Nghiên cứu khoa học công nghệ TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT CĨ HOẠT TÍNH CELLULASE ĐỖ THỊ TUYẾN (1), ĐẶNG THỊ HỒNG PHƯƠNG (1), ĐỖ TẤT THỊNH (2), NGÔ CAO CƯỜNG (1) ĐẶT VẤN ĐỀ Ứng dụng công nghệ vi sinh xử lý ô nhiễm môi trường nói chung xử lý chất thải hữu nói riêng giải pháp triển khai rộng rãi hiệu môi trường, kinh tế kỹ thuật Các chất thải hữu đặc biệt chất thải từ người, động vật coi nguồn chứa nhiều dinh dưỡng cho trồng Nếu quản lý xử lý tốt, coi nguồn cung cấp dinh dưỡng dồi cho trồng nông nghiệp biện pháp thu gom xử lý tận dụng phân người làm phân bón cho trồng thực nhà tiêu khô Theo nghiên cứu ra, trình ủ composting chất thải nhà tiêu khô, vi sinh vật hoạt động phân giải hợp chất hữu phức tạp bao gồm hydratcacbon, đường, protein, chất béo, chất xơ (hemicellulose, cellulose) lignin… thành hợp chất đơn giản vi sinh vật trồng hấp thu Đồng thời hoạt động vi sinh vật sinh nhiệt làm nhiệt độ đống ủ tăng cao giúp tiêu diệt mầm bệnh có chất thải [1] Việc sử dụng vi sinh vật phân giải cellulose sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý ô nhiễm môi trường nhà khoa học giới Việt Nam nghiên cứu ứng dụng Chế phẩm vi sinh gồm chủng xạ khuẩn ưa nhiệt có khả sinh tổng hợp cellulase Zhao Y cộng sàng lọc từ mẫu phân ủ để bổ sung vào giai đoạn khác trình ủ phân Kết cho thấy việc bổ sung chế phẩm vào đống ủ có hiệu tích cực, giúp đẩy nhanh trình phân hủy cellulose, làm tăng hàm lượng chất mùn có ảnh hưởng đến quần xã vi sinh vật đống ủ, so với đống ủ không bổ sung chế phẩm [1] Ở Việt Nam, chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces bổ sung vào chế phẩm vi sinh Sagi Bio-1 sử dụng để xử lý chất thải chăn nuôi [2] Trần Hoàng Dũng cộng nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật phân giải cellulose thuộc nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc để ứng dụng xử lý rác thải giàu cellulose [3] Để góp phần làm giàu chủng giống vi sinh vật phân giải cellulose định hướng sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý chất thải nhà tiêu khô, phạm vi nghiên cứu này, chủng xạ khuẩn ưa nhiệt có khả sinh cellulase tập trung nghiên cứu tuyển chọn định danh ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng môi trường nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu thu thập từ đống ủ phân chuồng (47 chủng sàng lọc nhiệt độ 50oC 3-5 ngày phân lập trước thực nghiên cứu này) lưu trữ phịng thí nghiệm Phân viện Cơng nghệ Sinh học, Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga 48 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ nhiệt đới, Số 22, 05-2021 Nghiên cứu khoa học công nghệ 2.1.2 Môi trường nghiên cứu Môi trường cảm ứng sinh enzyme: Cơ chất 20g; FeSO4.7H2O 0,01g; KNO3 1,0g; K2HPO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; NaCl 2g; thạch 15g (Cơ chất tương ứng: CMC, tinh bột, gelatin, tween 80) [3, 4] Môi trường dịch thể có thành phần tương tự khơng bổ sung thạch Mơi trường ni cấy xạ khuẩn sinh cellulase (gam/lít): CMC (carboxymethyl cellulose) 2g; Gelatin 2g; KH2PO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,25g; Thạch 15g [4] Mơi trường thử hoạt tính enzyme: mơi trường cảm ứng sinh enzyme với nguồn chất 1%, thạch 15g/L [3, 4] Môi trường nuôi cấy phân loại chủng xạ khuẩn: Các môi trường sử dụng theo hướng dẫn ISP (International Streptomyces Project) khóa phân loại Bergay [5, 8] 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.2 Tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme Phương pháp đặt thỏi thạch: Đục thỏi thạch đường kính mm chứa chủng xạ khuẩn phát triển môi trường cảm ứng sinh enzyme, chuyển sang đĩa thạch chứa môi trường thử hoạt tính enzyme tương ứng, đặt nhiệt độ 4oC giờ, chuyển sang tủ ấm 37oC 24 giờ; màu vòng phân giải chất thuốc nhuộm