No 21 June 2021 |p 105 116 105 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN 2354 1431 http //tckh daihoctantrao edu vn/ RESEARCH FOR PREPARATION OF HARD CAPSULES FROM TESTIN REMEDY Nguyen Van Thang1,* , Vu[.]
No.21_June 2021 |p.105-116 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ RESEARCH FOR PREPARATION OF HARD CAPSULES FROM TESTIN REMEDY Nguyen Van Thang1,*, Vu Van Dien2, Nguyen Thi Thanh Duyen2 Tan Trao University, Vietnam Hanoi University of Pharmacy, Vietnam * Email address: vanthang.edu.vn@gmail.com http://doi.org/10.51453/2354-1431/2021/470 Article info Abstract Testin remedy of Assoc Prof Vu Van Dien, former Head of the Department of Recieved: 7/4/2021 Accepted: 3/5/2021 Keywords: Testin remedy, hard capsule, chemical fingerprint and HPLC quantification Traditional Medicine - Hanoi University of Pharmacy, including Eurycoma longifolia (10 g), Tribulus Terrestris (12 g), Polygonum cuspidatum (10 g), Lycium chinense (16 g), Cnidium monnieri (12 g), Astragalus membranaceus (14 g), Angelica sinensis (14 g), Morinda officinalis (10 g) has been shown to have the ability to support the treatment of male reproductive and sexual dysfunction We have developed a hard capsule preparation process The test criteria for semifinished products and finished hard capsules were carried out according to the treatise of Vietnam Pharmacopoeia IV, chemical fingerprints were determined by methods of thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography (HPLC) specifically as follows: The hard capsule contains all the substances found in the herbal ingredients of the Testin remedy and contains substances 8Methoxysporalen, Imperatorin, Osthole at both wavelengths 243 nm and 305 nm Imperatorin and Osthole content reached 0.456 g and 0.955 g The content of compounds in the hard capsule is consistent with those published in Testin 105 No.21_June 2021 |p.105-116 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG TỪ BÀI THUỐC TESTIN Nguyễn Văn Thắng1,*, Vũ Văn Điền2, Nguyễn Thị Thanh Duyên2 Trường Đại học Tân Trào, Việt Nam Trường Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam * Địa email: vanthang.edu.vn@gmail.com http://doi.org/10.51453/2354-1431/2021/470 Thơng tin viết Tóm tắt Ngày nhận bài: Bài thuốc Testin PGS.TS Vũ Văn Điền, nguyên Trưởng môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội gồm (Bá bệnh 10 g, bạch tật lê 12 g, 7/4/2021 Ngày duyệt đăng: cốt khí củ 10 g, câu kỷ tử 16 g, xà sàng tử 12 g, hoàng kỳ 14 g, đương quy 14g, ba kích 10 g) chứng minh có khả hỗ trợ điều trị suy giảm chức 3/5/2021 sinh sản, sinh dục nam Chúng tơi xây dựng quy trình bào chế viên nang cứng Các tiêu kiểm tra bán thành phẩm, thành phẩm viên nang cứng Từ khóa: Bài thuốc Testin, viên nang cứng, dấu vân tay hóa học định