Tổng hợp và khảo sát khả năng thăng hoa một số phức chất của ion đất hiếm với axit isopentanoic 96 PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG VITAMIN A TRONG MỘT SỐ LOẠI NGŨ CỐC CHẾ BIẾN Ở THÀNH PHỐ HUẾ VÀ MỘT SỐ VÙNG LÂN C[.]
Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học - Tập 21, Số 4/2016 PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG VITAMIN A TRONG MỘT SỐ LOẠI NGŨ CỐC CHẾ BIẾN Ở THÀNH PHỐ HUẾ VÀ MỘT SỐ VÙNG LÂN CẬN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Đến tòa soạn 27 - 06 - 2016 Ngô Văn Tứ, Lê Thị Nhƣ Ngọc Trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế SUMMARY DETERMINATION OF VITAMIN A CONTENTS OF PROCESSED CEREALS IN HUE CITY AND NEARLY AREAS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY In this paper, we report the result of research and development analytical methods of vitamin A in processed cereals by high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detecter (RF) The research results show tat the determination is measured at 348 nm/370 nm wavelength, reversed phase C18 column (150 mm x 4,6 mm, µm), at room temperature, mobile phase: MeOH: H2O (90:10 by volume), 20 L sample injection volume, flow rate 0.8 mL/min The highly sensitive method good repeatability (RSD% < 2%, n = 8), low detection limit, LOD = 0.003 ppm Between the concentration of vitamin A and peak area with good linear correlation in the range 0.05 ÷ 10.00 ppm with R2 = 0.9998 Results of quality control methods on real samples showed that the method has a good right to withdraw from the 96 ÷ 101% MỞ ĐẦU Vitamin l m t nhóm chất hữu có ph n tử lƣợng tƣơng đối nhỏ v có ản chất hố học khác nhau, l nhóm chất cần thiết cho ho t đ ng sống thể sinh vật Vitamin A cần thiết cho sinh trƣởng v phát triển xƣơng trẻ em, cho nhìn thấy (cụ thể ánh sáng ho ng h n), cho nguyên vẹn ề m t iểu m v niêm m c Thiếu vitamin A g y ệnh quáng g , kh mắt, nhuyễn giác m c v g y m , đ c iệt trẻ em Ngo i ra, vitamin A c n có tác ụng chống ung thƣ chống l o hóa [1 , [2 96 Tuy nhiên Vitamin A hòa tan m mỡ, việc thải lƣợng ƣ thừa từ ăn uống l khó khăn so v i vitamin tan nƣ c Do liều ẫn đến ng đ c Vitamin A Nó g y uồn n n, v ng a, ị ứng, chứng iếng ăn, n n mửa, nhìn mờ, đau đầu, tổn thƣơng v ụng, uể oải v thay đổi tính tình [1 Trên gi i đ có nhiều c ng trình nghiên cứu vitamin A[5 thực phẩm [8 , sữa tƣơi [9 , trứng, c rốt, ngũ cốc ằng nhiều phƣơng pháp ph n tích c ng cụ khác nhƣ quang phổ hấp thụ ph n tử UV – Vis, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nhƣng Việt Nam việc nghiên cứu xác định h m lƣợng vitamin A ngũ cốc c n h n chế, chƣa đƣợc quan t m đ ng mức B i áo