không xuất băng phụ Vậy nồng độ dNTP 0,2 mM thích hợp cho PCR locus TH01 D16S539 3.2.1.2.Tối u nồng độ MgCl2 PCR đơn locus Nồng độ 1,5mM 2mM cho sản phẩm PCR băng ADN rõ nét, gọn không xuất băng phụ Vậy nồng độ MgCl2 1,5 - mM thích hợp cho phản ứng PCR locus TH01 D16S539 3.2.1.3 Tối u hàm lợng ADN khuôn PCR đơn locus Với locus D16S539 hàm lợng ADN khuôn 25 ng 50 ng 25l thể tích phản ứng thích hợp cho phản ứng PCR locus D16S539 Với locus TH01 hàm lợng ADN khuôn từ 10 ng đến 50 ng 25l thể tích phản ứng thích hợp cho phản øng PCR locus TH01 3.2.1.4 Tèi −u nång ®é måi locus TH01 D16S539 Nồng độ mồi 0,2M 0,24 M thích hợp cho PCR đơn locus D16S539 locus TH01 3.2.1.5 Tối u hóa điều kiện nhiệt độ gắn mồi TH01 D16S539 Nhiệt độ gắn mồi locus TH01 tèi −u lµ 65,60C NhiƯt độ gắn mồi locus D16S539 tối u từ 64 - 660C 3.2.2 KÕt qu¶ tèi −u hoá thành phần điều kiện PCR phức hợp hai locus TH01 - D16S539 3.2.2.1 Tèi −u nång ®é dNTPs PCR phức hợp hai locus Với nồng độ dNTPs 0,3 mM thích hợp cho phản ứng PCR phøc hỵp hai locus TH01- D16S539 15 3.2.2.2.Tèi −u nồng độ dung dịch đệm (buffer) MgCl2 PCR phức hợp hai locus Nồng độ dung dịch đệm (buffer) 1,5 - 2x nồng độ tối u cho PCR phức hợp hai locus TH01 - D16S539 Nồng độ MgCl2 mM nồng độ tối u cho PCR phøc hỵp hai locus TH01 - D16S539 3.2.2.3 Tèi −u Taq - DNA polymerase cđa PCR phøc hỵp hai locus Trong phản ứng PCR phức hợp hai locus TH01 - D16S539 1,5 UI - 2,5UI Taq cho sản phẩm PCR đặc hiệu rõ nét 3.2.2.4 Tèi −u tû lƯ måi cđa PCR phøc hỵp hai locus ThĨ tÝch dung dÞch måi D16S539: måi TH01 víi tỷ lệ 1:1,5 1:2 cho băng ADN rõ nét phù hợp với PCR phức hợp locus 3.2.2.5.Tối u nhiệt độ thời gian gắn mồi cđa PCR phøc hai locus 650C vµ 660C phút điều kiện nhiệt độ gắn mồi phản ứng PCR phức hai locus TH01 D16S539 Trong trình nghiên cứu nhiệt độ 650C hay 660C phút cho sản phẩm PCR khác đôi chút đậm độ băng ADN 3.3 Kết nghiên cứu tạo thang allele chØ thÞ cđa locus th01 vμ d16s539 3.3.1 Tạo thang allele phơng pháp trộn mẫu *Locus TH01: Chúng đà lựa chọn đợc allele từ allele số đến allele số 11 để xây dựng thang allele * Locus D16S539: Chúng đà lựa chọn ®−ỵc allele tõ allele sè ®Õn allele sè 15 để xây dựng thang allele 3.3.2 Tạo thang allele phơng pháp PCR *Locus TH01: Sử dụng kỹ thuật PCR khuếch đại hỗn hợp allele đà tinh ®Ĩ t¹o thang allele chn cho locus TH01 ba thÕ hÖ - Thang allele TH01 cã allele, gåm allele sè 5, 6, 7, 8, 9, 10 vµ 11 - Phơng pháp tạo thang allele TH01 kỹ thuật PCR cho sản phẩm tốt: Các băng ADN gọn, sắc nét, ®Ëm ®é ®ång ®Ịu *Locus D16S539: Sư dơng kü tht PCR khuếch đại hỗn hợp 16 allele đà tinh để tạo thang allele cho