lượng HPLC tiến hành theo chuyên luận Dược điển Việt Nam IV, xác định dấu vân tay hóa học phương pháp phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) cụ thể sau: Trong viên nang cứng chứa đầy đủ chất có vị dược liệu thuốc Testin có chất 8-Methoxysporalen, Imperatorin, Osthole bước sóng 243 nm 305 nm, hàm lượng Imperatorin Osthole đạt 0,456 g 0,955 g Hàm lượng hợp chất viên nang cứng phù hợp với hợp chất công bố từ thuốc Testin I ĐẶT VẤN ĐỀ Nam giới sau tuổi 40 thường gặp vấn đề sinh dục với triệu chứng điển hình giảm hormon sinh dục nam (testosteron) [1] Suy giảm chức sinh dục nam dù không gây rủi lớn đến sức khỏe làm giảm chất lượng sống người bệnh phần ảnh hưởng tiêu cực đến phát triển xã hội Các rối loạn sinh dục thường xuất với q trình lão hóa [2], chứng bệnh hội chứng chuyển hóa (như béo phì bụng, đề kháng insulin, rối loạn lipid máu, dung nạp glucose bất thường tăng huyết áp) [3] Ngoài ra, lỗng xương, tình trạng stress, trầm cảm, rối loạn giấc ngủ, xã hội phát triển góp phần làm gia tăng suy giảm chức sinh dục, sinh sản nam [1] Theo Y học cổ truyền, biểu bệnh chủ 106 yếu chứng thận hư Để cải thiện suy giảm chức sinh sản, sinh dục nam, cha ơng ta tìm nhiều vị thuốc, thuốc, có nhóm bổ thận, bổ dương gồm nhiều vị thuốc khác bá bệnh, ba kích, bạch tật lê, xà sàng tử [4-8] Kế thừa phát huy mặt tích cực từ Y học cổ truyền, PGS TS Vũ Văn Điền xây dựng nên thuốc Testin với mục đích hỗ trợ điều trị suy giảm chức sinh sản, sinh dục nam Bài thuốc nghiên cứu tác dụng dược lý, bước đầu xác định dịch chiết ethanol 40% làm tăng testosteron chuột cống [9] Các hợp chất flavonoid tự nhiên tìm thấy số dược liệu xà sàng tử [10], bá bệnh, bạch tật lê, câu kỷ tử [11], ba kích [12] chứng minh có tác dụng chuyển hóa N.V.Thang et al/ No.21_Jun 2021|p.105-116 testosterone [13], ngăn ngừa thiểu sinh dục nam khởi phát muộn [14] hay chống lại suy giảm testosterone q trình lão hóa [15] Với định hướng đưa thuốc vào ứng dụng thực tế, nghiên cứu tiến hành với hai mục tiêu sau: Xây dựng quy trình bào chế đánh giá chất lượng cao đặc; Xây dựng cơng thức, quy trình tiêu chuẩn sở viên nang cứng II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Bá bệnh 10 g Bạch tật lê 12 g Cốt khí củ 10 g Câu kỉ tử 16 g Xà sàng tử 12 g Hoàng kỳ 14 g Đương quy 14 g Ba kích 10 g Bài thuốc PGS.TS Vũ Văn Điền đồng ý cho nghiên cứu Bốn vị thuốc bá bệnh, ba kích, bạch tật lê, xà sàng tử chứng minh có tác dụng cải thiện suy giảm chức sinh sản, sinh dục nam [4-8] Khi thêm hồng kì, đương quy, câu kỉ tử để bổ khí huyết, bổ can thận, thêm cốt khí củ làm tăng cường lưu thơng máu có tác dụng dược lý hướng sinh dục [16] 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng quy trình bào chế cao đặc từ thuốc Testin a Chiết xuất dịch chiết Dược liệu kiểm tra đạt chất lượng