n y trình y kết nghiên cứu xác định h m lƣợng vitamin A mẫu ngũ cốc chế iến ằng HPLC, từ đƣa điều kiện thích hợp để tiến h nh ph n tích vitamin A lo i ngũ cốc chế iến địa n th nh phố Huế v m t số v ng l n cận THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất thuốc thử Tất hóa chất l lo i tinh khiết ph n tích h ng Merck: etanol 95%, axit acro ic, axit axetic, THF Tetrahyđrofuran, metanol, hexan THF- ethanol (50+50) – ( 50mL tetrahyđrofuran v 50mL ethanol 95% ) Kali hyđroxit 50%: thêm từ từ 500g KOH t viên v o 500ml nƣ c chứa ình tích 1L Chất chuẩn: B y tế, viện kiểm nghiệm TPHCM, chất chuẩn đối chiếu: Retinyl palmitate C20H30O, số l : QT 041:081111, h m lƣợng: 1051600 IU/g Máy sắc ký lỏng hiệu cao Series 20A h ng Shima zu, Nhật Bản; c t sắc ký C18 (150 x 4,5 mm, μm) h ng GL Sciences Inc, Nhật Bản B lọc h t ch n kh ng h ng Gast, Mỹ Thiết ị lọc nƣ c siêu s ch h ng Barnstead International, USA Tủ sấy h ng Memmert M ng lọc 0,45 μm h ng Sartorius Ste im, Đức 2.2 Tiến trình phân tích Xử lý mẫu theo AOAC 2001 13, đƣợc tóm tắt hình Mẫu chuẩn v mẫu ph n tích đƣợc x ph ng hóa ằng KOH nƣ c, trung h a, pha lo ng chuyển đổi chất éo th nh axit éo v este retinol [3] 97 Mẫu ngũ cốc 20 – 30 g mẫu + 50 mg axit acrobic + 40 mL ethanol 95% Sau 10 ph t lắc tr n ình X ph ng hóa ằng 10 mL KOH 50%, đun hồi lƣu 45 ph t L m l nh nhanh Cho 10 mL axit axetic, pha lo ng ằng ethanol 95% : THF (50 : 50) đến 100 mL Lọc qua m ng 0,45 µm Để qua đêm Dung ịch ph n tích Hình 2.1 Sơ đồ xử lý mẫu Retinol đƣợc định lƣợng ằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) v i etector RF phát ƣ c sóng kích thích v phát x l 348 nm/470 nm, c t pha đảo C18 Điều kiện sắc ký: nhiệt đ ph ng, pha đ ng l MeOH : H2O (90: 10), thể tích tiêm mẫu 20 μL, tốc đ ng: 0,8 mL/phút, thời gian lƣu 5,7 ph t, ghi l i sắc ký đồ mẫu chuẩn v mẫu ph n tích Nồng đ vitamin đƣợc tính ằng cách so sánh iện tích pic vitamin mẫu ph n tích v i mẫu tiêu chuẩn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Theo [4 để phát v định lƣợng vitamin A sử ụng etector RF ƣ c sóng kích thích v phát x đƣợc lựa chọn l (Ex/Em) 348 nm/470 nm, chúng tơi chọn ƣ c sóng n y để nghiên cứu 3.1 Khảo sát ảnh hƣởng pha động Th nh phần pha đ ng đƣợc khảo sát ao gồm: methanol (MeOH): nƣ c (H2O) Ch ng t i tiến h nh khảo sát tỷ lệ pha đ ng methanol : nƣ c = (70:30); methanol : nƣ c = (90:10); v i ung ịch chuẩn vitamin A có nồng đ ppm, tốc đ ng mL/phút; Vtiêm = 20µL, kết thu đƣợc ảng Bảng 3.1 Hệ số đối xứng peak với tỷ lệ dung môi pha động Ký hiệu Hệ dung môi Tỷ lệ pha động Hệ số đối xứng (a) Methanol : nƣ c 70 : 30 1,600 (b) Methanol : nƣ c 90 : 10 1,118 98 Từ kết khảo sát