BÀI TẬP CUỐI KỲ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM - c&d - BÀI TẬP CUỐI KỲ MÔN: THỰC PHẨM CHỨC NĂNG POLYPHENOL NẤM MÈO CHIẾT XUẤT ETANOL Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 17 tháng 11 năm 2021 Phân tích vai trị sinh học hợp chất chức thực phẩm chức  Vai trò polyphenol Người ta việc tiêu thụ polyphenol hạn chế phát triển tổn thương mảng xơ vữa cách ức chế trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp, coi chế hình thành tổn thương nội mô Tuy nhiên, phát cho thấy polyphenol độc lập với hoạt động chống oxy hóa thơng thường chúng tạo tác dụng có lợi tiềm Chúng cải thiện tồn tế bào bảo vệ chống lại độc tế bào cách ức chế trình chết rụng, điều chỉnh tích cực tăng sinh tế bào, gây trình chết rụng ngăn chặn phát triển khối u [8] Polyphenol chứng minh có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh tim mạch vành Polyphenol giảm hấp thu cholesterol, giảm hấp thụ dẫn đến giảm phân phối cholesterol đến gan tàn dư chylomicron, điều chỉnh mRNA gan cho thụ thể LDL giảm cholesterol huyết tương [12] Polyphenol phát huy tác dụng chống ung thư thông qua nhiều chế, bao gồm loại bỏ tác nhân gây ung thư, điều chỉnh tín hiệu tế bào ung thư tiến triển chu kỳ tế bào, thúc đẩy trình chết rụng điều chỉnh hoạt động enzyme Ngày có nhiều quan tâm đến tiềm polyphenol việc cải thiện trí nhớ, khả học tập nhận thức chung Tác động polyphenol nhận thức chống lại q trình thối hóa thần kinh dường thông qua tương tác chúng với đường tín hiệu thần kinh thần kinh đệm ảnh hưởng đến biểu gen can thiệp vào chế chết tế bào [11] Polyphenol có tác động lớn đến sức khỏe phòng chống bệnh tật Người ta hiểu với vai trò chất chống oxy hóa, polyphenol bảo vệ thành phần cấu tạo tế bào chống lại tác hại trình oxy hóa hạn chế nguy mắc bệnh thối hóa khác liên quan đến stress oxy hóa Theo báo cáo nay, số lượng nghiên cứu người điều tra tác dụng bảo vệ polyphenol tăng lên nhanh chóng thập kỷ qua nhận thức khoa học ngày tăng Polyphenol hoạt động chất ức chế enzyme chất khử enzyme cho telomerase, cycloxygenase lipoxygenase [10]  Cơ chế giảm cholesterol máu chiết xuất polyphenol nấm mèo [7],[9] Mức cholesterol máu biết đến phản ánh tình trạng khỏe mạnh thể người, nhiều yếu tố stress oxy hóa, chế độ ăn giàu cholesterol (CED) rối loạn chức chuyển hóa lipid dẫn đến mức cholesterol bất thường Mức cholesterol máu biểu thị ba số cholesterol toàn phần (TC), lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp (LDL-C) lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao (HDL-C) Do đó, để xác định hạ cholesterol máu sử dụng số để đánh giá Chế độ ăn uống giàu cholesterol dường tạo gốc tự do, stress oxy hóa tăng cholesterol máu, chẳng hạn làm giảm hoạt động catalase superoxide dimutase (SOD - enzyme giúp chuyển đổi superoxide ảnh hưởng thể thành nhóm chất tốt hơn, kết hợp với enzyme nội sinh catalase thúc đẩy sản xuất chống oxy hóa, có tác dụng ngăn chặn q trình oxy hóa) làm tăng hàm lượng