VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC PROMOTER GEN GmNAC (35S GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101 Asc VÀ CHỦNG VI[.]
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC (35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc VÀ CHỦNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA101 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC (35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc VÀ CHỦNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS EHA101 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VIỆT NAM Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN VĂN ĐỒNG Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2018 Tác giả luận văn Lê Thị Mai Hương i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Đồng tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới thầy giáo phịng Sau Đại học, thầy giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi thời gian học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp giúp đỡ nhiệt tình suốt thời gian thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ Chương trình Khoa học Công nghệ độc lập cấp nhà nước đề tài mã số 03/2012/HĐ-ĐTĐL Cuối xin gửi tới bố mẹ, anh chị bạn bè lời cảm ơn thân thương người quan tâm, ủng hộ chỗ dựa cho suốt thời gian tơi làm khóa luận này, sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Lê Thị Mai Hương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………….…… LỜI CẢM ƠN……………………………………………… ………… … MỤC LỤC………………………………………………………….………… DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………… …… DANH MỤC BẢNG.………………………………………………….……… DANH MỤC HÌNH………………………………………………… ……… CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU……………………………………………… ……… 1.1 Đặt vấn đề…….……………………………………………………… 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài ….…………………… 1.3 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn tính đề tài CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………… … 2.1 Tình hình sản xuất đậu tương ngồi nước.………………… 2.1.1 Giới thiệu chung đậu tương…… 2.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương giới…………………… … 2.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam.……………………… 2.1.4 Tình hình phát triển ứng dụng đậu tương chuyển gen giới Việt Nam… ……………………………………… …… 2.2 Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương………………… …………… 2.2.1 Chuyển gen vào đậu tương thơng qua vi khuẩn A tumefaciens… 2.2.2 Đặc tính chịu hạn số gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tương……………………………………………………… CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….… i ii iii v vi vii 1 3 4 10 15 15 19 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu………… ………………………… 3.2 Nội dung nghiên cứu.…….……………………………………….…… 3.3 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………… … 3.4 Phương pháp nghiên cứu……… …………………………………… 3.4.1 Phương pháp biến nạp ………………………………………….… 27 27 27 27 30 30 3.4.2 Kiểm tra có mặt gen chuyển hệ T0…… 3.4.3 Chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử phun Basta……… 3.4.4 Phương pháp thu thập phân tích số liệu thống kê …………… 32 35 36 iii CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………….…………… 4.1 Kết biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương 37 ĐT22……………………………………………………………………… 4.2 Kết chọn lọc chuyển gen phun Basta ………… 4.3 Kết phân tích PCR chuyển gen hệ T0.….…………… … 4.3.1 Phân tích PCR kiểm tra có mặt gen bar …… ……… 4.3.2 Phân tích PCR kiểm tra có mặt cấu trúc 35S::GmNAC004 4.4 Kết chọn lọc dòng chuyển gen đồng hợp tử……………………… 37 40 42 42 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………… 5.1 Kết luận………………………………………………… 5.2 Đề nghị……………………………………………… 51 DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN………… 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………… 53 PHỤ LỤC………………………………………………… 60 iv 43 45 51 51 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D ADN ARN Dichlorophenoxyacetic acid Acid deoxyribonucleic AS BĐG Acid ribonucleic Acetosyringone Biến đổi gen CCM cDNA CNSH CTAB CS DMSO DW Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy Complementary DNA Công nghệ Sinh học Hexadecyltrimethylammonium bromide Cộng Dimethyl sulfoxide Dry weight - Trọng lượng khô EDTA GM IBA Ethylendiamin Tetraacetic Acid Germination medium - Môi trường nảy mầm hạt Indol butyric acid LB NBT OD600 Luria-Bertani Nitrotetrazolium Blue chloride Mật độ vi khuẩn đo bước sóng 600 nm quang phổ kế PCR RT PCR RM RWC SDS SEM SIM SSC TL TT TW v/ p W YEP Polymerase Chain Reaction Real-time PCR Rooting medium - Môi trường rễ Relative water content - Hàm lượng nước tương đối Sodium dodecyl sulfate Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi Saline-sodium citrate Trọng lượng Thứ tự Turgid weight - Trọng lượng trương vòng/ phút Weight - Trọng lượng Yeast extract peptone - Môi trường nuôi khuẩn