Đồ án chuyên ngành GVHD Lê Văn Việt Mẫn Đồ án chuyên ngành GVHD Lê Văn Việt Mẫn CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU Do sự gia tăng liên tục giá thành của dầu thô nguồn năng lượng chính trên thế giới hiện nay, rất nhi[.]
Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Do gia tăng liên tục giá thành dầu thơ-nguồn lượng giới nay, nhiều đề tài nghiên cứu gần quan tâm đến việc phát triển nguồn nhiên liệu có giá trị mặt kinh tế mơi trường Có thể nói nhiên liệu sinh học nguồn nhiên liệu đầy tiềm hứa hẹn thay cho nguồn xăng dầu cạn kiệt tương lai, đặc biệt nhiên liệu sản xuất thông qua trình lên men từ nguồn nguyên liệu tái tạo, điển hình butanol Hiện butanol thương mại sản xuất chủ yếu từ đường hóa dầu kết nghiên cứu cho thấy trình lên men từ vi sinh vật để thu nhận butanol có nhiều triển vọng Q trình lên men sản xuất butanol hay cịn gọi q trình lên men Ethanol-Butanol-Acetone (ABE) thực giống vi khuẩn Clostridium, đặc biệt loài Acetobutylicum (Lin Blaschek, 1983) Loài vi sinh vật xem lâu đời nghành cơng nghiệp lên men kỵ khí bắt buộc Nó xếp vị trí thứ hai sau lên men ethanol từ nấm men Saccharomyces cerevisiae quy mơ sản xuất Q trình lên men ABE thực rộng rãi công nghiệp đến nửa đầu kỷ 20 với 66% sản lượng tiêu thụ toàn giới butanol sản xuất từ phương pháp sinh học (Dürre, 2008) Tuy nhiên, với đời Thế chiến thứ hai phát triển leo thang ngành cơng nghiệp hóa dầu, sản xuất butanol từ phương pháp sinh học nhanh chóng giảm dần Đến năm 1960, hiệu thấp trình lên men ABE so ngành cơng nghiệp hóa dầu với chi phí cao sử dụng nguồn carbohydrate làm chất dẫn tới kết việc xố bỏ hồn tồn hoạt động cơng nghiệp từ trình lên men Tuy nhiên, giá dầu bắt đầu tăng từ đầu năm 1970 "cuộc khủng hoảng dầu thô" với suy giảm dần nguồn dầu thúc đẩy xã hội toàn giới nhận thức vấn đề mơi trường tình trạng cấp cứu, làm cho người quan tâm đến ngành công nghiệp sinh học (Dürre, năm 1998; Dürre, 2008) Kể từ đó, nỗ lực nghiên cứu đáng kể trình lên men ABE sản xuất butanol thực nhiều lĩnh vực, cụ thể ngành công nghệ vi sinh vật, tạo chủng đột biến nhằm nâng cao sản lượng dung môi, nghiên cứu thay đổi điều kiện lên men nhằm cải thiện suất thấp nồng độ butanol dịch lên men Giống trình sinh học khác, trình lên men ABE thể số hạn chế kinh tế khả cạnh tranh so với trình sản xuất phương pháp hóa học tinh khiết Những bất lợi trường hợp liên quan đến đường trao đổi chất phức tạp vi khuẩn sản xuất butanol Trong chu trình lên men ABE tiêu biểu từ nguồn carbohydrate: axit butyric, propionic acetic trước hết sinh tổng hợp C acetobutylicum (acidogenesis) giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân tế bào Khi vi sinh vật bước vào giai SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn đoạn ổn định bắt đầu giai đoạn tạo thành acetone, butanol ethanol theo tỷ lệ 3:6:1 tương ứng (solventogenesis) (Fond et al, 1985.) Quá trìnhchuyển pha từ acidogenesis sang solventogenesis điều khiển cách thay đổi làm giảm pH ( gl -1) (Gottschalk Morris, 1981; Gottwald Gottschalk, 1985; Monot etal., 1984) Tuy nhiên, trình lên men thực tế phức tạp cần phải kiểm soát chặt chẽ điều kiện lên men để đạt hiệu cao (Chauvatcharin et al., 1998) Trong trình lên men ABE truyền thống, mật độ tế bào vi sinh vật thấp môi