Sử dụng phương pháp chuyển gene làm tăng khả năng tổng hợp nhựa sinh học ở chủng vi khuẩn bacillus megaterium

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Trọng Linh SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE LÀM TĂNG KHẢ NĂNG TỔNG HỢP NHỰA SINH HỌC Ở CHỦNG VI KHUẨN Bacillus megaterium LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Trọng Linh SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE LÀM TĂNG KHẢ NĂNG TỔNG HỢP NHỰA SINH HỌC Ở CHỦNG VI KHUẨN Bacillus megaterium Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lã Thị Huyền TS Nguyễn Thị Đà Hà Nội – 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Sử dụng phương pháp chuyển gene làm tăng khả tổng hợp nhựa sinh học chủng vi khuẩn Bacillus megaterium” trực tiếp thực hướng dẫn TS Lã Thị Huyền TS Nguyễn Thị Đà Số liệu kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực, xác Mọi thông tin nội dung tham khảo luận văn trích dẫn rõ ràng tên cơng trình, tên tác giả, địa điểm, thời gian nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan này! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Học viên Nguyễn Trọng Linh ii LỜI CẢM ƠN Sau trình học tập nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này, trước hết xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Lã Thị Huyền – trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật TS Nguyễn Thị Đà – cán phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy hướng dẫn, tận tình bảo truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cán Phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn, nhiệt thành giúp đỡ tơi thí nghiệm cho kinh nghiệm quý báu công tác nghiên cứu Sinh học Luận văn thực kinh phí Đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học tái tổ hợp sinh tổng hợp bioplastic từ phụ phẩm chế biến thủy sản” TS Nguyễn Thị Đà làm chủ nhiệm thuộc Đề án phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực công nghiệp chế biến Bộ Công thương, năm 2018-2020 Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, thầy, giáo thuộc Khoa Cơng nghệ sinh học Phịng Đào tạo, Quản lý Khoa học Hợp tác quốc tế Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam tạo điều kiện, hướng dẫn cho nhiều kiến thức trình học tập Học viện Xin cảm ơn gia đình bạn bè cổ vũ khích lệ tơi học tập Tơi xin chân thành cảm ơn! Học viên Nguyễn Trọng Linh iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT B megaterium Bacillus megaterium DNA Deoxyribonucleic acid g/l Gam/lít Mcl Medium chain length Chuỗi có độ dài trung bình OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng kéo dài chuỗi PHA Polyhydroxyalkanoate Polyhydroxyalkanoat PHB Polyhydroxybutylrate Polyhydroxybutylrat RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic Scl Short chain length Chuỗi có độ dài ngắn TAE Tris- acetate-EDTA Lcl long-chain-length c-PHB complex PHB [P(3HB-co3HHx) poly(3-hydroxybutyrate-co3-hydroxyhexanoate) [P(3HB-co- poly(3-hydroxybutyrate-co- 4HB) 4-hydroxybutyrate) MCL medium chain length TCA axit tricarboxylic Axit Deoxyribonucleic chiều dài chuỗi dài chiều dài trung bình iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Nhóm chức R số loại PHA .7 Bảng Các đơn vị synthase tham gia tổng hợp PHA loài khác .10 Bảng 2.1: Các chủng nghiên cứu 19 Bảng 2: Các chất bổ sung sử dụng cho môi trường chọn lọc 21 Bảng 3: Các primer sử dụng 23 Bảng 2.4 Các phản ứng cắt gắn enzyme giới hạn……………….23 Bảng Bảng ký hiệu đặc điểm chủng tải tổ hợp tạo thành 36 Bảng Ảnh hưởng việc tăng cường biểu phaC lên khả sinh trưởng sinh tổng hợp PHA chủng B megaterium DV01 36 Bảng 3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng tái tổ hợp 38 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tổng hợp PHA chủng tái tổ hợp .38 Bảng Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả tổng hợp PHA chủng tái tổ hợp 40 Bảng Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng khác lên hàm lượng PHA xác định theo Crotonic chủng B megaterium DV01/pPSP6-phaC1 43 v DANH MỤC HÌNH Hình 1 Ảnh hiển vi điện tử tế bào vi khuẩn Bacillus megaterium DV01 chứa hạt PHA Hình 1.2 Sự đa dạng PHA Hình 1.3 Cấu trúc hóa học phân tử PHA Hình 1.4 Cấu trúc số loại PHA .8 Hình 1.5 Cấu trúc hạt PHA Hình Cấu trúc PHA synthases 10 Hình 1.7 Con đường sinh tổng hợp P (3HB) 12 Hình Cụm gen sinh tổng hợp PHB B megaterium 27 Hình Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen phaC chủng tuyển chọn .28 Hình 3 Hình ảnh khuẩn lạc tách dịng mang gen phaC (A) hình ảnh tách plasmid chủng DH5α tái tổ hợp (B) 29 Hình Hình ảnh