lipid peroxide (oxy hóa lipid thể, đẩy nhanh q trình oxy hóa), dẫn đến việc sản xuất chất trung gian độc hại Với việc sử dụng chiết xuất etanol giàu polyphenol nấm mèo (AAE) làm giảm đáng kể mức độ lipid peroxide, tăng cường hoạt động superoxide dimutase gan Cùng với đó, sử dụng polyphenol nấm mèo chiết xuất etanol giảm hoạt động HMG-CoA reductase (là enzym giới hạn tốc độ trình sinh tổng hợp cholesterol) xúc tác hình thành mevalonate dẫn đến ức chế tổng hợp cholesterol Cholesterol tiết vào mật trực tiếp sau chuyển hóa thành axit mật Tổng hợp axit mật xảy gan, cholesterol 7α-hydroxylase enzym giới hạn tỷ lệ đường có vai trị chuyển hóa cholesterol AAE kích hoạt cholesterol 7α-hydroxylase có tác dụng việc giảm cholesterol thơng qua chuyển cholesterol thành 7α-hydroxylcholesterol (là tiền chất axit mật, hình thành định cho tốc độ tiến trình tạo axit mật) bước đầu việc tổng hợp thành axit mật gan Từ cho thấy chức giảm cholesterol thực thơng qua việc chuyển đổi cholesterol thành axit mật gan 2 Thuộc tính sản phẩm Quy trình tách chiết: [7] Nấm mèo dạng khô Nghiền sàng Hồi lưu etanol Lọc Dư lượng Cơ đặc Chiết với etanol ngun chất Trích ly Lắng đọng Cô đặc đông khô Chiết xuất AAE Hình 1: Sơ đồ quy trình tách chiết AAE - Thuyết minh quy trình: Nấm mèo dạng khơ chuẩn bị đem nghiền sàng qua lưới lọc (40-60 mắt lưới) thu bột khô Bột mang ngâm lít etanol (75%) hồi lưu 80°C Quy trình lặp lại ba lần huyền phù lọc qua giấy lọc (Whatman số 2) để loại bỏ dư lượng không tan etanol chất xơ hợp chất polysaccharide thu chất lỏng Chất lỏng cô đặc thiết bị cô quay áp suất giảm Dung dịch đậm đặc sau thu nhận chiết etanol nguyên chất 24 4°C (tỷ lệ dung dịch đậm đặc so với etanol 1:4) Sau đó, tiến hành trích ly để loại bỏ chất lắng đọng lại chất xơ hòa tan nước, polysaccharide thành phần protein Dịch chiết etanol cô đặc thiết bị cô quay áp suất giảm sau làm đơng khơ Chế phẩm đặt tên polyphenol nấm mèo chiết xuất etanol (AAE) - Các yếu tố ảnh hưởng:  Lọc Vật liệu lọc: mỗi loại vật liệu lọc khác cho hiệu lọc khác Diện tích màng lọc: tốc độ lọc tỉ lệ thuận với diện tích màng lọc Mặt khác, diện tích màng lọc nhỏ lượng tạp chất đọng lại nhiều làm tăng độ dày màng, tăng tốc độ lọc theo thời gian nhanh  Cô đặc Khi áp suất bề mặt sản phẩm thấp nhiệt độ sơi sản phẩm thấp Vì việc tạo độ chân không thiết bị cô đặc giảm nhiệt độ sôi sản phẩm Khi nồng độ chất khơ lớn nhiệt độ sơi cao Trong q trình đặc, nồng độ chất khơ tăng dần nên nhiệt độ sôi sản phẩm tăng dần Nhiệt độ sơi thấp tính chất bị biến đổi Thời gian cô đặc phụ thuộc vào phương pháp làm việc thiết bị cường độ bốc sản phẩm Các thiết bị cho nguyên liệu vào, sản phẩm liên tục sản phẩm có cường độ bốc lớn thời gian lưu lại sản phẩm thiết bị ngắn Cường độ bốc sản phẩm phụ thuộc vào cường độ trao đổi nhiệt nóng sản phẩm bốc Cường độ trao đổi nhiệt đặc trưng hệ số truyền nhiệt q trình đặc Hệ số truyền nhiệt lớn cường độ bốc cao  Trích ly Nhiệt độ làm suy yếu tương tác