trường lên men làm hiệu suất sinh tổng hợp butanol từ glucose nói chung thấp thường khoảng 15% (w / w) vượt 25% (w / w) Ngoài ra, việc sinh tổng hợp butanol bị giới hạn nhiều yếu tố ức chế khác, butanol yếu tố gây ức chế ngược lên tăng trưởng tế bào làm ngừng trình lên men Trong thực tế, vi khuẩn khó trì hoạt tính nồng độ butanol dịch lên men xấp xỉ 10 gl-1 Kết nồng độ butanol dịch lên men ABE thường xấp xỉ 13 gl-1 Do đó, việc sản xuất butanol từ q trình lên men ABE truyền thống cho hiệu kinh tế thấp (Maddox, 1989) Nội dung viết giới thiệu chung butanol ứng dụng thực tiễn Dựa nghiên cứu gần trình lên men tĩnh sản xuất butanol trình bày số chủng Clostridium phân lập có khả sinh tổng hợp chịu nồng độ butanol cao Giới thiệu nguồn chất khác mà vi sinh vật sử dụng để lên men yếu tố ảnh hưởng tới q trình lên men tạo butanol, qua so sánh hiệu suất sinh tổng hợp butanol Trình bày số kết nghiên cứu đạt lên men sử dụng tế bào vi khuẩn cố định số chất mang Các phương pháp tách chiết butanol từ dịch sau lên men giới thiệu viết SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn CHƯƠNG 2: BUTANOL 2.1 Giới thiệu chung Butanol (danh pháp IUPAC, 1-butanol; CAS no.71-36-3) gọi rượu butylic, n-butanol methylolpropane, rượu gồm cacbon có công thức phân tử C4H9OH (KLPT = 74,12 g.mol-1) Butanol chất lỏng không màu, dễ cháy, kỵ lỏng, có mùi thơm chuối hương có mùi cồn mạnh Khi tiếp xúc trực tiếp gây kích ứng mắt da.Hơi có tác dụng kích thích vào niêm mạcmàng có khả gây mê hít phải nồng độ cao.Butanol hịa tan hồn tồnvới dung mơi hữu phổ biến, lại hịa tan nước (Lee cộng sự, 2008a) Hình 1: Cấu trúc khơng gian butanol Bảng 1: Tính chất vật lý n- butanol 74.12 g mol-1 Dung dịch lỏng màu vàng 0.810– 0.812 −90 °C, 183 K, -130 °F 118 °C, 391 K, 244 °F 9.0 ml/100 ml (7.7 g/100 ml 20°C) 35–37 oC 343–345 oC 25–29 oC 43.8 kJ mol-1 198.2 kJ mol-1 0.63 kPa Khối lượng phân tử Dạng tồn Tỷ trọng Nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ sơi Độ tan nước Nhiệt độ đánh lửa Nhiệt độ tự bốc cháy Flash point Nhiệt hóa Nhiệt đốt cháy Áp suất 20oC SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn 2.2 Ứng dụng butanol thực tiễn Một ứng dụng ưu việt lớn biobutanol (butanol sinh học) sử dụng để pha trộn vào xăng dầu làm nhiên liệu cho động Trong ethanol nhận nhiều quan tâm nguồn nhiên liệu hỗ trợ nhiều lý (Hansen et al., 2005 Niven, 2005) butanol lại cho thấy lựa chọn tốt hơnso với ethanol có tính chất hóa học vật lý phù hợp Bảng 2: Bảng so sánh tính chất butanol với xăng ethanol Tính chất Nhiệt độ sơi (oC) Tỷ trọng 20°C (g/ml) Khả tan 100g nước Mật độ lượng (MJ.l-1) Nhiệt bay (MJ/kg) Nhiệt dung riêng (kJ/kmol.ºK) Chỉ số Octane Độ nhớt (10-3 Pa.s) Butanol 117–118 0.8098 Không tan Xăng 27–221 0.7–0.8 Không tan Ethanol 78 0.7851 Tan 27–29.2 0.43 178 32 0.36 160–300 19.6 0.92 112.3 96 2.593 91–99 0.24–0.32 129 1.078 Theo Shapovalop Ashkinazi, (2008) Dürre, (2007) butanol thể nhiều ưu điểm vượt trội so với ethanol việc thay nguồn nhiên liệu xăng dầu, cụ thể: - Giá trị lượng butanol 29.2 MJ/L giá trị lượng ethanol 19.6 MJ/L xăng 32 MJ/L lượng butanol nhiều ethanol khoảng 25% - Dựa vào áp suất thấy butanol sử dụng an tồn so với ethanol butanol bay ethanol xăng - Butanol gây ăn mịn so với ethanol, không ảnh