locus D16S539 ba hÖ - Thang allele D16S539 cã allele, gåm allele sè 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 vµ 15 - Phơng pháp tạo thang allele D16S539 kỹ thuật PCR cho sản phẩm tốt: Các băng ADN gọn, sắc nÐt, ®Ëm ®é ®ång ®Ịu 15 14 13 12 11 10 Hình 3.11 Kết tạo thang allele locus D16S539 1,2: Thang allele b»ng trén mÉu; 3,4: thang allele PCR thÕ hÖ I 5,6: thang allele PCR thÕ hÖ II; 7,8: thang allele PCR thÕ hÖ III 3.3.3 KÕt xác định allele thang phơng pháp giải tr×nh tù - Allele sè cđa locus D16S539 gåm đoạn lặp GATA - Allele số 13 locus D16S539 gồm 13 đoạn lặp GATA - Allele số locus TH01 gồm đoạn lặp TCAT 3.3.4 So sánh kết phân tích allele mẫu xét nghiƯm theo thang allele cđa chóng t«i víi bé kit hÃng Promega Các mẫu đợc chia làm phần để phân tích độc lập so sánh kết xác định allele phơng pháp với * Locus D16S539 - Kết phân tích locus D16S539 sử dụng thang allele trùng với kết ph©n tÝch allele sư dơng bé kit cđa h·ng Promega - Kết phân tích locus D16S539 sử dụng thang allele cho phép xác định xác kiĨu gen cđa c¸c c¸ thĨ 17 LD 15 14 13 12 11 10 A LD LD 15 14 13 12 11 10 B H×nh 3.14 Điện di đồ phân tích kiểu gen cá thể locus D16S539 b»ng thang allele cđa h·ng Promega vµ cđa chóng t«i A: Thang allele cđa h·ng Promega; B: Thang allele LD: thang allele; Số 1: Cá thĨ cã kiĨu gen 11 -12; Sè 2: C¸ thĨ cã kiĨu gen 11-11; Sè 3: C¸ thĨ cã kiĨu gen 11-12; Sè 4: C¸ thĨ cã kiĨu gen 12-13 * Locus TH01 - Kết phân tích locus TH01 sư dơng thang allele cđa chóng t«i trïng víi kÕt phân tích allele sử dụng kit hÃng Promega - Kết phân tích locus TH01 sử dụng thang allele cho phép xác định xác kiểu gen cá thể 3.4 Kết khảo sát tần suất phân bố allele locus TH01 v D16S539 ngời Việt (Kinh) 3.4.1 Khảo sát tần suất phân bè allele cđa locus TH01 ng−êi ViƯt Trong tỉng sè 280 cá thể đợc khảo sát locus TH01 quần thể ngời Việt, phát đợc allele, đó: - Số cá thể dị hợp tử 222 cá thể, chiếm 79%; đồng hợp tử 58 c¸ thĨ, chiÕm 21% - Allele sè cã sè l−ỵng cao nhÊt: 184 allele, chiÕm 32,86% - Allele sè cã sè l−ỵng thÊp nhÊt: allele, chiÕm 0,54 % - C¸c allele sè 6, 7, 8, 10 11 lần lợt chiếm tỷ lệ 17,50%; 28,75%; 9,46%; 10,18% 0,71% - Khả phân biệt cá thể khả trùng lặp quần thể ngời Việt locus TH01 0,90 0,10 18 Bảng 3.5 Tần suất phân bố allele locus TH01 ngời Việt Allele 10 11 Tæng Sè l−ỵng allele (2n) 98 161 53 184 57 560 Tû lÖ % (n = 280) 0,54 17,50 28,75 9,46 32,86 10,18 0,71 100 * KÕt qu¶ kiĨm tra tần suất phân bố kiểu gen locus TH01 ngời Việt (Kinh) b»ng tiªu chn χ2 ë locus TH01 ng−êi ViƯt thÊy xt hiƯn 20 kiĨu gen (trªn tỉng sè 28 kiểu gen), kiểu gen có số lợng cao - 9: 59 cá