theo tiêu chuẩn DĐVN IV (riêng bá bệnh kiểm tra đạt tiêu chuẩn sở) [16], sau chiết với ethanol 40% theo phương pháp chiết hồi lưu chiết ngâm nhiệt độ phòng (2 ngày, ngày) Tính hiệu suất bào chế lựa chọn phương pháp chiết phù hợp Chiết hồi lưu: Chiết lần dụng cụ đun hồi lưu Lần 1: Cân lượng dược liệu tương ứng 10 thang thuốc: Xà sàng tử, bạch tật lê, câu kỉ tử cho vào túi nhỏ, thắt chặt miệng lại Tất đưa vào giỏ sắc, thêm ethanol 40% vào đến ngập dược liệu Đun sôi rút lấy dịch chiết lần Lần 2: Sau rút dịch chiết lần 1, thêm tiếp dung môi ethanol 40% đến ngập dược liệu, tiếp tục đun sôi rút lấy dịch chiết lần Lần 3: Tiến hành tương tự lần Chiết ngâm nhiệt độ phòng Chiết ngâm ngày: Chiết lần dụng cụ ngâm chiết, tiến hành tương tự chiết hồi lưu khơng đun nóng mà ngâm ngày rút dịch chiết lần Chiết ngâm ngày: Tiến hành tương tự chiết ngâm ngày kéo dài thời gian ngâm thêm ngày trước lần rút dịch chiết b Cô thành cao đặc Dịch chiết thu để lắng ngày gạn lấy dịch (phần cịn lại lọc qua bơng để loại bỏ cặn bã), dịch chiết sau đem cất thu hồi dung môi cao lỏng Cao lỏng để lắng, lọc qua bơng ly tâm tốc độ 5000 vịng/phút 30 phút để loại tối đa cặn bã, tạp chất thơ sơ cịn lẫn lại cao Dịch ly tâm đem cô cách thủy nhiệt độ không 80 oC đến thu cao đặc chất đạt tiêu chuẩn DĐVN IV c Đánh giá chất lượng cao đặc - Hình thức, cảm quan: Theo phụ lục 1.1 – DĐVN IV - Độ ẩm: Theo phụ lục 9.6 - DĐVN IV - Xác định pH dung dịch cao đặc nồng độ 1% (kl/tt): Theo phụ lục 6.2 – DĐVN IV - Xác định tỷ lệ tro toàn phần cao đặc: Theo phụ lục 9.8 - DĐVN IV - Xác định chất chiết nước cao đặc: Theo phụ lục 12.10 - DĐVN IV - Thử giới hạn nhiễm khuẩn: Theo phụ lục 13.6 - DĐVN IV 2.2.2 Xây dựng công thức quy trình bào chế viên nang cứng từ cao đặc a Xây dựng cơng thức quy trình bào chế Tiến hành khảo sát công thức lựa chọn phương pháp bào chế dựa thông số bào chế, khả sấy khô hạt, hiệu suất tạo hạt, tỷ lệ hạt có kích thước 180 μm, tỷ trọng biểu kiến hạt, số nén, Cố định phương pháp tạo hạt, thay đổi loại tỷ lệ tá dược phối hợp với cao đặc để lựa chọn cơng thức bào chế thích hợp Phương pháp tạo hạt sử dụng q trình khảo sát cơng thức phương pháp tạo hạt 107 N.V.Thang et al/ No.21_Jun 2021|p.105-116 Phương pháp tạo hạt 1: C: Trộn tá dược độn theo phương pháp đồng lượng; Trải cao đặc lên hỗn hợp tá dược đến cao đặc thấm đều; Tạo hạt, sửa hạt qua rây cỡ mm sấy hạt 60 °C [17] Sau lựa chọn loại tá dược tốt nhất, sử dụng phương pháp tạo hạt để thay so sánh với phương pháp tạo hạt Tỷ số nén Carr (%) dbk: Tỷ trọng biểu kiến (g/ml) dt: Tỷ trọng thơ, tính tỷ lệ khối lượng thể tích trước gõ khối bột (g/ml) [18] - Tốc độ chảy khối hạt: Cân xác 50,00 g hạt trộn tá dược trơn cho chảy qua phễu có đường kính 10 mm, dùng máy để đo tốc độ chảy khối hạt (g/s) c Đánh giá chất lượng viên nang