phenol-protein phenol-polysaccharide nguyên liệu thực vật từ tốc độ khuếch tán polyphenol từ bên ngun liệu ngồi dung mơi nhiều Tuy nhiên, nâng nhiệt độ lên đến mức độ làm phân hủy đồng thời chất chống oxy hóa Thời gian trích ly kéo dài làm tăng nguy phân hủy oxy hóa polyphenol tiếp xúc lâu với yếu tố môi trường không thuận lợi nhiệt độ, ánh sáng oxy Mặt khác, thời gian trích ly lâu làm thời gian có khả làm dung môi cách bốc trực tiếp ảnh hưởng đến tỷ lệ nguyên liệu dung môi Dự kiến: Chiết xuất AAE Phối trộn phụ liệu Định hình (viên nén) Đóng gói Sản phẩm Hình 2: Sơ đồ quy trình sản xuất dự kiến - Thuyết minh quy trình: Chiết xuất AAE sau tách chiết tiến hành phối trộn thêm phụ liệu, sau định hình (viên nén), đóng gói cho sản phẩm viên nén chiết xuất nấm mèo Ở bước phối trộn phụ liệu, sử dụng số phụ liệu không gây ảnh hưởng đáng kể đến thành phần tác dụng sản phẩm Tá dược thêm vào nhằm đảm bảo khối lượng, đồng thời cải thiện độ trơn chảy, khả chịu nén điều hòa hòa tan cho viên nén Tuy nhiên, dùng loại tá dược khơng phù hợp, tỷ lệ khơng xác, thời điểm phương pháp sử dụng tá dược khơng hợp lý chúng ảnh hưởng ngược lại đến chất lượng sản phẩm Với dược chất không tan nước tá dược tan nước đường lactose, sorbitol, … cải thiện tính thấm tăng hấp thu Còn với dược chất dễ tan nước việc sử dụng tá dược không tan nước dẫn chất cellulose giúp điều hòa hòa tan, làm giảm tốc độ hấp thu đảm bảo độ bền cho viên nén Bên cạnh đó, để viên nén tránh khỏi yếu tố gây ảnh hưởng đến chất lượng ẩm, ánh sáng, khơng khí sử dụng lớp bao phim phủ bên Việc sử dụng lớp bao phim có ý nghĩa việc trì hình dạng, đường nét viên nén; bao phim tan dày – %, tan ruột – 15% Tá dược bao sử dụng với nhiều mục đích khác để bảo vệ, che mùi vị hỗ trợ tăng tính thẩm mỹ Một số phụ liệu sử dụng loại đường mía nhằm bảo vệ sản phẩm mà khơng ảnh hưởng đến đặc tính sản phẩm  Thuộc tính sản phẩm Sản phẩm viên nén chiết xuất nấm mèo sau hồn thành có nhiều hình dạng khác hình trịn, hình trứng, hình thn,… Mỗi viên có trọng lượng 250mg, mang màu sắc đặc trưng ngun liệu khơng có mùi Tuy nhiên, trình phủ lớp bao phim để tránh hư hỏng sản phẩm màu sắc bên ngồi thay đổi bên viên nén giữ màu sắc tự nhiên vốn có nấm mèo màu nâu nhạt Đối với việc đóng gói bảo quản Sản phẩm cho vào lọ có chèn thêm bơng, gói hút ẩm nút đậy Nắp vặn chặt phải bảo quản nơi có điều kiện tốt đặc biệt tránh ánh nắng trực tiếp Các nguyên tắc chung nghiên cứu phát triển thực phẩm chức Mỗi loại thực phẩm chức sản phẩm nữa, trước công bố thị trường tiêu thụ chúng phải tiến hành thử nghiệm lâm sàng để đảm bảo độ an toàn cho nhà tiêu dùng tin tưởng mà sử dụng Khi việc thử nghiệm lâm sàng hồn tất thu thập thơng tin cần thiết, phù hợp với tiêu chí sản phẩm tiến hành nộp hồ sơ công bố thực phẩm chức Trong đó, yêu cầu đăng ký công bố hợp quy, báo cáo kiểm nghiệm hiệu công dụng, kết kiểm nghiệm, ghi nhãn quảng cáo sản phẩm phải phù hợp theo quy định luật thực phẩm chức ban hành trước   