Đề tài sản xuất vitamin b12 trên quy mô công nghiệp

Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Lời mở đầu Vitamin B12 loại vitamin cần thiết cho thể ngƣời Trong thể, tồn dƣới dạng bốn dẫn xuất m| ngƣời ta gọi cobalamin hoạt động nhƣ c{c yếu tố enzyme Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng viatmin B12 việc chữa trị bệnh thiếu máu ác tính bệnh viêm dây thần kinh Vitamin B12 có nhiều thực phẩm từ nguyên liệu động vật, thực vật chứa vitamin B12 Vì nhu cầu tổng hợp viatmin B12 quy mô công nghiệp thiết yếu, để bổ sung vitamin B12 cho ngƣời ăn chay trƣờng chữa loại bệnh thiếu vitamin B12 Trong cơng nghiệp, vitamin B12 hồn tồn đƣợc tổng hợp vi sinh vật Chúng em xin c{m ơn thầy Lê Văn Việt Mẫn tạo điều kiện cho chúng em có dịp tìm hiểu thực đề tài tiểu luận Sản xuất vitamin B12 quy mô công nghiệp, để chúng em đ{p ứng yêu cầu nắm vững kiến thức môn học Cơng nghệ lên men Trong q trình thực chúng em cố gắng nhƣng khơng thể tránh khỏi sai sót, c{m ơn thầy tận tình giúp đỡ sửa chữa để làm chúng em đƣợc hồn chỉnh Nhóm thực Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn PHẦN I: TỔNG QUAN I GIỚI THIỆU CHUNG Vitamin l| chất hữu không cung cấp lƣợng cho tế b|o qu{ trình ph{t triển Tuy nhiên, vai trị vitamin lại vơ quan trọng cho hoạt động sống tế b|o: vitamin thúc đẩy c{c qu{ trình trao đổi chất v| l| th|nh phần thiếu đƣợc cấu tạo nhiều loại enzym Do việc nghiên cứu, sản xuất vitamin trở nên cần thiết Vitamin đƣợc sử dụng chủ yếu ba lĩnh vực:  Y học  Thực phẩm cho ngƣời  Thức ăn gia súc C{c nh| khoa học {p dụng nhiều phƣơng ph{p kh{c công nghệ sản xuất vitamin Bao gồm c{c phƣơng ph{p sau:  Chiết rút từ nguồn nguyên liệu thực vật v| động vật  Tổng hợp hóa học  Tổng hợp sinh học Cả ba phƣơng ph{p có ƣu v| nhƣợc điểm riêng, v| phƣơng ph{p cho vitamin riêng Do để sản xuất vitamin từ c{c nguồn nguyên liệu v| phƣơng ph{p kh{c nhau, ngƣời ta thƣờng nhắm v|o hiệu phƣơng ph{p, gi{ th|nh đóng vai trị quan trọng cho việc định phƣơng ph{p sản xuất Công nghệ sản xuất vitamin theo phƣơng ph{p sinh học tập trung v|o số vitamin đặc trƣng v| có hiệu nhất, bao gồm vitamin B12, vitamin B2, hỗn hợp vitamin D2 vitamin nhóm B khác Cơng nghệ lên men thực phẩm II GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn VITAMIN B12 Giới thiệu chung  Thuật ngữ vitamin B12 rộng, dùng để hợp chất có chứa cobalamin ph}n tử có chứa kim loại Coban Tại hội nghị quốc tế hóa sinh năm 1961, c{c nh| b{c học đề nghị gọi tên nhóm vitamin B12 corinoit Hiện ngƣời ta biết khoảng 100 loại chất tƣơng tự vitamin B12 số có c{c chất quan trọng thƣờng gặp nhƣ cyancobalamin (B12), hydroxycobalamin (B12 ‚b‛), nitritocobalamin (B12 ‚c‛) Hợp chất corinoit bị loại coban đƣợc gọi l| corin, cịn acid corinic corin có c{c nh{nh bên Dạng tự nhiên hợp chất cobalamin l| adenosylcobalamin, methylcobalamin hydroxocobalamin  Cyanocobalamin, đƣợc định nghĩa l| vitamin B12, l| hợp chất cobalamin bền vững, đƣợc sản xuất quy mơ cơng nghiệp nhƣng khơng tìm thấy tự nhiên Vitamin B12 l| vitamin quan trọng để chữa bệnh thiếu m{u nguy hiểm v| bệnh viêm d}y thần kinh ngoại biên, đồng thời l| vitamin quan trọng cần bổ sung phần ăn động vật v| ngƣời  Bởi tổng hợp vitamin B12 phƣơng ph{p hóa học khó khăn v| tốn nên ngƣời ta thƣờng sản xuất vitamin B12 đại trà phƣơng pháp lên men vi sinh vật gi{n đoạn kết hợp gi{n đoạn liên tục Tính chất vitamin B12  Vitamin B12 có cơng thức hóa học C63H90N14O14PCo  Cấu trúc hóa học vitamin B12 bao gồm: - Một mặt phẳng chứa vòng pyrol nguyên tử coban chiếm vị trí trung tâm c{c vịng - Phần thứ hai phân tử nhóm nucleotid thẳng góc với mặt phẳng, phần nucleotid bao gồm thành phần bazơ nitơ l| dimetyl benzimidazol thành