cho phép ch ng t i chọn hệ ung m i pha đ ng methanol : nƣ c v i tỉ lệ thể tích l 90 : 10 3.2 Khảo sát tốc độ dòng Tiến h nh khảo sát hệ ung m i pha đ ng methanol : nƣ c (90:10), v i tốc đ ng 1,0 mL/phút; 0,8 mL/phút 0,5 mL/phút Kết đƣợc thể qua hình 3.1 a, b, c v ảng (a) (b) (c) Hình 3.1 Sắc ký đồ hệ pha động methanol : nước=(90:10) với cáctốc độ : a 1,2 mL/ph; b 0,5 mL/ph; c 0,8 mL/ph Bảng 3.2 Các thông số tốc độ dòng khác (n=5) Tốc đ ng 1,2 0,8 0,5 ( mL/phút) (a) (c) (b) Các th ng số Thời gian lƣu tR 3,586 5,761 7,952 Hệ số đối xứng Sa 1,111 1,072 1,725 Từ sắc đồ cho thấy, trƣờng hợp (c) có pic ph n tích xuất khoảng thời gian không dài (5,7 phút), hiệu tách tốt, pic thu đƣợc c n đối, nhọn đẹp, có cƣờng đ tín hiệu cao Qua kết khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình tách sắc ký, ch ng t i đ lựa chọn đƣợc điều kiện thích hợp để định lƣợng vitamin A ằng phƣơng pháp HPLC v i 99 c t C18, ƣ c sóng kích thích v phát x 348 nm/470 nm, thể tích tiêm mẫu 20 μL, sử ụng hệ pha đ ng methanol : nƣ c = (90:10), tốc đ ng 0,8 mL/ph t để khảo sát n i ung 3.3 Tính tƣơng thích hệ thống sắc ký Tiến h nh tiêm lần mẫu v o hệ thống sắc ký HPLC điều kiện đ chọn v ghi iện tích pic thu đƣợc Đ ổn định hệ thống sắc ký đƣợc iểu thị ằng sai số tƣơng đối (RSD%) kết sau lần tiêm mẫu Kết đƣợc trình y ảng 3 Hoạt chất Vitamin A Bảng 3.3 Các thông số sắc ký pic vitamin A Thời gian lƣu Lần đo Diện tích pic (tR) 5,790 1184794 5,787 1191545 5,804 1197186 5,823 1203233 5,836 1210824 5,849 1217100 TB 5,815 1200780 RSD (%) 0,434 1,004 Hệ số đuôi 1,041 1,037 1,038 1,040 1,035 1,035 1,038 0,241 ĐKSK: Cột C18, Detector RF, bước sóng kích thích phát 348 nm/470 nm, tốc độ dịng 0,8 mL/phút, dung mơi pha động MeOH : H2O = 90 : 10, thể tích tiêm 20 μL Nhận xét: - Thời gian lƣu trung ình pic vitamin A 5,815 (RSD% = 0,434%) khoảng thời gian thích hợp cho q trình ph n tích sắc ký - Diện tích trung ình pic vitamin A l 1200780 (RSD% = 1,004%)Những kết cho thấy quy trình sắc ký m ch ng t i x y ựng l ph hợp v đảm ảo ổn định cho trình định lƣợng vitamin A [5] 3.4 Thẩm định phƣơng pháp xây dựng đƣợc 3.4.1 Khoảng tuyến tính phương pháp định lượng Chuẩn ị y ung ịch chuẩn vitamin A có nồng đ thay đổi khoảng 0,05 10 ppm để khảo sát khoảng tuyến tính Bảng 3.4 Kết khảo sát khoảng tuyến tính Nồng đ C (ppm) 0,05 0,1 0,5 Diện tích peak (S) 13174 23960 114074 226528 10 1082888 2105965 Từ kết thí nghiệm, x y ung đƣợc khoảng tuyến tính nhƣ sau: y = 210638x + 9910,7 100 S 2500000 y = 210638x + 9910,7 R = 0,9998 2000000 1500000 1000000 500000 0 10 12 C (ppm) Hình 3.2 Đường hồi quy tuyến tính Kết khảo sát khoảng tuyến tính nồng đ chất ph n tích v iện tích pic có mối liên quan ch t chẽ, hệ số tƣơng quan R2 = 0,9998 khoảng nồng đ 0,05 ÷ 10 ppm 3.4.