cứng - Hình thức, cảm quan: Kiểm tra cảm quan Phương pháp tạo hạt 2: Trộn cao đặc với tá dược, sấy khô 50 60°C, xay mịn, cho qua rây 250 μm; - Độ ẩm hạt nang: Theo phụ lục 9.6 DĐVN IV Làm ẩm tá dược rã với ethanol 96% vừa đủ; - Độ đồng khối lượng: Theo phụ lục 11.3 DĐVN IV Phân tán tá dược rã vào bột cao (đã có tá dược hút); Tạo hạt, sửa hạt qua rây cỡ mm sấy hạt 60 °C [17] b Đánh giá chất lượng bán thành phẩm dạng hạt - Hình thức, cảm quan: Kiểm tra cảm quan - Độ ẩm hạt: Theo phụ lục 9.6 - DĐVN IV - Tỷ lệ hạt có kích thước 180 μm: Cân xác khoảng 50,00 g hạt cho qua rây 180 μm, tính tỷ lệ khối lượng hạt rây thu - Tỷ trọng biểu kiến hạt: d bk m Vbk dbk: Tỷ trọng biểu kiến (g/ml) Khối lượng bột đem đo (g) Vbk: Thể tích biểu kiến sau sử dụng máy gõ phút (ml) [17] - Tỷ số nén Carr hạt: C (%) = 100 x d bk - d t d bk Trong đó; 108 - Thử giới hạn nhiễm khuẩn: Theo phụ lục 13.6 - DĐVN IV 2.2.3 Định tính, định lượng cao đặc viên nang cứng a Định tính sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Chuẩn bị dịch chấm sắc ký + Dịch chiết dược liệu: Cân dược liệu tán thành bột mịn tương ứng có 1,00 g cao đặc Cho riêng vào bình nón ngâm ethanol 96% (ngâm lần, lần 10 ml giờ), gạn lọc lấy dịch, dịch lọc bốc dung mơi cịn khoảng ml để chấm sắc ký + Dịch chiết cao đặc: Lấy 1,00 g cao đặc, ngâm 30 ml ethanol 96%, gạn lấy dịch, lọc, dịch lọc đem bốc dung mơi cịn khoảng ml để chấm sắc ký Trong đó; m: - Độ rã viên nang cứng: Theo phụ lục 11.6 DĐVN IV + Dịch chiết thành phẩm: Lấy lượng thuốc tương đương 1,00 g cao đặc, nghiền mịn, ngâm 30 ml ethanol 96%, gạn lấy dịch, lọc, dịch lọc đem bốc dung mơi cịn khoảng ml để chấm sắc ký - Hoạt hóa mỏng silicagel GF 254 105 °C - Hệ dung môi khai triển [16], [18] Bá bệnh : Cloroform : Ethyl acetat (7:3) Xà sàng tử : Cloroform : Ethyl acetat (9:1) Bạch tật lê : Cloroform : Methanol (19:1) Ba kích : Toluen : Ethyl acetat : Acid formic (8:2:0,1) N.V.Thang et al/ No.21_Jun 2021|p.105-116 Hoàng kỳ : Cloroform : Methanol (19:1) Đương quy : Cyclohexan : Ethylacetat : Aceton (7:2:1) Câu kỉ tử : Toluen : Ethylacetat : Aceton : Acid formic (5:2:2:1) Cốt khí củ : Toluen : Cloroform : Aceton (4:2,5:3,5) - Chạy sắc ký: Chấm riêng dịch chiết mỏng với thể tích, để khô tự nhiên, chạy sắc ký đến vạch giới hạn dung môi (cách mép 0,5 cm) để khô nhiệt độ phòng Phát vết cách soi đèn tử ngoại, bước sóng 254 nm 366 nm b Định lượng flavonoid toàn phần Hàm lượng flavonoid tồn phần cao đặc - Cân xác 5,00 g cao đặc, hòa tan 25 ml nước, cho vào bình gạn, loại tạp với ether dầu hỏa lần (15 ml/lần) lấy lớp nước Đun nóng nhẹ lớp nước đuổi hết ether dư, chiết với ethylacetat nhiều lần dịch chiết khơng cịn flavonoid (kiểm tra phản ứng Cyanidin) Dịch chiết đem cô cách thủy sấy 80 °C tới khối lượng khơng đổi [18] - Hàm lượng flavonoid