phần đƣờng -D-ribofuranoza Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình 1: Cấu trúc phân tử vitamin  Vitamin B12 thƣờng dạng kết tinh, có kích thƣớc nhỏ, m|u đỏ sẫm, khơng có mùi vị  Tan nƣớc, dung dịch trung tính, cồn; khơng tan eter, acetol, benzen, clorofoc  Chúng bền nhiệt dạng cyamit, nhƣng tiếp xúc với kim loại nặng dễ hoạt tính, vitamin B12 khơng bền mơi trƣờng pH kiềm Có thể nói vitamin B12 có ý nghĩa quan trọng qu{ trình trao đổi chất: thiếu không đủ vitamin B12 thể ngƣời v| động vật g}y tƣợng rối loạn trao đổi chất hydratcacbon v| axit béo Cụ thể:  Vitamin B12 tham gia v|o việc sinh tổng hợp enzym metyl malomye – CoA - mutase v| nhiều enzym quan trọng kh{c C{c enzym n|y tham gia v|o c{c phản ứng chuyển metyl v| qu{ trình tổng hợp methionin, cholin, thimin Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn  Vitamin B12 tham gia v|o việc đảm bảo hoạt động c{c quan tạo m{u v| l|m tăng cƣờng c{c phản ứng bảo vệ thể Thiếu vitamin dẫn tới tho{i hóa mỡ gan  Cùng với methionin, vitamin B12 tham gia v|o qu{ trình trao đổi nhóm methyl Vitamin B12 giúp thể tổng hợp methionin từ homosistein Hình Phân tử vitamin B12 Sản xuất vitamin B12 quy mô công nghiệp  Khi vitamin B12 đƣợc sản xuất theo quy mô cơng nghiệp ta phải quan tâm, kiểm so{t đến c{c yếu tố nhƣ giống vi sinh vật, chất sử dụng, qu{ trình phản ứng v| qu{ trình thu nhận, tinh chế sản phẩm Bản chất qu{ trình sản xuất theo quy mô công nghiệp l| sản phẩm qu{ trình có định hƣớng rõ r|ng, qui trình sản xuất đƣợc kiểm so{t từ kh}u sản xuất giống đến qu{ trình lên men v| cuối l| qu{ trình thu nhận sản phẩm  Nhƣ qu{ trình lên men công nghiệp thực chất l| thực v| kiểm so{t công việc sau:  Tạo giống v| n}ng cao chất lƣợng giống Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn  Tính to{n, thiết kế, chế tạo c{c thết bị lên men phù hợp với công nghiệp v| sản phẩm  Thực c{c kĩ thuật lên men  T{ch, thu nhận v| tinh chế sản phẩm - Để l|m đƣợc việc cần phải giải hai vấn đề sau: a) Kỹ thuật lên men: nghiên cứu điều kiện tối ƣu qu{ trình lên men nhƣ thiết bị, cơng nghệ…nhằm đạt đƣợc hiệu suất cao cho c{c sản phẩm mong muốn b) Kỹ thuật thu hồi sản phẩm sau lên men v| chế biến th|nh c{c dạng thƣơng phẩm, nghiên cứu c{c điều kiện trích ly, tinh chế nhằm thu đƣợc c{c chất có hoạt tính sinh học dạng tinh khiết Nhiều kỹ thuật cơng nghiệp hóa học nhƣ: lọc, kết tủa, ly t}m, kết tinh, hấp phụ, chƣng cất, sấy… đƣợc sử dụng đ}y Điều kiện kh{c cần lƣu ý tới l| c{c chất có hoạt tính sinh học thƣờng khơng bền vững với c{c điều kiện nhiệt độ, pH v| c{c yếu tố vật lý khác - Điều kiện v| phƣơng ph{p nuôi cấy vi sinh vật có ảnh hƣởng đến hình thành thành phần tính chất chất lỏng canh trƣờng Các chế độ sinh tổng hợp cần hƣớng tới kết thu nhận mơi trƣờng có chất tạp chất khác lại tồi thiểu có nồng độ sản phẩm mong muốn cực đại Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn PHẦN II: NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT Sản xuất vitamin B12 công nghiệp từ nguyên liệu vi sinh vật v| rỉ đƣờng hay hèm rƣợu, dịch whey I VI SINH VẬT Yêu cầu nguyên liệu Trong công nghệ lên men, giống vi sinh vật đóng vai trị quan trọng, ảnh hƣởng đến suất, chất lƣợng v| gi{ th|nh sản phẩm Nhƣ vậy, giống vi sinh vật sử dụng công nghệ lên men vitamin B12 phải thỏa mãn yêu cầu sau:  Giống vi sinh vật phải cho vitamin B12 có chất lƣợng v| số lƣợng cao hẳn c{c sản phẩm phụ kh{c  Năng suất cao  Phải có khả đồng hóa c{c nguyên liệu rẻ tiền v| dễ kiếm  Sản phẩm qu{ trình phải dễ d|ng t{ch khỏi c{c tạp chất môi trƣờng v| sinh khối vi sinh vật giống  Vi sinh vật phải khiết  Vi sinh vật phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất cơng nghiệp, ổn