thể, chiếm tỷ lƯ 21,07% Víi df = 13, χ2tt < χ2b¶ng (p > 0,05) tần suất phân bố allele locus TH01 ngời Việt phù hợp với phân bố lý thuyết 3.4.2 Khảo sát tần suất phân bố allele locus D16S539 ngời Việt Trong tổng số 279 cá thể đợc khảo sát locus D16S539 ngời Việt, phát đợc allele, đó: - Số cá thể dị hợp tử 220 cá thể, chiếm 79%; đồng hợp tử 59 cá thĨ, chiÕm 21% - Allele sè 11 cã sè l−ỵng cao nhÊt: 172 allele, chiÕm tû lÖ 30,82% - Allele sè 15 cã sè l−ỵng thÊp nhÊt: allele, chiÕm tû lƯ 0,54 % - C¸c allele sè 8; 9; 10; 12; 13 14 lần lợt chiếm tỷ lệ 0,72%; 17,92%; 13,08%; 24,01%; 10,57% 2,33% - Khả phân biệt cá thể khả trùng lặp locus D16S539 ng−êi ViƯt lµ 0,92 vµ 0,08 19 Bảng 3.8 Tần suất phân bố allele locus D16S539 ngời ViƯt Allele Sè l−ỵng allele (2n) Tû lƯ% (n=279) 0,72 100 17,92 10 73 13,08 11 172 30,82 12 134 24,01 13 59 10,57 14 13 2,33 15 0,54 Tỉng 558 100 * KÕt qu¶ kiĨm tra tần suất phân bố kiểu gen locus D16S539 ngời ViƯt b»ng tiªu chn χ2 ë locus D16S539 ng−êi ViƯt xt hiƯn 24 kiĨu gen (trªn tỉng sè 36 kiĨu gen), kiểu gen có số lợng cao 11 - 12: 45 cá thể, chiếm tỷ lệ 16,13% Víi df = 15, χ2tt < χ2b¶ng (p > 0,05) tần suất phân bố allele locus D16S539 ngời Việt phù hợp với phân bố lý thuyết Chơng 4: Bn luận 4.1 Các phơng pháp giám định nhận dạng 4.1.1 Đặc điểm mẫu giám định nhận dạng pháp y Theo Butler, Pierre, Rathbun, Snow: Phơng pháp nhận dạng phụ thuộc mẫu giám định mẫu so sánh thu đợc Trong nhiều trờng hợp phơng pháp hình thái học xác định đợc nửa số cá thể cần nhận dạng Một nửa số lại mẫu giám định thu đợc không cho phép nhận dạng phơng pháp hình thái học thiếu mẫu tơng đơng để so sánh Trong 193 trờng hợp nghiên cứu tỷ lệ sử dụng phơng pháp hình thái học để giám định nhận dạng 87% (168 trờng hợp) Tỷ lệ áp dụng phơng pháp nhận dạng hình thái học cao mẫu 20 giám định nguyên vẹn, có mẫu đối chứng phù hợp để so sánh nhận dạng hình thái học đà xác định đợc cá thể, không cần tiến hành phơng pháp khác Trong trờng hợp tiến hành nhận dạng đợc phơng pháp hình thái học nhận dạng hình thái học nhng cha xác định đợc cá thể áp dụng phơng pháp phân tích ADN 4.1.2 Nhận dạng thông qua khám nghiệm hình thái Trong nghiên cứu này, gặp trờng hợp mẫu giám định xơng sọ nguyên vẹn nhng mẫu tơng đơng để so sánh Thông qua khám nghiệm đà nhận dạng đợc tuổi, giới tính nhng không xác định đợc cá thể thiếu mẫu so sánh Theo Aftandilian, Butler, Pierre, Olivier, Ceccaldi Snow đặc điểm hình thái marker ADN xơng dấu hiệu nhận dạng tồn lâu theo thời gian Sự biến đổi phÇn mỊm thi thĨ th−êng diƠn nhanh, vËy trờng hợp chết đà lâu mẫu sinh phẩm pháp y có xơng, xơng sọ mẫu sinh phẩm có giá