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng Gi i h n phát (LOD) phƣơng pháp đƣợc xác định theo qui tắc 3ζ áp ụng hồi qui tuyến tính [10 Đƣờng hồi qui tuyến tính đƣợc x y ựng khoảng hẹp nồng đ gần gốc tọa đ (0,05 ÷ 1,00 ppm) Kết đƣợc trình y ảng Bảng 3.5 Kết xác định giới hạn phát (LOD) Nồng đ (ppm ) 0,05 0,10 0,50 Diện tích peak 13174 23960 114074 Phƣơng trình hồi qui 224797x + 1705,3 1,00 226528 LOD = 0,003 ppm LOQ = 0,099ppm 3.4.3 Xác định độ lặp lại phương pháp Để kh ng định khả áp ụng phƣơng pháp HPLC v o ph n tích h m lƣợng vitamin A mẫu thực tế, cần đánh giá qua đ l p l i v đ đ ng Kết khảo sát đ l p l i phƣơng pháp ph n tích ằng cách tiến h nh ph n tích l p l i lần c ng m t mẫu chất Lấy 30 g mẫu ngũ cốc chế iến có h m lƣợng 0,478 ppm/100g, tiến h nh xử lý theo sơ đồ 2.1 Kết đƣợc trình y ảng Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại mẫu ngũ cốc 108333,875 Diện tích 0,467 Nồng độ (ppm) 2,347 RSD (%) 8,935 ½.RSDHorwitz Kết ảng cho thấy: phƣơng pháp đ t đƣợc đ l p l i tốtqua lần ph n tích Ngƣời ta thừa nhận, xác định nồng đ C ất kỳ đ t đƣợc RSD kh ng vƣợt 0,5 RSDHorwitz l đ t yêu cầu (RSDHorwitz l đ lệch chuẩn tƣơng đối tính 101 tốn đƣợc từ phƣơng trình Horwitz: RSDHorwitz = 21-0,5logC v i C l nồng đ iễu iễn ằng ph n số [7 , [10 Nhƣ vậy, cỡ nồng đ 0,478 ppm RSD 8,9% l đ t yêu cầu 3.4.4 Xác định độ phương pháp Phƣơng pháp HPLC đ t đ đ ng tốt ph n tích mẫu thêm chuẩn v i đ thu hồi từ 91 ÷ 100% Đ đ ng đƣợc xác định ằng phƣơng pháp thêm chuẩn Tiến h nh thêm a mức 0,400 ppm; 0,500 ppm; 0,600 ppm chất chuẩn vitamin A v o v o mẫu ngũ cốc chế iến có nồng đ n đầu 0,478 ppm, ứng v i m i mức thêm, làm thí nghiệm đo kết a lần lấy giá trị trung ình Kết đƣợc trình y ảng Bảng 3.7 Kết khảo sát độ mẫu ngũ cốc chế biến (n=3) Nồng đ Nồng đ Nồng đ Tỷ lệ thu 1/2.RSDHorwitz Kiểm Mẫu an đầu thêm vào tìm thấy hồi Rev (%) tra Co (ppm) C1 (ppm) C2(ppm) (%) 0,478 0,400 0,886 100,90 9,18 Đ t 0,500 0,957 97,85 8,88 Đ t 0,600 1,035 96,01 8,64 Đ t Kết ảng cho thấy: phƣơng pháp đ t đƣợc đ đ ng tốt v i đ thu hồi nằm khoảng từ 96% - 101%, thỏa m n h m Horwitz Chứng tỏ phƣơng pháp phân tích x y ựng l ho n to n ph hợp để định lƣợng vitamin A mẫu sữa [10 3.5 Xác định hàm lƣợng vitamin A mẫu ngũ cốc địa bàn thành phố Huế vùng lân cận Qua khảo sát 05 mẫu ngũ cốc ch ng t i thu đƣợc kết h m lƣợng vitamin A đƣợc trình y nhƣ ảng Bảng 3.8 Kết phân tích hàm lượng vitamin A 05 mẫu ngũ cốc chế biến TT Tên mẫu Sữa v yến m ch Ngũ cốc inh ƣỡng ia et Nutifood Nestle Quasure light Kết Hàm lƣợng bao bì Vitamin A (UI/100g) 529,41 11,46 Vitamin A (UI/100g) 1480,46 20,59 981,93 3,87 1681,55 19,38 1191,81 18,14 102 379 - 568 1200 820 1610 1167 Nhận xét: Từ kết ph n tích 05 mẫu ngũ cốc chế iến ch ng t i nhận thấy 100% sản phẩm ngũ cốc chế iến chứa vitamin A h m lƣợng gần v i h m lƣợng ghi ao ì sản phẩm m nh sản xuất đ c ng ố H m lƣợng vitamin A mẫu ngũ cốc từ 529 1681 UI/100g KẾT LUẬN Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao, sử ụng ph n tích h m lƣợng vitamin A mẫu ngũ cốc l phƣơng pháp có đ nh y cao, gi i h n định lƣợng (LOQ) v gi i h n phát (theo quy tắc 3) LOD = 0,003 ppm, LOQ = 0,099 ppm; nồng đ vitamin A v iện tích pic có tƣơng quan tuyến tính tốt khoảng 0,05 ÷ 10 ppm v i R2 = 0,9998 Kết kiểm tra chất lƣợng phƣơng pháp mẫu thực tế cho thấy phƣơng pháp đ t đƣợc đ l p l i tốt v i RSD% < 2%, n = 8, đ đ ng tốt v i đ thu hồi từ 96 ÷ 101% Có thể sử ụng quy trình ph n tích n y để xác định h m lƣợng vitamin A mẫu ngũ cốc Kết ph n tích mẫu ngũ cốc có ổ sung vitamin A, ch ng t i nhận thấy 100% sản phẩm có h m lƣợng vitamin A gần đ ng h m lƣợng ghi ao ì TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phan Đình Ch u, Hóa dược kỹ thuật tổng hợp 1, NXB Khoa học v kỹ thuật [2 Hóa ƣợc - ƣợc lý, sách đào tạo dược sĩ trung học, NXB Y học [3] AOAC official method 2001.13, Determination of Vitamin A (retinol) in Foods by Liquid Chromatography First Action 2001 [4] Collins CA, Chow CK (1984), “Determination of vitamin A an vitamin A acetate y highperformance liqui chromatography with fluorescence etection”, http://europepmc.org, 1984 December 28 [5] Dennis Eriksen(2008), Vitamin A determination by HPLC, Code: 10002-01 [6] H Faulkner, A Hussein, M Foran, and L Szijarto, A Survey of Vitamin A and D Contents of Fortified Fluid Milk in Ontario, Laboratory Services Division, University of Guelph, Guelph, ON, Canada N1H 8J7, Journal of Dairy Science Vol 83, No 6, 2000 [7] Horwitz W., Albert R., The Concept of Uncertainty as Applied to Chemical Measurement, Analyst 122, (1997), 615-617 [8] Jonathan W Devries and Karlene R Silvera (2002), Determination of Vitamins A (Retinol) and E (alpha-Tocopherol) in Foods by Liquid Chromatography: Collaborative Study [9] Manuela Strobel, Felix Heinrich, Hans K Biesalski (2000), Improved method for rapid determination of vitamin A in small samples of breast milk by high-performance liquid chromatography, Department of Biological Chemistry and Nutrition, University of Hohenheim, Fruwirthstrasse 12, D-70593 Stuttgart, Germany [10] Miller J C and Miller J N (1988), Statistics For Analytical Chemistry- second edition, Ellis Horwood Limited, John Wiley and Sons, England 103