định nhiệt độ, {p suất thẩm thấu, pH  Giống phải có tốc độ sinh sản v| ph{t triển mạnh điều kiện môi trƣờng công nghiệp  Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo sản phẩm mong muốn  Giống phải ổn định bảo quản v| điều kiện bảo quản dễ d|ng Vi sinh vật sản xuất vitamin B12 - Hiện nay, khoa học kh{m kh{ nhiều vi sinh vật tham gia qu{ trình sinh tổng hợp vitamin B12 Một số quy trình sản xuất vitamin đƣợc biết đến l| quy trình sản xuất vitamin từ vi khuẩn Propionic, từ xạ khuẩn Actinomyces olivacens, v| vi khuẩn sinh khí metan Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn - Một số vi khuẩn có khả sản xuất vitamin: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium sticklandii, Clostridium radiobacter, Bacillus tetanomorphum, megaterium, Clostridium Clostridium thermoaceticum, Corynebacterium XG, Eubacterium limosum, Methanobacterium arbophilicum, Methanobacterium ivanovii, Methanobacterium ruminantium, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanosarcina barkeri, Propionibacterium freudenreichii, Propionobacterium shermanii, Protaminobacter ruber, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas putida, Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas sphaeroides, Salmonella typhimurium, Spirulina platensis, Streptomyces antibioticus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces griseus, Streptomyces olivaceus , ngồi cịn có giống thuộc xạ khuẩn Actinomyces Hình 3: Vi khuẩn Propionibacterium freudenreichii - Trƣớc đ}y, ngƣời ta sử dụng chủ yếu Streptomyces griseus để sản xuất vitamin quy mô công nghiệp nhƣng vi khuẩn Propionibacterium shermanii Pseudomonas denitrificans thay ho|n to|n vi khuẩn Streptomyces - Nguyên nhân: Vitamin B12 l| sản phẩm phụ sản phẩm Streptomixin nhờ Streptomyces griseus hay l| sản phẩm phụ qu{ trình sản xuất Clotetracyclin nhờ Str Aureofaciens C{c qu{ trình n|y thƣờng tạo đƣợc lƣợng vitamin B12 mg/l dịch ni cấy nên khó t{ch 10 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Việc sản xuất dựa v|o Propionibacterium shermanii hay P freudenreichii cho hiệu suất vitamin cao Tế b|o c{c vi khuẩn n|y chứa lƣợng vitamin khoảng 20 mg/l 2.1 Vi khuẩn propionic a Phân loại vi khuẩn propionic - Đặc điểm chung:  Vi khuẩn propionic loại vi khuẩn Gram dƣơng, không di động, không sinh bào tử, kị khí khơng bắt buộc  Chúng có hình cầu, xếp th|nh đôi chuỗi  Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu vi khuẩn 300C.Lƣợng G+C DNA chúng nằm khoảng 53-67 mol% Phân loại: vi khuẩn Propionic đƣợc phân loại thành nhóm: -  Nhóm vi khuẩn propionic sống sản phẩm sữa Chúng phát triển môi trƣờng phômai sữa Trên sở tính tƣơng đồng DNA thành phần cấu tạo thành tế bào, nhóm vi khuẩn propionic sống sản phẩm sữa đƣợc phân loại thành loài: Propionibacterium freudenreichii, P jensenii, P.theonii, P.acidipropionici, P.coccoides P.cyclohexanicum  Nhóm vi khuẩn propionic sống da Mơi trƣờng sống giống propionic sống da l| da ngƣời.Nhóm vi khuẩn sống da đƣợc phân loại thành lồi: P.acnes, P.avidium, P.granulosum, P.lymphophilums, P.propionicum Propioniferax innocua Nhóm vi khuẩn sống da có dạng que, kị khí  Tr{i ngƣợc với vi khuẩn propionic sống da, nhóm vi khuẩn propionic sống sản phẩm sữa khơng sản sinh indole khơng thể hóa lỏng gelatin Hơn nữa, hai nhóm đƣợc phân biệt rõ dựa vào đặc điểm sinh lý học Do đó, hai nhóm vi khuẩn propionic khác chủ yếu dựa môi trƣờng sống tự nhiên chúng 11 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn b Đặc điểm vi khuẩn Propionibacterium shermanii Hình Vi khuẩn Propionibacterium shermanii Trong giống vi khuẩn tham gia tổng hợp vitamin B12 có giống Propionibacterium shermanii giống có nhiều ƣu điểm đƣa