trị bậc 4.1.3 Nhận dạng phơng pháp lồng ảnh Lồng ảnh thực hệ thống gơng bán mạ hệ thống vi tính Phơng pháp đợc sử dụng trờng hợp xơng hộp sọ cần giám định nguyên vẹn có ảnh chân dung nạn nhân Khi điểm mốc đà đánh dấu xơng sọ trùng khít với với ảnh chân dung xác định đợc xơng sọ thuộc ngời mang ảnh chân dung nhng cha xác định đợc xác cá thể Trong trờng hợp xơng sọ không nguyên vẹn phơng pháp có nhiều hạn chế không thực tin cậy mốc giải phẫu bị Trong nghiên cứu gặp trờng hợp sử dụng phơng pháp lồng ảnh nhng cha xác định đợc cá thể số trờng hợp đà tiến hành phơng pháp phân tích ADN để nhận dạng Còn trờng hợp không phân tích ADN quan điều tra yêu cầu cần kết phơng pháp lồng ảnh 21 4.1.4 Nhận dạng cá thể thông qua đặc điểm mô tả Trong 168 trờng hợp đợc nhận dạng phơng pháp hình thái học có đến 161 cá thể (95,8 %) đợc nhận dạng thông qua đặc điểm mô tả Số lợng cá thể đợc nhận dạng phơng pháp chiếm tỷ lệ lớn mẫu giám định thi thể chết thi thể đợc bảo quản nên khuôn mặt tử thi nguyên vẹn, mô mềm đầu mặt cha bị biến đổi, đặc điểm mô tả rõ nét có mẫu so sánh phù hợp để xác định cá thể Do việc xác định cá thể trở nên dễ dàng Đa số tác giả thống pháp y với trờng hợp thi thể nguyên vẹn, cha bị phân huỷ khả xác định đợc cá thể qua đặc điểm mô tả cao Với thi thể đà bị phân huỷ đặc điểm mô tả khuôn mặt không rõ ràng khuôn mặt không nguyên vẹn kết nhận dạng phơng pháp dừng lại việc xác định có phù hợp hay không phù hợp mẫu giám định mẫu so sánh mà cha thể xác định đợc cá thể Vì cần kết hợp với phơng pháp nhận dạng khác để xác định cá thể 4.1.5 Nhận dạng phơng pháp vân da Ngời ta đà chứng minh đợc hai ngời trái đất có vân da đầu ngón tay giống Vì mẫu giám định nhận dạng vân da đầu ngón tay xác định đợc xác cá thể mà không cần đến phơng pháp nhận dạng khác Trong nghiên cứu có trờng hợp nhận dạng mà mẫu giám định thu đợc vân da so sánh với vân da chứng minh th ngời bị nạn, đà xác định đợc xác nạn nhân 4.2 tối u thnh phần v điều kiện phản ứng PCR đơn locus D16S539 v TH01 Chúng tiến hành tối u hoá thành phần phản ứng PCR đạt đợc yêu cầu Thành phần đợc tối u hoá bao gồm: nồng độ dNTPs, nồng độ MgCl2, hàm lợng mồi, hàm lợng ADN khuôn Taq DNA polymeraseđây thành phần quan trọng 22 PCR đặc hiệu nhằm xác định xác allele locus D16S539 TH01 cá thể Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu nhà khoa học khuyến cáo hÃng Perkin Elmer, Promega, Fermentas phù hợp với cân nồng độ chất phản ứng hoá sinh Theo chúng tôi, tối u hoá thành phần điều kiện phản ứng PCR để tạo đợc sản phẩm PCR đặc hiệu từ cho kết xác định x¸c kiĨu gen cđa c¸c c¸ thĨ Mét chÊt cã nồng độ thấp không đủ điều kiện