hưởngđến thiết bị chứa đựng bể chứa, đường ống, máy bơm… sử dụng lâu dài - Khả hòa tan thấp nước butanol cho phép pha xăng dầu nồng độ cao loại nhiên liệu sinh học mà khơng sợ bị tách pha làm xuất nước, ethanol pha thêm vào xăng khoảng 25% vàchỉ giữ thời gian ngắn để sử dụng Áp suất butanol (4 mmHg 20°C) thấp so với ethanol 11 lần (45 mmHg 20°C) cho phép pha trực tiếp vào xăng mà không cần quan tâm đến bay SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn - Trong trình đốt cháy, butanol khơng thải hợp chất khí chứa sulphur oxit nitơ, ưu điểm vượt trội môi trường so với nguồn nhiên liệu khác Với ưu điểm với nguồn chất phong phú sử dụng trình lên men ABE, biobutanol tiềm lớn việc thay nguồn nhiên liệu xăng dầu cạn kiệt góp phần làm giảm hiệu ứng nhà kính Bên cạnh vai trò nhiên liệu sinh học cho động cơ, butanol thực hóa chất quan trọng sử dụng với lượng lớn ngành công nghiệp Gần nửa sản lượng butanol sản xuất toàn giới sử dụng làm dung môi dạng butyl acrylate este methacrylate sản xuất loại sơn nhưenamel,nitrocellulose; keo dán, chất đàn hồi, công nghệ dệt may, sản xuất sợi, nhựa, sản xuất kính an tồn, chất tẩy rửa Các hợp chất quan trọng có nguồn gốc từ butanol butyl ete glycol, butylacetate,amin butyl,nhựa amin chất dẻo Nó sử dụng làm dung môi ngành công nghiệp mỹ phẩm nước hoa, sản phẩm trang điểm cho mắt, sơn móng tay…và dùng cho việc sản xuất loại thuốc kháng sinh, vitamin hormone SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN SẢN XUẤT BUTANOL – CLOSTRIDIUM 3.1 Đặc điểm hình thái Clostridium giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes Đây vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả sinh nha bào môi trường sống bất lợi Đại diện tiêu biểu lồi Clostridium acetobutylicum có dạng hình que thẳng, kích thước khác từ 0,5-1,5 × 1,5-6 μm (Robinson, 2000) Clostridium acetobutylicum vi khuẩn Gram dương phát triển giai đoạn logarite canh trường,và chuyển thành Gram âm bước sang giai đoạn ổn định sinh bào tử, lên men dị dưỡng, di động roi Trong trình hình thành bào tử, tế bào phình lên rõ rệt tích trữ hạt, polysaccharide cung cấp nguồn carbon lượng giai đoạn solventogenesis Bào tử hình thành có dạng bầu dục Các vi sinh vật thuộc giống Clostridium lên men thường xếp thành bốn nhóm khác dựa đặc tính sinh hóa di truyền chúng (Woods, 1995) bao gồm: Clostridium acetobutylicum, C.beijerinckii,C.saccharobutylicum, C saccharoperbutylacetonicum Hai loài biết đến với nhiều ưu điểm vượt trội C acetobutylicum C beijerinckii (trước gọi C butylicum) hầu hết tài liệu nghiên cứu lên men ABE dựa hai lồi Hình 2: Hình ảnh C.acetobutylicum C.beijerinckii kính hiển vi điện tử (SEM) 3.2 Đặc điểm sinh lý vi khuẩn Clostridium 3.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng - Nguồn Carbon: SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Quá trình tổng hợp acetone, butanol, and ethanol từ loài thuộc giống Clostridium bắt nguồn từ chất carbohydrate Nhóm vi sinh vật có khả sử dụng nguồn dinh dưỡng đa dạng, sử dụng gần hoàn toàn loại đường glucose, fructose, mannose, sucrose, lactose sử dụng phần đường xylose, galactose, arabinose, raffinose… Nhiều nghiên cứu cho thấy glucose loại đường tốt cho Clostridium sử dụng - Nguồn Nitơ: Nitơ thành phần quan trọng