v|o sản xuất cơng nghiệp Vi khuẩn có số đặc điểm quan trọng đƣợc tóm tắt nhƣ sau:  Chúng có khả lên men acid lactic, glycerol, glucose, fructose, manit, lactose  Khoảng pH hoạt động 4,5 - 7,5, pH tối ƣu cho việc sinh tổng hợp vitamin B12 5,8-7,5  Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 28 - 300C  Các chất dinh dƣỡng cho phát triển bao gồm muối amon, nƣớc amoniac, CoCl2 Co(NO3)2; kim loại nhƣ Fe, Cu, Zn, Mn thƣờng làm giảm trình sinh tổng hợp vitamin B12  C{c vitamin l|m tăng hiệu suất tổng hợp B12 bao gồm thiamin, biotin, acid nicotinic, acid tolic 2.2 Xạ khuẩn Actinomyces Trong tất giống thuộc Actinomyces có giống Actinomyces olivaceus có khả tổng hợp vitamin B12 cao v| chúng đƣợc sử dụng để sản xuất vitamin B12 theo quy mô công nghiệp Một số đặc điểm quan trọng giống xạ khuẩn n|y đƣợc tóm tắt nhƣ sau:  Xạ khuẩn Act Olivacens thuộc loại hiếu khí 12 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn - Cơ thể vi sinh vật l| thể dễ đồng hóa nhiều loại nguyên liệu kh{c Do nguyên liệu dùng cho qu{ trình sản xuất rẻ tiền v| dễ kiếm - Cơ thể vi sinh vật l| thể đơn b|o v| l| thể sinh vật có khả thực c{c qu{ trình sản xuất cơng nghiệp để sản xuất h|ng loạt v| có kiểm so{t Thao t{c di truyền: Để thực việc chuyển gen từ thể n|y sang thể kh{c, ngƣời ta thực c{c giai đoạn sau: a T{ch DNA vật cho Đ}y l| công việc đƣợc định tính trạng đặc biệt gen n|o DNA vật m| ta quan t}m Trƣớc thu nhận gen n|y ta phải t{ch đƣợc DNA Việc t{ch DNA đƣợc thực trƣớc tiên c{ch ph{ vỡ th|nh tế b|o Đối với vật cho l| vi sinh vật, ngƣời ta thƣờng dùng lizozym Sau ngƣời ta dùng dosysulfate 1% để loại protein Sau 2,5 lắc m{y lắc, ngƣời ta tiến h|nh ly t}m v| dùng pipet hút lấy phần dịch Sau cho thêm ete với liều lƣợng tƣơng đƣơng, lắc mạnh v| li t}m phút với tốc độ ly t}m 2000 vịng/phút Khi DNA nằm lớp dƣới ống ly t}m Bằng c{ch n|y ta t{ch đƣợc DNA khỏi phenol v| protein Bỏ lớp dịch kết tủa DNA cồn Ta nhận DNA c{ch dùng đầu đũa thủy tinh cuộn sợi DNA đầu đũa thủy tinh Nếu chƣa sử dụng ta bảo quản DNA cồn 70%/V v| để tủ lạnh b Chọn vector chuyển gen Vector chuyền gen thƣờng phải có yêu cầu sau: Vector pahir có trình tự chép để có khả tự chép, tồn độc lập Vector phải có trình tự điều hịa, tạo điều kiện thuận lợi cho phiên mã gen Vector phải đảm bảo tính bền vững di truyền DNA t{i tổ hợp dạng độc lập gắn thêm v|o nhiễm sắc thể tế b|o chủ 48 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Vector có gen đ{nh dấu để dễ d|ng ph{t chúng c{c gen lạ gắn v|o Vector có gen l|m vơ hiệu hóa đoạn DNA khơng mong muốn bị gắn v|o Vector chứa nhiều để t{ch đƣợc khỏi tế b|o với số lƣợng lớn v| dảm bảo khuyếch đại gen nhƣ chất hoạt hóa T{c chọn c{c loại vector l| c{c plasmid, phage, cosmid để chuyển tải c{c đoạn DNA vật cho sang vật nhận c Tiến h|nh việc chuyển gen Qu{ trình chuyển gen đƣợc thực nhiều phƣơng ph{p kh{ Hiện việc chuyển gen v|o tế b|o thực vật v| tế b|o động vật thƣờng đƣợc thực c{ch: - Chuyển gen nhờ vector chuyển gen - Dùng súng bắn gen Đối với tế b|o kích thƣớc qu{ nhỏ khơng thể sử dụng phƣơng ph{p bắn gen đƣợc, phƣơng ph{p chuyển gen nhờ vector chuyển gen đƣợc thực nhiều Để thực điều trƣớc tiên ngƣời ta phải dùng enzym cắt giới hạn c{c gen DNA vật cho v| chuyển chúng v|o vector chuyển gen có tham gia ligase v| số chất l|m tăng c{c qu{ trình n|y Sau nhờ vector chuyển đoạn gen n|y sang thể nhận Cuối l| kiểm tra tính trạng m| ta quan t}m thể nhận có đƣợc biểu khơng  Hệ thống thao t{c di truyền lo|i vi khuẩn propionic C{c lo|i giống vi khuẩn propionic đƣợc sử dụng c{ch rộng rãi việc sản xuất vitamin B12, c{c hợp chất tetrapyrole, acid propionic nhƣ công nghiệp sản xuất phômai v| propiotic Shuttle vector đƣợc