điện di đồ khuêch đại gen phaC từ khuẩn lạc DH5α tách dòng .30 Hình Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen phaC cặp mồi For2/PhaC –SpeI// Rev2/PhaC–SphI .31 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm cắt mở vịng vector pSP6……………… 31 Hình 3.7 Khuẩn lạc E Coli DH5α tách dòng mang plasmid pPSP6-phaC 32 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm tách plasmid pPSP6/ phaC tách từ khuẩn lạc E coli DH5α khác 32 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen phaC từ plasmid pPSP6/phaC cặp mồi For2/PhaC –SpeI// Rev2/PhaC–SphI 33 Hình 3.10 Hình ảnh sàng lọc dòng tế bào chủng B megaterium DV01 mang vector pPSP6 pPSP6 – PhaC môi trường LB có bổ sung tetracyline 34 Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm tách DNA plasmid chủng B megaterium DV01 mang vector pPSP6/phaC tái tổ hợp 34 Hình 3.12 Điện di đồ sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra palsmid pPSP6/phaC enzyme giới hạn SphI SpeI 35 Hình 3.13 Khả sinh trưởng chủng tái tổ hợp nghiên cứu 36 Hình 3.14 Hàm lượng PHA chủng tái tổ hợp nghiên cứu 37 vi Hình 3.15 Sơ đồ thời gian thí nghiệm thời điểm lấy mẫu 41 Hình 3.16 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp PHA chủng gốc B megaterium DV01 41 Hình 3.17 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên biểu protein PhaC chủng tái tổ hợp 42 Hình 3.18 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng lên khả sinh tổng hợp PHA chủng B megaterium DV01/pPSP6-phaC 43 Hình 3.19 Điện di đồ ảnh hưởng nồng độ xylose khác chủng B megaterium DV01/pPSP6-phaC lên khả biểu PhaC .44 Hình 3.20: Phổ hồng ngoại PHA thu hồi từ chủng tái tổ hợp 46 Hình 3.21 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H PHA thu hồi từ chủng tái tổ hợp PHA chuẩn………………………………………………………… 48 13 Hình 3.22 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C PHA thu hồi từ chủng tái tổ hợp PHB chuấn sigma…………………………………………………….49 Hình 3.23 Cấu trúc phân tử PHA chủng tái tổ hợp………………… 50 Hình 3.24 Hình ảnh PHA tách chiết dung môi chủng tái tổ hợp…50 vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỤC LỤC vii MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NHỰA SINH HỌC .3 1.1.1 Giới thiệu nhựa sinh học 1.1.2 Phân loại PHA .4 1.1.3 Cấu trúc PHA 1.2 CÁC NHÂN TỐ THAM GIA SINH TỔNG HỢP NHỰA SINH HỌC 1.2.1 PHA synthase 1.2.2 Protein phasin 10 1.2.3 Protein hoạt hóa 11 1.2 CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP PHA 11 1.3 TÍNH CHẤT CỦA PHA 12 1.4 VI KHUẨN BACILLUS MEGATERIUM 13 1.5 ỨNG DỤNG CỦA PHA 14 1.5.1 Ứng dụng đời sống sản xuất 15 1.5.2 Ứng dụng y sinh 15 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI 15 1.7 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 17 Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 viii 2.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .19 2.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 19 2.2.1 Chủng giống 19 2.2.2 Plasmid 19 2.2.3 Hóa chất 19 2.2.4 Thiết bị 20 2.2.5 Môi trường 20 2.2.6 Chất bổ sung 21 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.3.1 Chuẩn bị chủng giống 21 2.3.2 Tách chiết DNA tổng số 21 2.3.3 Tách chiết DNA plasmid E coli 22 2.3.4 Tách chiết DNA plasmid Bacillus 22 2.3.5 Phương pháp PCR .23 2.3.6 Cắt DNA enzyme giới hạn gắn DNA 23 2.3.7 Biến nạp DNA plasmid vào chủng chủ E coli 24 2.3.8 Biến nạp DNA plasmid vào chủng chủ Bacillus 24 2.3.9 Phương pháp tách PHA .25 2.3.10 Phương pháp Crotonic xác định hàm lượng nhựa sinh học 25 2.3.11 Phương pháp nuôi sinh khối vi sinh vật tạo nhựa sinh học .25 2.3.12 Phương pháp phân tích cấu trúc nhựa sinh học thu từ vi khuẩn 26 2.3.13 Phân tích thống kê .26 2.3.14 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose .26 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .27 3.1 KẾT QUẢ LỰA CHỌN GEN ĐÍCH ĐỂ CAN THIỆP GEN VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN ĐÍCH 27 ... VI? ??N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM HỌC VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Trọng Linh SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE LÀM TĂNG KHẢ NĂNG TỔNG HỢP NHỰA SINH HỌC Ở CHỦNG VI. .. gene làm tăng khả tổng hợp nhựa sinh học chủng vi khuẩn Bacillus megaterium? ?? Luận văn thực với mục tiêu nội dung nghiên cứu sau: Mục tiêu: Tạo chủng vi khuẩn Bacillus megaterium có khả tổng hợp. .. Nội – 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: ? ?Sử dụng phương pháp chuyển gene làm tăng khả tổng hợp nhựa sinh học chủng vi khuẩn Bacillus megaterium? ?? trực tiếp thực hướng dẫn TS Lã Thị Huyền