Lugol [4, 12] Phương pháp đục thỏi thạch xác định hoạt tính enzyme mơi trường dịch thể: Để lựa chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh nhiều loại enzyme thủy phân, tiến hành nuôi môi trường dịch thể cảm ứng sinh enzyme, 37oC, tốc độ lắc 200 vịng/phút 72 Ly tâm dịch ni cấy 10000 vịng/phút 15 phút thu dịch enzyme thơ Nhỏ 100 µL dịch enzyme thơ vào giếng thạch đục sẵn (đường kính 8mm) mơi trường thử hoạt tính Các bước tiến hành tương tự phương pháp đặt thỏi thạch [4] Hoạt tính enzyme đánh giá thơng qua hiệu số kích thước vịng phân giải (D, mm): D = D - d; Trong đó: D: Kích thước vịng phân giải; D: Đường kính vịng phân giải; d: Đường kính lỗ thạch [4, 6] 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu số đặc điểm sinh học xạ khuẩn Đặc điểm hình thái: Màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty chất (KTCC) sắc tố tan xác định nuôi cấy xạ khuẩn môi trường: ISP1, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7, ISP8, ISP9 Sau đến 10 ngày quan sát màu sắc KTKS, KTCC sắc tố tiết môi trường [8] Đặc điểm sinh hóa: Khảo sát khả đồng hóa nguồn carbon thơng qua quan sát phát triển chủng xạ khuẩn môi trường ISP có bổ sung 1% nguồn đường: glucose, maltose, lactose, sucrose, galactose, rhamnose…[8] Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ (25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60oC), pH ban đầu (pH: 3-10) nồng độ muối NaCl (0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8%) Sau 7-10 ngày bắt đầu quan sát sinh trưởng xạ khuẩn [4, 8] Tạp chí Khoa học Công nghệ nhiệt đới, Số 22, 05-2021 49 Nghiên cứu khoa học công nghệ 2.2.4 Phân loại dựa vào phân tích trình tự gen 16S rDNA DNA tổng số tách chiết theo Kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification (Thermo Scientific, Mỹ) Phản ứng PCR khếch đại gen 16S rDNA sử dụng cặp mồi xi 27F với trình tự 5’GAGTTTGATCCTGGCTCAG3’; mồi ngược 1492R với trình tự 3’TACGGYTACCTTGTTACGACTT5’ [8] Sản phẩm PCR có kích thước 1270 bp kiểm tra điện di gel agarose 1%, sau gửi tinh giải trình tự cơng ty VNDAT Kết giải trình tự 16S rRNA xạ khuẩn phân tích so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế NCBI chương trình BLAST để định danh tới lồi xạ khuẩn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn ưa nhiệt có hoạt tính enzyme cao Từ sưu tập 47 chủng xạ khuẩn, phương pháp đặt thỏi thạch tuyển chọn chủng có khả phân giải chất CMC mạnh dựa vào đường kính vịng phân giải chất Các chủng tiếp tục khảo sát khả sinh tổng hợp đa dạng enzyme ngoại bào amylase, protease, lipase nuôi cấy môi trường cảm ứng sinh enzyme Đồng thời, tiến hành đánh giá khả sinh cellulase ngoại bào chủng xạ khuẩn môi trường nuôi cấy dịch thể theo phương pháp đục thỏi thạch Kết cho thấy, khả phân giải CMC mạnh, chủng xạ khuẩn có khả cảm ứng sinh enzyme ngoại bào phân giải loại chất tinh bột tan, gelatin, tween 80 Trong chủng xạ khuẩn XM241 XM6 thể hoạt tính enzyme mạnh với loại chất thử nghiệm (Bảng 1) Điều có ý nghĩa quan trọng thực tế xử lý chất thải hữu cơ, thông qua khả sinh đa dạng enzyme ngoại bào mình, chủng thuỷ phân chất phức tạp, khó tan chất thải để chuyển hoá thành thành phần dễ tan trồng hấp thu được, giảm nguy gây ô nhiễm môi trường Căn vào đường kính vịng phân giải CMC khả phân giải đa dạng nguồn chất tinh bột, gelatin, tween 80 chủng xạ khuẩn (bảng 1), chủng XM6 lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại Bảng Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn Kí hiệu MC1 MC4 BT9 AP16 XM24 XM241 XM6 Đường kính vịng phân giải CMC Hoạt tính enzyme phân giải chất dịch nuôi cấy (D-d, mm) CMC Tinh bột Gelatin Tween 80 ++ + ++ + 18 ++ + ++ ++ 15 ++ + ++ + 11 ++ + + + 10 ++ + ++ ++ 23 ++ ++ ++ ++ 25 ++ ++ ++ ++ 27 Ghi chú: + : Có hoạt tính enzyme phân giải chất (0