ph{t triển lo|i propionic để sử dụng replicon từ plasmid nội b|o vi khuẩn propionic v| Escherichia coli v| tế b|o nhận thích hợp Sự chuyển nạp hiệu ho|n th|nh vật chủ trung gian đƣợc chuẩn bị từ lo|i 49 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn vi khuẩn Propionic freudenreichii để vƣợt qua hệ thống high restriction modification vi khuẩn propionic Vector chuyển gen với chất hoạt hóa tự nhiên đƣợc sử dụng lo|i vi khuẩn propionic đƣợc ph{t triển Sử dụng hệ thống n|y, cholesterol oxidase đƣợc sử dụng nhƣ enzym ph{t hiện, đƣuọc sản xuất nhờ lo|i P.freudenreichii Gen chứa việc sinh tổng hợp acid 5-aminolevulinic(ALA) v| vitamin B12 vi khuẩn propionic đƣợc ph}n lập ALA vi khuẩn propionic đƣợc tổng hợp đƣờng C4( ngƣng tụ glycin v| succinyl CoA) v| đƣờng C5( từ glutamat) Gen hem A mã hóa enzym ALA synthase từ lo|i Rhodobacter spheroides, ALA đƣợc tích lũy P.freudenreichii Do đó, hệ thống thao t{c di truyền lo|i vi khuẩn propionic tạo điều kiện cho việc nghiên cứu di truyền qu{ trình sinh tổng hợp probiotic v| vitamin B12 Hình 24 Plasmids chủng vi khuẩn propionic 50 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Khoảng 20% vi khuẩn propionic đƣợc tìm thấy mang hai plasmid Hình thù plasmid đƣợc phân biệt dựa đồ kích thƣớc Kích thƣớc plasmid nằm khoảng 4.4Mdal tới 119Mdal cao v| đƣợc đặt tên prGO1 tới prGO7, chủng P.freudenreichii chứa thơng tín plasmid đơn giản chủng P.acidipropionici chứa plasmid 4.4 Mdal Plasmid 4.4 Mdal, pRGO1 bình thƣờng đƣợc tìm thấy trong chủng P.acidipropionici, P.freudenreichii P.jensenii Plasmid pLME106(6.9 kb) pLME108(3.6 kb) đƣợc tìm thấy P.jensenii P freudenreichii Các plasmid p545 v| p546, đƣợc tìm thấy chủng P.freudenreichii LMG16545 P.freudenreichii LMG16546, cs kích thƣớc 3.6 kb có mối quan hệ mật thiết với Chuỗi nucleotit plasmid pRGO1(số đăng kí AB007909), pLME106( số đăng kí AJ250233), pLME108(số đăng kí AJ006662) p545(số đăng kí AF291751) đƣợc x{c định Đặc biệt, plasmid pLME106 P.jensenii chứa 100% chuỗi nucleotit đồng với plasmid pRG01 P.acidipropionici, phân tích chuỗi orf1 orf2, mã hóa chép protein, RepA RepB plasmid pRGO1 có 46%-53% tƣơng đồng với plasmid p545 Protein RepA có tính tƣơng đồng với chép theta tìm thấy nhiều lồi vi khuẩn gram dƣơng có h|m lƣợng GC cao, cho thấy plasmid pRGO1, pLME106 p545 chép thơng qua chép kiểu theta Thêm v|o đó, protein RepB đóng vai trị chép plasmid ban đầu III Nghiên cứu việc ổn định thuốc viên nén vitamin B1+B6+B12: Trong c{c dƣợc chất, vitamin, đặc biệt l| vitamin B12 bền vững Với phƣơng ph{p kiểm nghiệm l| phƣơng ph{p sắc kí lỏng hiệu cao, việc ph{t h|m lƣợng không đạt tiêu chuẩn vitamin B12 trở nên dễ d|ng Vitamin B12 dễ hút ẩm, tiếp xúc với môi trƣờng ẩm dễ bị phân hủy đƣa đến giảm h|m lƣợng 51 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Vì thực tế, để sản xuất thuốc dạng viên nén, nhà sản xuất dùng vitamin B12 bao gelatin kết hợp t{ dƣợc hút ẩm polyvinyl pyrrolidon (PVP) công thức để ổn định hoạt chất Do thuốc vitamin B1+B6+B12 đƣợc ƣa chuộng sử dụng nhiều nên nhu cầu đặt cần cải thiện việc sản xuất thuốc loại n|y nhƣ n|o để ổn định thuốc, giúp đạt chất lƣợng suốt thời hạn sử dụng Phƣơng ph{p: nghiên cứu cải tiến bào chế vitamin B1+B6+B12 c{ch dùng t{ dƣợc Kollidon CL-M để ổn định thuốc kết hợp với phân tán vitamin B12 trạng thái khơ thay hịa tan cồn nhƣ quy trình sản xuất trƣớc đ}y l|m Khí hậu nƣớc ta thuộc nhiệt đới ẩm, nên việc bảo quản thuốc tƣơng đối khó khăn.