Mơ hình thí nghiệm: [7] Theo Chen, G cộng (2011) đưa mơ hình nghiên cứu chiết xuất ethanol của Auricularia auricula (AAE) có tác dụng hạ cholesterol máu đáng kể, cải thiện tình trạng chống oxy hóa, giảm mức cholesterol tồn phần, số xơ vữa động mạch, tăng mức độ cholesterol lipoprotein mật độ cao tiết qua phân axit mật Nghiên cứu giúp chứng minh AAE ngăn ngừa tăng cholesterol máu chứa hợp chất polyphenol  Chuẩn bị - Nguyên liệu: viên nén AAE nghiền thành bột - Động vật thử nghiệm: chuột đực tuần tuổi - Số lượng thí nghiệm: 36 chuột - Điều kiện: Các vật nhốt vào lồng nhựa phịng có chu kỳ sáng - tối (8:8), nhiệt độ 23 ± 2oC độ ẩm 55 ± 5%  Phân nhóm mơ hình hóa Những chuột sau chuẩn bị ni thích nghi tuần chế độ ăn thường xuyên bổ sung nước Vào tuần thứ hai chia ngẫu nhiên thành ba nhóm, nhóm bao gồm 12 chuột sau: Nhóm I đặt tên EG, nhóm thực nghiệm cho ăn chế độ ăn giàu cholesterol (CED) 150 mg bột viên nén AAE Nhóm II đặt tên RD, cho ăn chế độ ăn bình thường Nhóm III đặt tên CEDC, nhóm bố trí cho ăn chế độ giàu cholesterol (CED) Vào tuần thứ – cuối giai đoạn thử nghiệm, mẫu phân nhóm thu thập, đông khô đem bảo quản nhiệt độ trước sử dụng Sau đó, gan cắt bỏ, mang cân bảo quản nhiệt độ -80oC phân tích  Phương pháp tiến hành - Lấy mẫu máu: Vào tuần thứ 2, 4, giai đoạn thử nghiệm, mẫu máu lấy cách sử dụng ống mao dẫn không gây mê, sau 16 nhịn ăn Các mẫu máu đặt ống nhựa ủ 37oC 15 phút, sau tiến hành ly tâm phút với tốc độ 4.000 vòng/phút Các mẫu huyết sau bảo quản -20 oC phân tích - Phân tích lipid huyết gan: Cấu hình lipid huyết bao gồm cholesterol toàn phần (TC), lipoprotein- cholesterol mật độ thấp (LDL-C), lipoprotein-cholesterol mật độ cao (HDL-C) triglycerid (TG) xét nghiệm cách sử dụng dụng cụ enzyme Sau tiến hành xác định số xơ vữa (AI) Lipid gan chiết xuất từ 300 mg gan chuột với chloroform: methanol (2: 1) theo phương pháp Folch cộng Sau chiết, ml dịch chiết làm khô dịng nitơ Các cặn lipid khơ hịa tan nước cất Cholesterol toàn phần (TC) triglycerid (TG) gan phân tích với enzyme để phân tích huyết - Xác định tình trạng chống oxy hóa gan: Tổng khả chống oxy hóa (TAC) xác định chất đồng gan đo phản ứng phenanthroline Fe2+ máy quang phổ bước sóng 520 nm Đối với phép đo SOD, gốc superoxide tạo NADPH phenazine methosulfate (PMS) điều kiện khơng có acid đo bước sóng 560 nm - Hoạt động HMG-CoA reductase gan: Hoạt động HMG-CoA reductase chuột xác định phương pháp Edwards cộng Các microsome gan phân lập trộn với lượng tương đương 50% glycerol dung dịch đệm phosphat Microsome gan dùng để cấu trúc hình thành tế bào gan, phụ trách biến đổi trao đổi chất quan trọng liên quan đến máy enzyme mạng lưới nội chất Huyền phù đồng ủ 37 oC 60 phút để hịa tan HMG-CoA reductase Hoạt tính HMG-CoA reductase thu cách thử nghiệm enzyme dung dịch đệm photphat số hóa chất phù hợp xác định 37 oC quang phổ kế - Xác định cholesterol trung tính phân axit mật: Cholesterol trung tính phân chiết xuất phân tích theo