protein enzyme, cung cấp vào môi trường nhân giống lên men cho vi sinh vật sử dụng dạng muối NH 4+ NO3hay hợp chất hữu phức tạp từ chất chiết nấm men, sản phẩm thủy phân từ đậu nành… Việc bổ sung nitơ cần thiết cho việc tạo sinh khối vi sinh vật, nhiên bổ sung nhiều làm ức chế việc sinh tổng hợp sản phẩm - Khoáng: Sự phát triển tế bào vi khuẩn phụ thuộc vào muối khống mơi trường Mg2+, Fe2+, Mn2+ K+ Chúng cung cấp dạng muối MgSO 4, MnSO4, FeSO4, KCl, KH2PO4 K2HPO4;…Nếu nồng độ Mg2+ Mn2+ môi trường cao gây ức chế đến sinh trưởng tế bào - Yếu tố sinh trưởng: Cũng giống loài vi khuẩn khác, trình sinh trưởng phát triển Clostridium đòi hỏi cung cấp số yếu tố sinh trưởng biotin, thiamine hydrochloride, p-aminobenzoic, resazurin… Các yếu tố diện môi trường nồng độ tương đối thấp từ 0.1-1 mg/L, ảnh hưởng nhiều đến hoạt động trao đổi chất vi khuẩn q trình lên men Các loại mơi trường thường sử dụng để nuôi cấy nhân giống vi khuẩn Clostridium: - Môi trường P2: môi trường tối ưu cho tất loài Clostidium phát triển, sử dụng làm môi trường giữ giống lên men với nồng độ glucose khác Thành phần Glucose MgSO4.7H2O MnSO4.H2O FeSO4.7H2O KCl KH2PO4 K2HPO4 Ammonium acetate SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Hàm lượng (g/L) 60 20 1 50 50 220 Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn p-aminobenzoic acid Thiamin Biotin Dịch trích nấm men - Môi trường Tryptone-yeast extract-sucrose(TYS): Thành phần Sucrose Na2SO4 K2HPO4 Dịch trích nấm men Biotin p-aminobenzoic acid Tryptone Antifoam C - 0.1 0.1 0.001 Hàm lượng (g/L) 60 0.18 3.48 5.0 0.01 0.01 1.0 0.5 ml Môi trường CAB: môi trường sử dụng làm môi trường giữ giống lên men tối ưu cho loài Clostridium acetobutylicum Thành phần Glucose Dịch trích nấm men Tryptone K2HPO4 KH2PO4 DL-asparagine MgSO4.7H2O MnSO4.H2O NaCl FeSO4.7H2O resazuin Hàm lượng (g/L) 50 0.7 0.7 0.5 0.1 0.1 0.1 0.015 0.002 3.2.2 Điều kiện nuôi Nhiệt độ hoạt động Clostridium nằm khoảng từ 29-37oC, tùy thuộc vào lồi mà có nhiệt độ tối thích khác nhau.Clostridium acetobutylicum có nhiệt độ tối thích nằm khoảng 35-37 oC, lồi Clostridium beijerinckii lại 31-32 oC Clostridium saccharobutylicum 30 oC Đa số trình nhân giống lên men sử dụng vi khuẩn Clostridium acetobutylicum trì 35 oC SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn pH yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến khả sinh trưởng tạo sản phẩm Clostridium Khoảng pH tối thích lồi thuộc giống Clostridium nằm khoảng từ 5.0-6.5, thay đổi làm giảm pH 4.5 có khả gây ức chế sinh trưởng vi khuẩn Đa số môi trường ban đầu chỉnh pH=6.5, nhiên với trình sinh trưởng vi khuẩn lại sinh hợp chất axit butyric, propionic acetic làm giảm pH mơi trường Vì vậy, cần kiểm sốt điều chỉnh pH suốt q trình sinh trưởng vi khuẩn 3.3 Các loài vi sinh vật dùng sản xuất butanol Như giới thiệu trên, lồi có khả sinh tổng hợp butanol bao gồm bốn lồi là: Clostridium acetobutylicum, C beijerinckii, C saccharobutylicum Clostridium saccharoperbutylacetonicum Clostridium acetobutylicum lồi có đặc tính di truyền khác biệt liên quan đến ba lồi cịn lại Những chủng thuộc lồi phát triển tốt mơi trường chất từ dịch thủy phân tinh bột nên sử dụng phổ biến quy mô công nghiệp để sản xuất dung mơi Clostridium acetobutylicum lồi nghiên