Ở thành phố Hồ Chí Minh nhiệt độ trung bình năm l| 270C, độ ẩm trung bình l| 79.5%, l| điều kiện bất lợi cho việc bảo quản thuốc Kollidon CL-M sản phẩm thƣơng mại PVP Đ}y l| loại crospovidone khơng hịa tan, dạng hạt mịn, có tác dụng ổn định thuốc 52 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn IV Sản phẩm Tempeh Quy trình sản xuất Tempeh Phơi khơ đậu nành Phân loại theo kích cỡ Bóc vỏ thiết bị nghiền đá mài Lắng tách vỏ Ngâm lần qua đêm nhiệt độ phòng Nấu 60 phút với nước ngâm Ngâm lần qua đêm nhiệt độ phòng Đặt lưới plastic Phun hay nấu 30 phút Tháo nước làm lạnh Cấy hỗn hợp bột “ragi tempeh” sắn hột Đóng túi plastic (khoảng 200g) bịt kín Ủ giá tre khoảng 36 – 40 Tempeh 53 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Sản xuất vitamin B12 trình lên men sản phẩm Tempeh Tempeh l| sản phẩm lên men truyền thống từ đậu n|nh Indonesia Sau ng}m, đậu đƣợc nấu lần Sau giai đoạn lên men với chất dạng rắn, chúng đƣợc cấy chuyền với chủng mốc Rhizopus spp Theo kiểu truyền thống đậu đƣợc ng}m qua đêm, sau đƣợc acid hóa tức thời Trong phƣơng ph{p công nghiệp dùng acid lactic Tempeh quan trọng chứa h|m lƣợng cao acid amin, acid béo v| vitamin Vitamin quan trọng l| B12, thƣờng khơng tìm thấy c{c thực phẩm thực vật Trong c{c vi sinh vật sản xuất vit B12 giống Citrobacter freundii cho lƣợng vitamin B12 nhiều Giống Klebsiella pneumoniae cho lƣợng lớn vit B12 C{c giống họ Enterobacteriaceae đƣợc biết sinh độc tố enterotoxin Khuynh hƣớng ng|y l| nghiên cứu ảnh hƣởng c{c biến số lên men v| cấu trúc vit B12 Nguyên liệu v| phƣơng ph{p Vi sinh vật: nấm mốc Rhizopus oligosporus đƣợc ph}n lập từ Tempeh, cung cấp lƣợng lớn c{c vitamin hòa tan nƣớc đƣợc sử dụng để lên men Tempeh C.freubdii K.pneumoniae đƣợc thêm v|o giai đoạn đầu lên men chúng tạo nhiều vitamin B12 suốt qu{ trình lên men với chất dạng rắn Quá trình lên men Tempeh: phƣơng ph{p đại đƣợc tiến h|nh theo tiêu chuẩn: đậu n|nh (300g) đƣợc cấy v|o 1.8ml giống R ologosporus (106 tế b|o/ml dd NaCl 0.9%, tƣơng đƣơng 6×103 tế b|o/g đậu), giống C.freubdii K.pneumoniae (107 tế b|o/ml dd NaCl 0.9%, tƣơng đƣơng 6×104 tế b|o/g đậu), nhiệt độ 320C 34 Phƣơng ph{p truyền thống đƣợc tiến h|nh (với C.freubdii) nhƣ sau: đậu đƣợc rửa v| nấu với nƣớc khử kho{ng (3 lần) 30 phút Trong giai đoạn l|m nguội, nƣớc ng}m đƣợc cấy v|o C.freundii (3×107tế b|o/ml) Nhiệt độ khoảng 300C 15 Sau ph}n riêng nƣớc v| đậu, 54 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn đậu đƣợc t{ch bỏ vỏ, nấu lại sau 30 phút, sấy khô bề mặt v| chia th|nh phần phần đƣợc tiệt trùng (trong autoclave) trƣớc thực qu{ trình SSF với Rhizopus sp , v| phần cịn lại khơng phải tiệt trùng Một phần đậu ng}m nh}n tạo v| phần phƣơng ph{p truyền thống đƣợc chia l|m phần phần cấy Rhizopus sp C.freundii, phần thứ cấy có Rhizopus sp phần cấy Rhizopus sp C.freundii (kiểm chứng) Sự biến đổi thơng số q trình lên men: Nhiệt độ cấy lên men l| 24, 28 v| 320C Ảnh hƣởng số lƣợng kh{c tế b|o vi khuẩn lên vit B12 đƣợc nghiên cứu từ 103 đến 108 bế b|o ml3 (tƣơng đƣơng 7-7×105 tế b|o/g đậu) Phân tích vit B12: mẫu thử nghiệm ph}n tích kh{c biệt loại B12 (cobalamin) sử dụng cho ngƣời v| loại khơng thể Tất mẫu ph}n tích vit B12 đƣợc tiến h|nh lần nồng độ kh{c Độ lệch phải dƣới 7.5% C{c yếu tố ảnh hƣởng Ảnh hưởng nhiệt độ lên men: với lo|i Rhizopus sp C.freundii, nhiệt độ lên men 320C cho lƣợng vitamin B12 nhiều Nếu giảm nhiệt độ từ 320C xuống 280C 240C giảm lƣợng vit B12 Một ảnh hƣởng nhiệt độ thấp l| kéo d|i thời gian lên men cho Rhizopus sp từ 34 (320C) lên 50 (280C) v| 67 (240C) Giống C.freundii cho nhiều vit B12 so với giống K.pneumoniae nhiệt độ n|o Nhiệt độ (0C) Cyanocobalamin (ng g/ khối lƣợng khô) C.freundii K.pneumoniae 24 114 74 28 130 95 32 152 135 55 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Ảnh hưởng cobalt 5,6-dimethylbenzimidazole: thêm v|o cobalt l|m tăng vit B12 Lên men với K.pneumoniae đƣợc bổ sung lƣợng nhỏ cobalt (II)-sulfate-heptahydrate l|m tăng nhanh vit B12 từ 73 lên 170 ng g/khối lƣợng khô Sự tăng vit B12 thêm cobalt C.freundii theo đƣờng thẳng v| đạt đến tối đa 290 ng g/khối lƣợng khô Tuy nhiên dự đo{n khơng hiệu hiệu suất thấp v| đạt tối đa 0.014 Sự thêm v|o 5,6-dimethylbenzimidazole l|m tăng vit B12 đặc biệt h|m lƣợng thấp (0-100mg/l) Tr{i lại lên men với K.pneumoniae, ta dùng C.freundii cho kết tốt với h|m lƣợng lên đến 300 mg/l Hiệu suất hợp 5,6-dimethylbenzimidazole vào vit B12 thấp v| đạt gi{ trị cao khoảng 0.013 Số lƣợng tế b|o không bị ảnh hƣởng việc thêm v|o chất n|y v| so s{nh đƣợc tất qu{ trình lên men Ảnh hưởng số lượng tế bào cấy vào (trường hợp C.freundii): Mặc dù số lƣợng tế b|o ban đầu khoảng 105 đến 106 (g/khối lƣợng ƣớt), sau 27 số tế b|o đạt mức 109 đến 1010 (g/khối lƣợng ƣớt) Sự tăng tốc độ ph{t triển tăng lƣợng nhỏ vi sinh vật cấy v|o Sau 27 giờ, lƣợng B12 thu đƣợc c{c trƣờng hợp đạt gần gi{ trị 150-160 ng g/khối lƣợng khô, phù hợp với gia tăng số lƣợng tế b|o Ảnh hưởng xử lý sơ trình lên men với chất dạng rắn lên lượng B12: Những công nghệ kh{c đƣợc so s{nh hiệu tạo B12 suốt qu{ trình lên men với chất dạng rắn Lên men đƣợc tiến h|nh ng}m đậu lactate, v| cấy v|o giống C.freundii, Rhizopus sp cho kết tốt Tempeh chuẩn bị phƣơng ph{p ng}m truyền thống (ng}m đậu v| cấy vào C.freundii) cấy thêm Rhizopus sp trƣớc thực qu{ trình lên men với chất dạng rắn cho lƣợng vitamin B12 thấp Cũng có kh{c biệt tempeh có qua tiệt trùng autoclave v| khơng qua tiệt trùng Mẫu thí nghiệm đậu qua tiệt trùng, có C.freundii đƣợc ph{t sau SSF Mẫu thí nghiệm khơng qua tiệt trùng đƣợc cấy C.freundii, sau ph}n lập Bacillus cereus đƣợc ph{t Tempeh ng}m với phƣơng ph{p truyền thống kết hợp không tiệt trùng (cấy v|o 56 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn C.freundii, Rhizopus sp) cho nhiều vit B12 tempeh l|m theo phƣơng ph{p truyền thống kết hợp không tiệt trùng (chỉ cấy có Rhizopus sp) Bảng : Hàm lƣợng B12 v| số tế b|o qu{ trình lên men l|m Phƣơng ph{p lên men H|m lƣợng vitamin B12 Số khuẩn lạc từ (ng g/ khối lƣợng khơ) C.freundii (×109) R.oligosporus + C.freundii Ngâm lactate 53.9 50.0 Tiệt trùng 48.8 35.0 Không tiệt trùng 33.0 50.0 Ngâm lactate ND ND Tiệt trùng ND ND Không tiệt trùng 23.2 5.0 Ngâm lactate ND ND Tiệt trùng ND ND Không tiệt trùng 3.5 0.1 R oligosporus Mẫu ‚sạch‛ đối chứng Chú thích:  Độ lệch ≤ 7.5%  Đối với không tiệt trùng, đậu đƣợc ng}m qua đêm với C.freundii nấu nhƣng không tiệt trùng sau ngâm  Đối với không tiệt trùng, đậu đƣợc ng}m qua đêm với C.freundii , nấu tiệt trùng  Đối với ng}m lactate, đậu đƣợc ngâm với lactate tiệt trùng sau ngâm nấu 57 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn  ND (not detectable): không phát đƣợc Mẫu đối chứng (không cấy lo|i n|o trƣớc lên men với chất dạng rắn) ngâm phƣơng ph{p truyền thống (với C.freundii), không tiệt trùng nhƣng thu đƣợc vit B12 Phân lập thu phát đƣợc C.freundii, B.cereus Micrococcus luteus Lên men tiến h|nh theo phƣơng ph{p ngâm truyền thống ngâm với lactate, đƣợc tiệt trùng sau ngâm cho kết khơng có vitamin B12 (chỉ cấy Rhizopus sp) Thảo luận Lƣợng vitamin B12 sản xuất C.freundii K.pneumoniae tăng lên ta tăng nhiệt độ lên men tr{i ngƣợc lại với acid amin tự do, acid γlinolenic tempeh tăng nhiệt độ lên men thấp (24-320C) Sản xuất vit B12 kèm với ph{t triển vi khuẩn Sự gia tăng vit B12 thêm v|o cobalt cho thấy cobalt chứa đậu gần đạt điểm cực đại h|m lƣợng vit B12 C.freundii K.pneumoniae Mặc dù thêm v|o cobalt v| 5,6-dimethylbenzimidazole làm tăng vit B12 giống vi sinh vật, nhƣng hợp chúng l| cho hiệu suất thấp Bổ sung tiền chất n|y l| khơng cần thiết, lƣợng vit B12 tạo giống vi sinh vật đủ nhiều