cho phản ứng tổng hợp ADN xảy xảy yếu Trong nồng độ cao ức chế phản ứng làm giảm hiệu suất ức chế hoàn toàn không tạo đợc sản phẩm 4.3 Tối u hoá thnh phần v điều kiện cho phản ứng PCR phức hợp locus TH01 - D16S539 Butler Henegariu cho r»ng ph¶n øng PCR cho phÐp chÐp đồng thời nhiều locus ADN cách thêm nhiều cặp mồi vào phức hợp phản ứng PCR Sự khuếch đại đồng thời hai locus ADN hay nhiều đợc gọi PCR phức Nhng phản ứng PCR phức phản ứng PCR đơn cộng lại Việc thêm cặp mồi phản ứng PCR phức làm tăng mức độ phức tạp theo cấp số mũ tác động qua lại thành phần phản ứng xảy PCR phức có nhiều khó khăn so với phản ứng PCR đơn có nhiều khả gắn mồi xuất đồng thời Theo chúng tôi, việc gắn mồi locus không gây cản trở đến việc gắn mồi locus khác vấn đề mấu chốt Tuy nhiên tối u trình tổng hợp quan trọng ảnh hởng trực tiếp đến sản phẩm PCR đặc hiệu đợc tạo locus khác thực phản ứng Những nghiên cøu cịng ®· chØ r»ng thay ®ỉi nång ®é thành phần tham gia phản ứng trình thử nghiệm nh thay đổi trình tự mồi, nồng độ mồi, nồng độ dung dịch đệm, nồng độ 23 MgCl2, Taq yếu tố định để tối u hoá thành công PCR phức 4.4 Tạo thang thị allele locus TH01 v D16S539 Qua khảo sát đà thu đợc allele locus TH01 allele locus D16S539 Đây allele chung hai locus Trong đà tìm đợc allele allele số cđa locus TH01 vµ allele sè 15 cđa locus D16S539 Tạo thang allele locus TH01 D16S539 phơng pháp trộn sản phẩm PCR phơng pháp đơn giản dễ tiến hành nhng có nhợc điểm đậm độ băng thờng không đồng sử dụng nhiều ADN khuôn Phơng pháp không tiết kiệm đợc allele Tạo thang allele theo phơng pháp PCR nhằm khắc phục nhợc điểm tạo allele theo phơng pháp trộn mẫu, mặt khác tạo đợc nhiều sản phẩm tinh Sử dụng thang allele tự sản xuất đà đợc chuẩn hoá theo quy định quốc tế thực công cụ hữu hiệu xác định cá thể mà Việt Nam có số tác giả áp dụng cho locus D5S818, D7S820, D13S317, TPOX, CSF1PO, vWA Việc đánh số allele thang cđa tõng locus ph¶i thèng nhÊt cho tất labo nhận dạng kỹ thuật ADN toàn giới Chúng đà chuẩn allele thang phơng pháp giải trình tự để xác định xác nucleotide đoạn lặp lại số lợng đoạn lặp hai locus TH01 D16S539 Đồng thời so sánh với thang allele kit cđa h·ng Promega Nh− vËy, thang allele mµ chóng tạo hoàn toàn xác việc chuẩn hoá allele theo quy định quốc tế 4.5 Khảo sát tần suất phân bố allele locus TH01 v D16S539 ngời Việt (Kinh) Chúng đà khảo sát đợc tần suất allele từ số đến số 11 locus TH01 từ allele số đến số 15 locus D16S539 280 cá 24 thể ngời Việt (Kinh) Trong có allele số cđa locus TH01 vµ allele sè 15 cđa locus D16S539 có tần suất thấp Những allele Shimada nghiªn cøu trªn 187 mÉu ADN cđa ng−êi ViƯt