phương pháp Martensson Mẫu phân đồng với ml hỗn hợp gồm NaOH 10 mol/l ethanol 96% (1: 2) giữ 70oC 45 phút Các mẫu làm mát đến nhiệt độ phòng sau ly tâm 1000 × g phút Phần phía loại bỏ chiết n-hexan ba lần Các pha hexan kết hợp rửa ethanol 70% trung tính để phân tích cholesterol trung tính Các pha thấp axit hóa HCl chiết chloroform: methanol (2:1) để phân tích axit mật Cholesterol coprostanol phân tích sắc ký khí Tổng số cholesterol trung tính biểu thị phần trăm tổng số cholesterol phân cộng với coprostanol Steroid có tính axit phân xác định enzyme  Thu thập thông tin - Trọng lượng thể, lượng thức ăn hiệu cho ăn - Lipid huyết cấu hình số xơ vữa - Cấu hình lipid gan - Tình trạng chống oxy hóa gan - Hoạt động HMG-CoA reductase gan - Bài tiết cholesterol trung tính axit mật qua phân Luật thực phẩm chức Như vậy, để sản phẩm thực phẩm chức cơng bố bán thị trường phải đáp ứng yêu cầu sau: - Để kinh doanh thực phẩm chức phải có giấy chứng nhận cơ sở đủ điều kiện an tồn thực phẩm theo quy định tại Thông tư số 26/2012/TT-BYT Thành phần hồ sơ xin giấy chứng nhận sở đủ điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm bao gồm: [1] + Đơn đề nghị cấp Giấy chứng nhận sở đủ điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm + Giấy chứng nhận đăng ký kinh doanh thực phẩm chức + Bản thuyết minh sở vật chất, trang thiết bị, dụng cụ bảo đảm điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm + Giấy xác nhận tập huấn kiến thức an toàn vệ sinh thực phẩm chủ sở người trực tiếp kinh doanh + Giấy xác nhận đủ sức khoẻ chủ sở người trực tiếp kinh doanh thực phẩm chức - Quá trình thực trình tự, hồ sơ cơng bố sản phẩm hợp quy công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm sản phẩm thực phẩm chức nhập sản xuất nước được thực điều lệ Những quy định phải phù hợp với điều 6, điều Nghị định Chính phủ điều 4, 5, 7, Bộ Y tế [2],[6] - Báo cáo thử nghiệm hiệu công dụng: Sản phẩm phải thử nghiệm hiệu công dụng sức khỏe người việc thử nghiệm phải thực tổ chức có chức nghiên cứu khoa học y học [4] - Việc kiểm nghiệm thực phẩm chức để cơng bố phù hợp quy định an tồn thực phẩm kiểm nghiệm định kỳ phải tuân thủ quy định Thông tư số 19/2012/TT-BYT hướng dẫn việc công bố hợp quy công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm quy định hoạt chất có tác dụng tạo nên cơng dụng sản phẩm phải thực kiểm nghiệm định lượng hoạt chất sản phẩm [2] - Việc ghi nhãn thực phẩm chức năng phải đáp ứng điều kiện nhóm thực phẩm cụ thể phải tuân thủ quy định điều 9, 11 13 Thông tư liên tịch số 34/2014/TTLT-BYT-BNNPTNT-BCT Tại điều thông tư số 43/2014/TTBYT nêu rõ “Tên sản phẩm nội dung nhãn phải phù hợp nội dung công bố tài liệu kèm theo hồ sơ công bố sản phẩm” [4],[5] - Nội dung quảng cáo phương tiện thông tin đại chúng, tờ rơi, poster, áp phích phải bảo đảm tác dụng sản phẩm cơng bố; ngồi nội dung cơng bố, có nội dung khác phải có tài liệu khoa học chứng minh phải bảo đảm xác trung thực nội dung theo Thơng