cứu sản xuất dung môi nhiều nhất, nhiều chủng phát triển từ loài cho khả tổng hợp butanol cao Cho đến nay, số kết lên men tốt từ chủng C acetobutylicum PCSIR-10 có khả kháng butanol, sử dụng chất rỉ đường mía thực Syed (1994) Theo đó, tổng nồng độ dung mơi đạt 19.2 g/L với hiệu suất 34% Loài Clostridium beijerinckii liên quan nhiều đến hai loài C saccharobutylicum C saccharoperbutylacetonicum Cả ba biết đến vi sinh vật saccharolyticsử dụng loại đường làm chất lên men hầu hết chủng lên men đường quy mơ cơng nghiệp thuộc lồi C beijerinckii Mặc dù C.acetobutylicum nghiên cứu nhiều sản xuất dung môi C beijerinckii lại cho thấy nhiều ưu điểm có tiềm việc ứng dụng sản xuất quy mô công nghiệp C beijerinckii có khoảng pH tối thích rộng việc sinh trưởng tạo dung mơi Bên cạnh C beijerinckii đối tượng tiềm việc ứng dụng kĩ thuật chuyển gene nhằm tạo chủng có khả sử dụng đa dạng nguồn carbohydrate (Ezeji, et al., 2004) Với C beijerinckii, người ta cho chủng có khả chịu tác động acid nồng độ cao nên thích hợp trình lên men liên tục so với chủng từ C.acetobutylicum (theo Grube & Gapes, 2002; Zverlov cộng sự, 2006) Trong nghiên cứu Ezeji cộng (2004), chủng C beijerinckii BA101 sử dụng linh hoạt nhiều nguồn chất khác cho nồng độ dung môi đạt từ 14.8-26.1 g/L với suất từ 37-50% SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn Có nghiên cứu hai lồi C saccharobutylicum C saccharoperbutylacetonicum sử dụng để lên men ABE Shaheen cộng (2000) tập hợp chủng sử dụng để lên men nhận thấy chúng phát triển tốt môi trường glucose rỉ đường mía so với mơi trường dịch ngô Kết lên men tốt thực chủng C saccharobutylicum BAS/B3/SW/336(S), sử dụng mật rỉ mía với nồng độ dường lên men 6.5% Nồng độ trung bình đạt 19.6g/L với hiệu suất 30% Bảng 3: So sánh khả lên men số chủng phân lập Chủng Môi trường/cơ chất ( 6% đường lên men) C acetobutylicum PCSIR-10b Rỉ đường b PCSIR-5 Rỉ đường a ATCC 4259 Rỉ đường ATCC 824a Rỉ đường d ATCC 824 Glucose BA 101c BA 101c NCP P260a NCP P260a Glucose Rỉ đường Rỉ đường* Rỉ đường Nồng độ dung môi (g/L) Hiệu suất (%) 19.2 15.2 9.5 7.8 20.6 34.0 30.0 15.8 13.0 42.0 C beijerinckii 24.2 42.0 22.8 39.0 21.9 33.4 18.9 31.5 C saccharobutylicum 19.6 30.0 BAS/B3/ Rỉ đường* a SW/336(S) NCP P108a Rỉ đường* 18.6 a NCP P258 Rỉ đường 18.3 C saccharoperbutylacetonicum N1-504a Rỉ đường 15.6 *: 6.5% loại đường lên men a: Shaheen cộng (2000) b: Syed (1994) c: Ezeji cộng (2004) d: Roffler cộng (1987) SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên 10 Năng suất ( g/L.h ) A:B:E 0.42 0.24 0.58 1.8:95.3:2.9 5.3:79:15.7 20.6:66.5:26.2 0.34 0.19 - 17.8:81:1.2 18.4:80.3:1.3 - - - 28.6 30.5 - - 26.0 - - ... GVHD: Lê Văn Việt Mẫn 2.2 Ứng dụng butanol thực tiễn Một ứng dụng ưu việt lớn biobutanol (butanol sinh học) sử dụng để pha trộn vào xăng dầu làm nhiên liệu cho động Trong ethanol nhận nhiều quan... giới thiệu chung butanol ứng dụng thực tiễn Dựa nghiên cứu gần trình lên men tĩnh sản xuất butanol trình bày số chủng Clostridium phân lập có khả sinh tổng hợp chịu nồng độ butanol cao Giới thiệu... chiết butanol từ dịch sau lên men giới thiệu viết SVTH: Nguyễn Phan Duy Nguyên Đồ án chuyên ngành GVHD: Lê Văn Việt Mẫn CHƯƠNG 2: BUTANOL 2.1 Giới thiệu chung Butanol (danh pháp IUPAC, 1 -butanol;