cho nhu cầu ng|y ngƣời Sự cấy v|o số tế b|o kh{c C.freundii sản phẩm vitamin B12 liên quan đến ph{t triển vi sinh vật Điều n|y đƣợc x{c nhận cho Propionibacterium freudenreichii Hiệu suất thấp phƣơng ph{p ng}m truyền thống, không tiệt trùng cấy v|o C.freundii trước lên men với chất dạng rắn đƣợc giải thích l| tồn hỗn hợp c{c vi sinh vật môi trƣờng nuôi cấy mẫu tempeh Mơi trƣờng m| có nhiều lo|i vi sinh ngo|i C.freundii cho hiệu suất thấp hẳn môi trƣờng khiết chứa C.freundii Sự xuất C.freundii B.cereus tempeh làm theo phƣơng ph{p ng}m truyền thống, không tiệt trùng l| hiển nhiên v| mơ 58 Cơng nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn theo phƣơng ph{p Indonesia Kết nói lên vi khuẩn diện suốt qu{ trình ng}m v| đƣợc chuyển sang qu{ trình lên men Rhizopus spp có tác động tích cực lên ph{t triển vi khuẩn Lý l| khả hydro hóa nấm mốc lên c{c chất nhƣ l| acid amin (cần cho vi khuẩn ph{t triển) Hơn chất kìm hãm protease nhƣ l| Bowman-Birk đƣợc tìm thấy đậu v| kìm hãm protease vi khuẩn Tr{i lại protease nấm (loại aspartate) khơng nhạy với chất kìm hãm, ph}n giải acid amin cho dù có diện c{c chất kìm hãm protease Kết luận so s{nh c{c qu{ trình xử lý sơ trƣớc thƣc SSF phƣơng ph{p ng}m đậu lactate kết hợp cấy C.freundii cho hiệu suất tốt Họ Enterobacteriaceae chứa nhiều mầm bệnh, nhƣ l| Salmonella typhi, Shigella dysenteriae,K.pneumoniae Yersinia pestis Thêm v|o E.coli, C.freundii g}y bệnh tiêu chảy Mặc dù tempeh chƣa nhiều th|nh viên họ Enterobacteriaceae, nhƣng khơng có kiểm tra n|o cho thấy c{c vi sinh vật g}y bệnh tiêu chảy n|o lại sau ăn tempeh Tuy nhiên giống K.pneumoniae, C.freundii cần thiết cho lên men nên phải đƣợc kiểm tra khả sinh độc tố enterotoxin, vƣợt qu{ mức không đƣợc sử dụng 59 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn PHẦN VI: PHỤ LỤC Các sản phẩm vitamin B12 có thị trƣờng I Folic acid & vitamin B12 injection Th|nh phần:  Folic acid 15mg/mL  Cyanocobalamin: 500µg/mL II Vitamin B12 1000µg/1ml-Thuốc tiêm Cơng thức: Cyanocobalamin 1000 mg Kali dihydrophosphat …………………………… mg Natriclorid 2,5mg Nƣớc cất pha tiêm vđ 1ml 60 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn III Viên nén vitamin B12 Th|nh phần:  Vitamin B12 5000 mcg (83,33%)  Các thành phần khác: magnesium sterate, stearic acid, microcrystalline cellulose  Khơng có nấm men, đƣờng, màu nhân tạo, chất tạo vị, chất bảo quản 61 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn PHẦN VII: TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]: Nguyễn Đức Lƣợng, ‚Công nghệ vi sinh tập 2: Vi sinh vật học công nghiệp”, Nhà xuất ĐHQG TP.HCM, 2002 [2]: Lê Bạch Tuyết, ‚Các q trình cơng nghệ sản xuất thực phẩm”, NXB GD, 1996 [3] Nguyễn Tiến Thắng ‚Giáo trình sinh hóa đại”, NXB GD, 1998 *4+: Ronald R Eitenmiller and W.O.Landen, Jr, ‚Vitamin analysis for the health and the food sciences”, CRC Press LLC, 1999 [5]: “ Vitamins In Foods Analysis, Bioavailability, and Stability”, Taylor & Francis Group, LLC, 2006 [6]: www.freepatentsonline.com [7]: www.journal@chive.com [8]: www.spingerlink.com [9]: www.sinhhocvietnam.com 62 ... vitamin B12 tham gia v|o qu{ trình trao đổi nhóm methyl Vitamin B12 giúp thể tổng hợp methionin từ homosistein Hình Phân tử vitamin B12 Sản xuất vitamin B12 quy mô công nghiệp  Khi vitamin B12. .. vật sản xuất vitamin B12 - Hiện nay, khoa học kh{m kh{ nhiều vi sinh vật tham gia qu{ trình sinh tổng hợp vitamin B12 Một số quy trình sản xuất vitamin đƣợc biết đến l| quy trình sản xuất vitamin. .. có lợi vitamin B12 - Việc sản xuất vitamin B12 từ dịch Whey có ý nghĩa quy mô công nghiệp việc chuyên chở dịch Whey thực gần nơi sản xuất lƣợng Whey tƣơng đối nhiều để kết hợp sản xuất Chi phí