tồn phần cao đặc tính theo cơng thức: B1 (%) = b - mc × 10 100 - X m m: Khối lượng hạt đem thử (g) c Xác định dấu vân tay hóa học định lượng số chất cao đặc, viên nang cứng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Chuẩn bị mẫu Mẫu chuẩn: - Cân xác khoảng 1,0 mg chất chuẩn, hòa tan 1,0 ml methanol, siêu âm 10 phút cho tan hoàn toàn, lọc qua màng lọc nylon (kích thước 0,45 μm) thu dung dịch gốc có nồng độ 1000 μg/ml Dung dịch gốc dùng để pha dung dịch khác có nồng độ thích hợp - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Được chuẩn bị cách pha phối hợp 100 μl dung dịch chất chuẩn 7-hydroxycoumarin (1), scopoletin (2), piceid (3), kaempferol 3-glucosid (4), eurycomalacton (5), 8-methoxypsoralen (6), imperatorin (7), osthole (8) nồng độ 1000 μg/ml thu dung dịch chứa hỗn hợp chất chuẩn với nồng độ 125 μg/ml Mẫu thử: Trong đó; B1: Hàm lượng flavonoid tồn phần cao đặc (%) b: Tổng khối lượng cắn cốc (g) mc: Khối lượng cốc (g) m: Khối lượng cao đem thử (g) X: Độ ẩm cao (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần viên nang cứng - Cân lượng hạt tương đương với 5,00 g cao đặc, tiến hành tương tự cao đặc Hàm lượng flavonoid toàn phần viên nang tính theo cơng thức: B2 (%) = b - mc m Trong đó; B2: Hàm lượng flavonoid toàn phần viên nang (%) b: Tổng khối lượng cắn cốc (g) mc: Khối lượng cốc (g) - Cao đặc: Cân xác 40,0 mg cao đặc tỷ lệ 1:4 (tt/kl) hòa tan ml methanol 40% (siêu âm 10 phút cho cao đặc tan hoàn toàn) Lọc qua màng lọc nylon kích cỡ 0,45 μm thu dung dịch có nồng độ 40 mg/ml - Viên nang cứng: Cân lượng bột thuốc có nang 20 viên nang cứng, tính khối lượng trung bình Trộn đều, nghiền thành bột mịn Cân khối lượng bột thuốc tương ứng viên nang, cho vào bình định mức 100 ml, thêm methanol 40%, khuấy siêu âm cho tan hoàn toàn, thêm methanol 40% đến vạch Lọc qua màng lọc kích thước 0,5 mm, bỏ 10 ml dịch lọc đầu Tiếp tục lọc qua màng lọc nylon kích cỡ 0,45 μm, thu dung dịch làm thí nghiệm Chương trình sắc ký - Pha tĩnh: Cột Zorbax XDB-C18 (250 mm x 4,6 mm x 5µm) - Tốc độ dịng 0,5 ml/phút; thể tích tiêm 10 μl; phát bước sóng 305 nm - Pha động: acetonitril: acid phosphoric 0,1%, rửa giải theo chương trình dung mơi 109 N.V.Thang et al/ No.21_Jun 2021|p.105-116 - Chương trình dung mơi: Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid phosphoric (%) Kiểu rửa giải - 78 - 18 98 - 82 Gradient 78 - 82 18 - 25 82 - 75 Gradient 82 - 110 25 75 Đẳng dòng 110 - 130 25 - 60 75 - 40 Gradient 130 - 150 60 - 100 40 - Gradient Tiến hành - Tiêm dung dịch thử, ghi sắc ký đồ, xác định pic có thời gian lưu với pic chuẩn Nồng độ chất chuẩn dung dịch tính theo cơng thức: S-b ×H C= a Trong đó: S: Diện tích pic a, b: Hệ số đường chuẩn H: C: µg/ml Độ tinh khiết chất chuẩn Nồng độ chất chuẩn dung dịch thử - Hàm lượng chất chuẩn