Nam khu vùc quanh Hµ Néi ch−a thÊy xt hiƯn Theo nghiên cứu locus TH01 thấy allele sè ë ng−êi ViÖt chiÕm tû lÖ cao nhÊt (32,86%), nhng theo Shimada tần suất allele cao allele sè (35,7%); trªn locus D16S539 thÊy allele sè 11 chiÕm tû lƯ cao nhÊt (30,82%) nghiªn cứu Shimada allele cao allele số 12 (27,2%) Tại locus D16S539 đợc công bố ngân hàng gen quốc tế có allele 5, 6, nhng nghiên cứu cha tìm thấy Đây allele cực thấy ë qn thĨ ng−êi Brazin cã allele sè víi tần suất 0,2% quần thể ngời Ba lan có allele sè cã tÇn suÊt 0,11% KÕt luËn Đánh giá hiệu phơng pháp nhận dạng cá thể Qua 193 trờng hợp đợc giám định nhận dạng, có kết luận nh sau: 1.1 Phơng pháp nhận dạng cá thể pháp y chủ yếu phơng pháp hình thái học (87%), nhận dạng đặc điểm mô tả chiếm 95,8% 1.2 Nhận dạng thông qua khám nghiệm pháp y: Sử dụng trờng hợp mẫu giám định xơng sọ nguyên vẹn Xác định đợc độ tuổi dựa cốt hoá nhóm khớp vòm sọ, xác định giới tính dựa vào hình dáng sọ, gờ ổ mắt, ụ chẩm ngoài, xơng hàm dới 1.3 Nhận dạng phơng pháp lồng ảnh: Sử dụng trờng hợp xơng hộp sọ nguyên vẹn mẫu so sánh ảnh chân dung Giá trị nhận dạng sàng lọc loại trừ, cha xác định đợc cá thể Cần kết hợp với phơng pháp phân tích ADN để xác định cá thể 1.4 Nhận dạng cá thể thông qua đặc điểm mô tả: Xác định đợc cá thể khuôn mặt nguyên vẹn mô mềm đầu mặt cha biến đổi 25 dựa hình thái khuôn mặt, hình thái mắt, mũi, miệng, môi Khi khuôn mặt bị biến dạng, mô mềm đầu mặt không nguyên vẹn bị tách rời cha xác định đợc cá thể, cần kết hợp với phơng pháp nhận dạng vân da ADN 1.5 Nhận dạng phơng pháp vân da: Có giá trị xác định cá thể với độ xác cao dựa việc so sánh mẫu vân da cần giám định với vân da đà đợc lu trữ qua số lợng, loại hình đặc điểm đờng vân 1.6 Phơng pháp phân tích ADN: Giá trị xác định xác cá thể phân tích nhiều locus ADN Sử dụng mẫu so sánh trực tiếp gián tiếp Thờng sử dụng phơng pháp phân tích ADN phơng pháp hình thái học nhận dạng đợc nhận dạng phơng pháp hình thái học nhng cha xác định đợc cá thể Tối u hoá thành phần phản ứng PCR đơn, PCR phức, tạo thang allele khảo sát tần suất phân bố allele hai locus TH01 vµ D16S539 ë ng−êi ViƯt (Kinh) sư dơng nhận dạng cá thể 2.1 Đà tối u hoá đợc thành phần điều kiện PCR đơn locus Với nồng ®é dNTP 0,2mM; buffer1X; MgCl2 1,5 mM; Taq DNA polymerase 1U; måi 0,2μM; ADN khu«n tõ 10 - 50 ng tổng thể tích 25 l Nhiệt độ gắn mồi locus TH01 65,6oC phút, nhiệt độ gắn mồi locus D16S539 64 - 66oC phót; sè chu kú ph¶n øng 33 - 35 chu kỳ 2.2 Đà tối u hoá đợc thành phần điều kiện PCR phức hợp hai locus phản ứng Với nồng độ dNTP 0,3 mM; buffer 1,5 - 2X; MgCl2 - mM; Taq DNA polymerase 1,5 - 