tư số 08/2013/TT-BYT về: [3] + Tên sản phẩm + Xuất xứ hàng hoá, tên địa nhà sản xuất, nhà nhập + Tác dụng sản phẩm (nếu có) + Các cảnh báo sử dụng sản phẩm (nếu có) + Hướng dẫn sử dụng, hướng dẫn bảo quản (đối với sản phẩm có cách sử dụng, cách bảo quản đặc biệt) + Riêng với sản phẩm thực phẩm chức phải có dịng chữ lời đọc “Sản phẩm thuốc khơng có tác dụng thay thuốc chữa bệnh” với chữ viết rõ ràng lời đọc phải nghe điều kiện bình thường Qua đó, sản phẩm thực phẩm chức muốn bày bán thị trường phải đáp ứng yêu cầu mặt pháp luật để đảm bảo chất lượng an toàn mặt sử dụng cho người tiêu dùng Bởi lẽ, không thực theo trình tự, quy trình ban bố sản phẩm buộc phải bị thu hồi gây ảnh hưởng đến công ty, doanh nghiệp sản xuất 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y tế Việt Nam (2012) Thông tư số 26/2012/TT-BYT việc: Quy định cấp Giấy chứng nhận sở đủ điều kiện an toàn thực phẩm sở sản xuất, kinh doanh thực phẩm chức năng, thực phẩm tăng cường vi chất dinh dưỡng, phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm; nước khống thiên nhiên, nước uống đóng chai; dụng cụ, vật liệu bao gói, chứa đựng thực phẩm thuộc phạm vi quản lý Bộ Y tế Hà Nội Bộ Y tế Việt Nam (2012) Thông tư số 19/2012/TT - BYT việc: Hướng dẫn việc công bố hợp quy công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm Hà Nội Bộ Y tế Việt Nam (2013) Thông tư số 08/2013/TT-BYT việc: Hướng dẫn quảng cáo thực phẩm thuộc phạm vi quản lý Bộ Y tế Hà Nội Bộ Y tế Việt Nam (2014) Thông tư số 43/2014/TT-BYT: Quy định quản lý thực phẩm chức Hà Nội BYT-BNNPTNT-BCT (2014) Thông tư liên tịch 34/2014/TTLT-BYT-BNNPTNTBCT Hướng dẫn ghi nhãn hàng hóa thực phẩm, phụ gia thực phẩm chất hỗ trợ chế biến thực phẩm bao gói sẵn Hà Nội Chính phủ Việt Nam (2018) Nghị định Chính phủ số 15/2018/NĐ-CP việc: Quy định chi tiết thi hành số điều Luật an toàn thực phẩm Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Chen, G., Luo, Y.-C., Ji, B.-P., Li, B., Su, W., Xiao, Z.-L., & Zhang, G.-Z (2010) Hypocholesterolemic effects of Auricularia auricula ethanol extract in ICR mice fed a cholesterol-enriched diet Journal of Food Science and Technology, 48(6), 692–698 Giovannini, C., & Masella, R (2012) Role of polyphenols in cell death control Nutritional Neuroscience, 15(3), 134–149 Pak, S., Chen, F., Ma, L., Hu, X., & Ji, J (2021) Functional perspective of black fungi (Auricularia auricula): Major bioactive components, health benefits and potential mechanisms Trends in Food Science & Technology, 114, 245–261 10 Sharma, R (2014) Polyphenols in Health and Disease Polyphenols in Human Health and Disease, 757–778 11 Vauzour, D., Rodriguez-Mateos, A., Corona, G., Oruna-Concha, M J., & Spencer, J P E (2010) Polyphenols and Human Health: Prevention of Disease and 11 Mechanisms of Action Nutrients, 2(11), 1106–1131 12 Zern, T L., & Fernandez, M L (2005) Cardioprotective Effects of Dietary Polyphenols The Journal of Nutrition, 135(10), 2291–2294 12