Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH Phan Thị Ngọc Châu i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme Bromelain từ vỏ dứa” là cô[.]
Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme Bromelain từ vỏ dứa” cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu sử dụng khóa luận la trung thực có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng Nội dung khóa luận thực sở lý thuyết, kiến thức co tham khảo thêm số tài liệu, sách báo tập chí theo danh mục khóa luận Sinh viên thực Phan Thị Ngọc Châu SVTH: Phan Thị Ngọc Châu i Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu dề tài .2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ luợc enzyme 2.2 Enzyme protease .4 2.2.1.Giới thiệu sơ lược enzyme protease .5 2.2.1.1 Protease động vật .5 2.2.1.2 Protease thực vật 2.2.1.3 Protease vi sinh vật 2.2.2 Ứng dụng enzyme protease 2.3 Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa 11 2.3.1 Giới thiệu enzyme bromelain 11 2.3.2 Tính chất vật lí enzyme bromelain 11 2.3.3 Tính chất hố học enzyme bromelain 12 2.3.3.1 Cấu tạo hoá học 12 2.3.3.2 Cấu trúc không gian bromelain 12 2.3.4 Hoạt tính enzyme bromelain 13 2.3.4.1 Cơ chế tác động 13 2.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Bromelain 14 2.3.5 Ứng dụng enzyme Bromelain 15 2.3.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 15 2.3.6 Tình hình nghiên cứu ngồi nước enzyme bromelain 16 2.3.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain nước 16 2.3.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain nước .17 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu ii Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 3.1 Vật liệu hóa chất .18 3.1.1 Nguyên liệu 18 3.1.2 Hóa chất 18 3.1.3 Thiết bị 18 3.2 Quy trính tách chiết Enzyme Bromelain .19 3.2.1 Thuyết minh quy trình 20 3.2.2 khảo sát tác nhân tủa enzyme cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 aceton (CH3COCH3) .20 3.2.2.1 Nguyên tắc 20 3.2.2.2 Tủa enzyme cồn 960 20 3.2.2.3 Tủa enzyme muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 21 3.2.2.4 Tủa enzyme aceton (CH3COCH3) 21 3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme 22 3.2.3.1 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford 22 3.3 Enzyme cố định .28 3.3.1 Định nghĩa enzyme cố định 28 3.3.2 Tính chất ưu nhược điểm enzyme cố định 29 3.2.2.1 Ưu điểm 29 3.3.2.2 Nhược điểm 29 3.3.3 Một số phương pháp cố định enzyme 30 3.3.3.1 Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding) 30 3.3.3.2 Phương pháp hấp thụ vật lí (physical adsorption) 30 3.3.3.4 Phương pháp khâu mạch (cross – linking) .32 3.3.4 Cố định enzyme bromelain chất Natrialginate phương pháp nhốt 33 3.3.4.1 Đặc điểm, tính chất Natrialginate 33 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iii Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 3.3.4.2 Tạo dung dịch Natrialginate 3% 33 3.3.4.3 Tiến hành cố định 33 3.3.4.4 Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein hiệu suất cố định hoạt tính enzyme cố định .33 3.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng yếu tố lý hóa đến hoạt tính enzyme bromelain cố định Natrialginate 34 3.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng pH .34 3.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 34 3.3.5.3 Khảo sát độ bền nhiệt .35 3.3.5.4 Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định Natrialginate 35 3.3.6 Tinh enzyme bromelain sắc ký lọc gel 35 3.3.6.1 Nguyên tắc .36 3.3.6.2 Thiết bị hóa chất 36 3.3.6.3 Các bước tiến hành 36 3.3.6.4 Tính hiệu suất hoạt tính enzyme Bromelain độ tinh enzyme sau tinh sắc ký lọc gel 38 3.3.7 Xác định trọng lượng phân tử enzyme Bromelain phương pháp điện di gel polyacrylamid (SDS – PAGE) 39 3.3.7.1 Nguyên tắc .39 3.3.7.2 Thiết bị hóa chất 39 3.3.7.3 Phương pháp 41 3.3.7.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme Bromelain 43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iv Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tính chất vật lý enzyme bromelain 11 Bảng 2.2 Ảnh hưởng trạng thái điều kiện bảo quản 15 Bảng 3.1 Tỷ lệ cồn 96o dịch enzyme từ vỏ dứa 20 Bảng 3.2 Nồng độ tủa muối (NH4)2SO4 dịch enzyme từ vỏ dứa 21 Bảng 3.3 Tỉ lệ tủa aceton dịch enzyme từ vỏ dứa 22 Bảng 3.4 Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin 24 Bảng 3.5 Bảng số liệu dựng đường chuẩn tyrosine 26 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu v Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc gian enzyme protease Hình 2.2 Nguồn enzyme protease từ thực vật Hình 2.3 Vi khuẩn Clostridium Hình 2.4 Vi khuẩn Bacillus Hình 2.5 Nấm mốc Hình 2.6 Xạ khuẩn Hình 3.1 Thiết bị lọc gel áp suất thấp 35 Hình 3.2 Loại muối trước chạy sắc ký .38 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu vi Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hầu phản ứng hóa học thể sống cần phải có vai trị xúc tác enzyme – chất xúc tác sinh học Chính vậy, nghiên cứu enzyme thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm cơng dụng khác enzyme Nghiên cứu công nghệ enzyme tiến hành nhiều tác sử dụng phủ tạng lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có thử nghiệm công nghệ sản xuất amino acid từ nhộng tằm protease, bột protein thịt enzyme bromelain từ vỏ dứa… Nghiên cứu enzyme cịn có ý nghĩa thực tiễn quan trọng, số bệnh, đặc biệt bệnh mang tính di truyền, thiếu hay hẳn số enzyme mơ, điều kiện khơng bình thường xuất hoạt tính dư thừa số enzyme đặc hiệu Do xác định hoạt tính số enzyme huyết tương, hồng cầu mô quan trọng việc chẩn đốn bệnh Enzyme trở thành cơng cụ thực tế quan trọng y học mà cơng nghệ hóa học, chế biến thực phẩm…Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn nguồn nghiên liệu phong phú ( dứa, đu đủ,… ) Trong trình chế biến dứa đóng hộp sử dụng phần dứa, phần lại phụ phẩm Nếu tận dụng nguồn phế phẩm vừa giảm thiểu chất hữu gây nhiễm mơi trường vừa sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ dứa Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase phân hủy chất tự nhiên lẫn chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao Từ lợi ích enzyme bromelain mang lại, chấp nhận Khoa Môi Trường Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng tơi xin tiến hành thực khóa luận “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa” SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 1.2 Mục tiêu dề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Cố định enzyme bromelain Natrialginate 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Thu nhận dịch enzyme bromelain từ vỏ dứa Khảo sát tác nhân tủa enzyme cồn 960, muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4 ) aceton ( CH3COCH3 ) Cố định enzyme bromelain Natrialginate Tinh enzyme bromelain Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain phương pháp điện di SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ luợc enzyme Enzyme chất xúc tác hệ thống sinh học Chúng có khả xúc tác đặc biệt, thường mạnh nhiều so với chất xúc tác tổng hợp Tác dụng xúc tác chúng mang tính đặc hiệu chất, làm tăng đáng kể tốc độ phản ứng hóa học xảy môi trường nước điều kiện nhiệt độ pH thích hợp Enzyme chìa khóa để hiểu biết q trình hoạt động sống tế bào Hoạt động trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định đường trao đổi chất mà nhờ chất dinh dưỡng bị phân hủy, lượng hóa học lưu biến đổi, đại phân tử sinh học tạo từ chất tiền thân đơn giản Một số enzyme tham gia trình trao đổi chất enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm tín hiệu trao đổi chất khác cách thay đổi hoạt tính xúc tác chúng cách thích hợp Thơng qua hoạt động enzyme điều hòa hệ thống enzyme phối hợp chặt chẽ với để tạo mối quan hệ hài hòa hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho việc trì sống Enzyme có thể sinh vật, khơng làm nhiệm vụ xúc tác cho phản ứng hóa học định thể sinh vật mà xúc tác cho phản ứng ngồi tế bào Vì có nguồn gốc từ sinh vật enzyme thường gọi chất xúc tác sinh học ( biocatalisateur ) nhằm phân biệt với chất xúc tác hóa học khác.Chính nhờ có mặt enzyme mà nhiều phản ứng hóa học khó xảy điều kiện thường ngồi thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) thể xảy nhanh chóng, liên tục nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác điều kiện êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…) Đặc tính quan trọng enzyme tính đặc hiệu Tính đặc hiệu khả xúc tác chọn lọc, xúc tác chuyển hóa hay số chất định theo kiểu phản ứng định: đặc hiệu cảm ứng đặc hiệu chất SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Enzyme khơng thể tổng hợp đường hóa học Do muốn thu nhận enzyme có đường thu nhận từ thể sinh vật Tất tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật chứa enzyme mức độ enzyme hồn tồn khác Hiện người ta khai thác enzyme từ ba nguồn bản: − Nguồn động vật − Nguồn thực vật − Nguồn vi sinh vật 2.2 Enzyme protease Nhóm enzyme protease ( peptit – hidrolase 3.4) xúc tác trình thủy phân liên kết peptit ( -CO-NH-)n phân tử protein, polypeptitde đến sản phẩm cuối axit amin Ngoài ra, nhiều protease có khả thủy phân liên kết este vận chuyển axit amin Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên phân bố rộng rãi nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa…) động vật ( gan, dày…) So với protease động vật thực vật, protease vi sinh vật có đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lượng hình dạng phân tử nên tách dạng tinh thể đồng nhât Cũng phức hệ gồm nhiều enzyme khác nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để đa dạng Hình 2.1 Cấu trúc gian enzyme protease SVTH: Phan Thị Ngọc Châu ... sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa” SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 1.2 Mục tiêu dề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Quy trình sản xuất enzyme bromelain. .. 10 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 2.3 Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa 2.3.1 Giới thiệu enzyme bromelain Bromelain enzyme có nhiều dứa, phát từ kỉ 19 nghiên cứu từ. .. định enzyme bromelain Natrialginate Tinh enzyme bromelain Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain phương pháp điện di SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