2U; måi D16S539 lµ 0,2μM vµ TH01 lµ 0,3 0,4 μM; ADN khu«n 25 - 50 ng tổng thể tích 25 l Nhiệt độ gắn mồi 65 66oC 2.3 Đà sản xuất đợc thang thị allele locus TH01 D16S539 Thang thị allele TH01 gåm allele, tõ allele sè ®Õn sè 11 Thang chØ thÞ allele D16S539 gåm allele, từ allelel số đến số 15 Đà 26 phát đợc alen hiếm: allele locus TH01 allele 15 locus D16S539 2.4 Đà khảo sát đợc tần suất phân bố allele hai locus TH01, D16S539 ngời Việt - Locus TH01 có tần suất phân bố từ allele số đến số 11 lần lợt 0,54%; 17,50%; 28,75%; 9,46%; 32,86%; 10,18% 0,71%, allele sè cã tÇn suÊt cao nhÊt (32,86%), allele sè cã tÇn suÊt thÊp nhÊt (0,54%) - Locus D16S539 có tần suất phân bố từ allele số đến số 15 lần lợt 0,72%; 17,92%; 13,08%; 30,82%; 24,01%; 10,57%; 2,33% 0,54%, allele số 11 cã tÇn suÊt cao nhÊt (30,82%), allele sè 15 cã tần suất thấp (0,54%) Kiến nghị - Cần nghiên cứu đặc điểm hình thái đặc điểm mô mềm đầu mặt ngời Việt Nam phục vụ cho công tác nhận dạng - Lu trữ hồ sơ mẫu sinh phẩm nhóm đối tợng lập thành tàng th ADN - Nghiên cứu khảo sát thêm locus ADN hình nhóm ngời thuộc dân tộc khác lÃnh thổ Việt Nam để xây dựng đợc bảng phân bố tần suất allele phục vụ giám định nhận dạng cá thể 27 Danh mục Các công trình đ công bố tác giả có liên quan đến luận án Nguyễn Văn Lợi, Nguyễn Trọng Toàn, Nghiêm Xuân Dũng (2003), Tối u hoá điều kiện PCR khảo sát sơ tần suất allele locus TH01, Những vấn đề nghiên cứu khoa häc sù sèng, B¸o c¸o khoa häc Héi nghị toàn quốc lần thứ hai Huế, Nhà xuất khoa häc vµ kü thuËt, tr 952 - 955 Nguyễn Văn Lợi, Nguyễn Trọng Toàn, Nghiêm Xuân Dũng (2006), Tối u hoá điều kiện PCR phức hợp mồi locus TH01 D16S539, Tạp chí y dợc học quân sự, (Đặc san), tr 61 - 65 Nguyễn Văn Lợi (2007), Nghiên cứu chế tạo thang allele cho locus di trun TH01 b»ng kü tht PCR”, T¹p chÝ y học quân sự, Cục quân y, (Chuyên đề), tr 80 - 82 Nguyễn Văn Lợi, Nguyễn Trần Chiến (2008), Đề xuất quy trình giám định nhận dạng pháp y từ trờng hợp giám định cụ thể, Tạp chÝ y häc qu©n sù, Cơc qu©n y, (1), tr 54 - 56 ... hành: Phơng pháp nhận dạng hình thái học: 168 Phơng pháp nhận dạng phân tích ADN: 23 Phơng pháp nhận dạng hình thái học kết hợp ADN: 2.1.2 Đối tợng nghiên cứu số locus STR ngời Việt 280 mẫu máu... thể ngời hình thái học locus ADN phục vụ cho giám định nhận dạng pháp y hình Nhng số lợng công trình nghiên cứu đợc ứng dụng nhận dạng pháp y cha nhiều, công tác nhận dạng hình thái học ch−a... chủ y? ??u phơng pháp nhận dạng hình thái học với 168 trờng hợp, chiếm 87%; 23 trờng hợp nhận dạng phơng pháp phân tích ADN, chiếm 12% trờng hợp nhận dạng phơng pháp kết hợp hình thái phân tích ADN,