cao tỷ lệ 1:4 (tt/kl) tính theo cơng thức: 110 X= Cdd 1000 4000 Trong đó; X: Hàm lượng chất có mẫu thử Cdd: Nồng độ chất dung dịch thử III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết xây dựng quy trình bào chế cao đặc 3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết xuất Khảo sát thấy: Độ ẩm loại cao đặc (chiết hồi lưu, chiết ngâm ngày, ngày) 18,88%, 18,03%, 18,42% với hiệu suất 28,33%, 26,42%, 25,16% Do đó, tơi lựa chọn phương pháp chiết hồi lưu để bào chế cao đặc hiệu suất chiết cao hơn, thời gian nhanh Quy trình bào chế cao đặc theo phương pháp chiết hồi lưu tóm tắt sau: N.V.Thang et al/ No.21_Jun 2021|p.105-116 3.1.2 Kiểm tra chất lượng cao đặc - Hình thức, cảm quan: Cao đặc chất mềm, đồng nhất, tan hồn tồn dung môi ethanol 40%, màu nâu đen, mùi thơm, vị đắng nhẹ, ngậm lâu - Độ ẩm cao đặc: Đạt 18,74% - pH dung dịch cao đặc nồng độ 1% (kl/tt): Đạt 4,05 - Tro toàn phần cao đặc: Đạt 8,38% - Chất chiết nước cao đặc: Đạt 51,14% - Giới hạn nhiễm khuẩn: Kết sau: Vi khuẩn hiếu khí sống lại: < 10 CFU/g Vi khuẩn (E coli; S aureus; P aeruginosa; Salmonella spp): Khơng có Tổng số vi nấm: < 40 CFU/g Tổng số Enterobacteria: < CFU/g 3.1.3 Phương pháp bào chế cao đặc Chiết nóng tiết kiệm thời gian, tạo nhiều tạp chất, dụng cụ phức tạp, hoạt chất dược liệu chịu ảnh hưởng nhiệt độ gây phân hủy phần 3.2 Kết xây dựng công thức quy trình bào chế viên nang cứng Chất lượng cao phụ thuộc nhiều yếu tố dung môi, phương pháp chiết, thời gian chiết, chất lượng dược liệu kích thước dược liệu Tơi chọn dạng thuốc phiến để chiết, q trình rút dịch chiết nhanh hơn, tạp chất hơn, thuận lợi với khối lượng lớn riêng lẻ, kết hợp (các tỷ lệ khác nhau) Avicel PH 101, Magnesi carbonat, Calci carbonat, tinh bột 3.2.1 Khảo sát cơng thức quy trình bào chế Khảo sát tạo hạt từ cao đặc với tá dược độn Công thức bào chế cho 100 g hạt đóng viên nang cứng là: Cao đặc 60 g Avicel PH 101 20 g Magnesi carbonat 20 g Ethanol 96% ml Talc: 2% lượng hạt thu Magnesi stearat: 1% lượng hạt thu Quy trình bào chế sau: Magnesi carbonat, cao đặc Trộn Sấy khô - 50 - 60°C Nghiền mịn Rây Avicel PH 101, ethanol 96% Trộn Xát hạt - Rây 1000 μm Sấy khô - 60°C Sửa hạt Magnesi stearat, Talc Nang số - Rây 250 μm - Rây 1000 μm Trộn Đóng nang 111 ... dục nam Chúng tơi xây dựng quy trình bào chế viên nang cứng Các tiêu kiểm tra bán thành phẩm, thành phẩm viên nang cứng Từ khóa: Bài thuốc Testin, viên nang cứng, dấu vân tay hóa học định lượng... HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG TỪ BÀI THUỐC TESTIN Nguyễn Văn Thắng1,*, Vũ Văn Điền2, Nguyễn Thị Thanh Duyên2 Trường... nồng độ 40 mg/ml - Viên nang cứng: Cân lượng bột thuốc có nang 20 viên nang cứng, tính khối lượng trung bình Trộn đều, nghiền thành bột mịn Cân khối lượng bột thuốc tương ứng viên nang, cho vào bình