v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các giai đoạn sinh trưởng phát triển đậu tương………… Bảng 2.2 Tình hình sản xuất đậu tương giới ………………………… Bảng 2.3 Tình hình sản xuất đậu tương nước đứng đầu giới… Bảng 2.4 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam …………………… … Bảng 2.5 Một số nghiên cứu vai trò gen GmNAC Bảng 3.1 Thơng tin vector pZY101::35S::GmNAC004………………… … Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu………………… Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR………………………………………… Bảng 4.1 Kết tạo đa chồi thí nghiệm chuyển cấu trúc gen 23 28 35 35 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……………………………………… Bảng 4.2 Kết chọn lọc mẫu biến nạp thí nghiệm chuyển cấu trúc 38 gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101Asc chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101………………………………… Bảng 4.3 Kết chuyển đậu tương sau biến nạp bầu đất thí 39 nghiệm chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101……… Bảng 4.4 Kết phun basta đậu tương chuyển cấu trúc gen 40 35S::GmNAC004……………………………………………………………… 41 Bảng 4.5 Kết phân tích PCR đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 hệ T0………………………………………………… 44 Bảng 4.6 Kết sàng lọc đánh giá dòng đậu tương sau chuyển gen phun Basta đến hệ T3…………………………………………………… 45 Bảng 4.7 Kết phân tích phân ly hệ T1……………………… 46 Bảng 4.8 Kết phân tích phân ly hệ T2……………………… 46 Bảng 4.9 Kết phân tích phân ly hệ T3……………………… 47 vi DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Hạt đậu tương giống ĐT22………………………….……………… Hình 3.2 Cấu trúc vector pZY101::35S::GmNAC004……………………… Hình 4.1 Kết biến nạp cấu trúc 35S::GmNAC004 vào nốt mầm giống đậu tương ĐT22 thông qua vector pZY101-Asc chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101 …………………………………………………… … 28 30 Hình 4.2 Kết mẫu tạo đa chồi môi trường SIM………… ………… Hình 4.3 Kết mẫu biến nạp kéo dài chồi mơi trường SEM………… Hình 4.4 Cây đậu tương chuyển gen thu sau trình biến nạp sử dụng 38 39 cấu trúc gen 35S::GmNAC004 chủng khuẩn A.tumefaciens EHA101…… 40 Hình 4.5 Kết chọn lọc thuốc diệt cỏ Basta đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004………………………………………… …… Hình 4.6 Kết kiểm tra chất lượng ADN tổng số đậu tương 41 chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 ……………………………………… Hình 4.7 Phân tích PCR gen bar đậu tương chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004………………………………………………………… … Hình 4.8 Kết phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen T0……………………………………… …………… Hình 4.9 Kết chọn lọc chuyển gen đồng hợp đến hệ T3………… Hình 4.10 Các dịng đậu tương chuyển gen 35S::GmNAC004 sống sót sau phun basta chăm sóc đến hoa, kết quả……… Hình 4.11 Phân tích PCR gen bar đậu tương chuyển gen T1 Hình 4.12 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen hệ T1 ……………………………………………… Hình 4.13 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen hệ T2…………………………………………………… Hình 4.14 Phân tích PCR cấu trúc gen 35S::GmNAC004 đậu tương chuyển gen hệ T3…………………………………………………… vii 37 42 43 44 48 49 49 50 50 50 CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Đậu tương (Glicine max (L.) Merr.) thuộc họ Đậu (Fabacea), Fabales, trồng lấy hạt cho dầu quan trọng bậc giới, khả thích ứng rộng nên đậu tương trồng khắp châu lục, tập trung nhiều Châu Mỹ với sản lượng đậu tương thu chiếm 85,4% tổng sản lượng đậu tương toàn giới, tiếp đến Châu Á đạt 12,1% (FAOSTAT, 2016) Tại Việt Nam, đậu tương thực phẩm có vai trị quan trọng suất trồng thấp, chưa thể đáp ứng nhu cầu tiêu dùng nước Nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn đến suất sản lượng đậu tương Việt Nam bệnh dịch hại, sâu bệnh chủ yếu hạn hán Trong bối cảnh khí hậu trái đất thay đổi dẫn đến diện tích khơ hạn, nhiễm mặn ngày tăng Việc nghiên cứu đáp ứng lương thực, bao gồm đậu tương, trồng điều kiện môi trường thiếu nước, mặn, lạnh… ngày trở nên quan trọng (Petit cộng sự, 1999; Manavalan cộng sự, 2009; Tran Mochida, 2010) Một kỹ thuật ln mang lại nhiều kỳ vọng nghiên cứu, phát triển giống đậu tương biến đổi gen dựa việc phân lập gen có lợi thiết kế véc tơ hiệu cao để chuyển gen mục tiêu vào giống đậu tương xác định Các yếu tố phiên mã NAC (NAM, ATAF CUC) báo cáo tăng cường khả chống chịu trồng điều kiện bất thuận hạn, mặn lạnh (Tran et al., 2010) Theo nghiên cứu Reem M Hussain cộng (2017), xác định 139 gen GmNAC, nghiên ...VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ THN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC PROMOTER::GEN - GmNAC (35S::GmNAC004) THÔNG QUA VECTOR pZY101-Asc... thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2018 Tác giả luận văn Lê Thị Mai Hương i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS... làm khóa luận này, sống Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Lê Thị Mai Hương ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………….…… LỜI CẢM ƠN……………………………………………… ………… … MỤC