Luận văn thạc sĩ sinh học ứng dụng nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài giáp (paphiopedilum malipoense) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRỊNH THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP (Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO LUÂṆ VĂN THAC̣ SI ̃SINH HOC̣ ỨNG DỤNG THÁI[.]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRỊNH THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP (Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRỊNH THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP ( Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Duy THÁI NGUYÊN - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi thực hiện dưới sự hướng dẫn TS Nguyễn Văn Duy Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Trịnh Thị Tuyết ii LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy ThS Nguyễn Thị Tình, Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nơng Lâm Thái Ngun tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt thời gian thực hiện hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo anh chi ̣ kỹ thuật viên phịng thí nghiệm ni cấy mô tế bào thực vật , Khoa CNSH - CNTP, Trường đại học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình làm luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa ho ̣c - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Khoa ho ̣c Sự số ng thầy cô giáo, cán Khoa, đặc biệt sự quan tâm, giúp đỡ các anh chi ̣kỹ thuâ ̣t viên phịng thí nghiệm Khoa Khoa ho ̣c sự sớ ng Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tơi hồn thành luận văn Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận sự đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè để tơi làm tốt Tác giả luận văn Trịnh Thị Tuyết iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan phân loại đặc điểm lan Hài lan Hài Giáp 1.1.1 Đặc điểm thực vật học lan Hài (Paphiopedilum) 1.1.2 Đặc điểm thực vật học lan Hài Giáp 11 1.2 Khái quát nuôi cấy mô tế bào 15 1.2.1 Các vấn đề thường gặp nhân giống in vitro 15 1.2.2 Ưu nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô 16 1.2.3 Quy trình nhân giống in vitro 18 1.2.4 Ứng dụng nuôi cấy mô nghiên cứu ứng dụng nông nghiệp 20 1.3 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô lan Hài giới nước 21 1.3.1 Trên giới 21 1.3.2 Trong nước 24 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 26 2.2 Phạm vi nghiên cứu 27 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 iv 2.4 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 28 2.4.1 Hóa chất 28 2.4.2 Thiết bị 28 2.4.3 Dụng cụ 28 2.5 Phương pháp nghiên cứu 29 2.5.1 Phương pháp chuẩn bị môi trường điều kiện nuôi cấy 29 2.5.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 30 2.5.3 Phương pháp xử lí số liệu 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 0,1 % đến lan Hài Giáp 33 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường tới khả nảy mầm hạt lan Hài Giáp 35 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng hợp chất hữu đến khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 36 3.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA tới khả nhân nhanh chồi lan hài Hài Giáp 36 3.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với NAA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 39 3.3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 42 3.4 Kết nghiên cứu tạo in vitro hoàn chỉnh 45 3.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ lan Hài Giáp 45 3.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính tới khả rễ 48 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể tới khả sinh trưởng phát triển lan Hài Giáp 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN: Deoxyribonucleic acid B5: Gamborg cs, 1976 BA : - benzyl amino purine CT : Công thức CS : Cộng sự ĐC : Đối chứng KC: Knudson C MS : Murashighe Skoog, 1962 NAA : Naphthalene acetic acid PCR: Polymerase Chain Reaction RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA THT : Than hoạt tính SH: Schenk and Hildebrandt, 1972 VW : Vacin and Went WPM : Woody Plant Medium – Lioyd Mc Cown, 1980 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các nhóm lan Hài Viê ̣t Nam theo thứ ̣ng bảo tồ n của Tổ chức Bảo tồ n Thiên nhiên Quố c tế (IUCN) Bảng 2.1: Hóa chất nghiên cứu 28 Bảng 2.2: Thiết bị nghiên cứu 28 Bảng 3.1: Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% đến lan Hài Giáp 33 Bảng 3.2: Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường tới khả nảy mầm hạt 35 Bảng 3.3: Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA tới khả nhân nhanh lan Hài Giáp 37 Bảng 3.4: Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp với NAA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 40 Bảng 3.5: Kết nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 43 Bảng 3.6: Ảnh hưởng NAA tới sự rễ 46 Bảng 3.7: Kết nghiên cứu ảnh hưởng NAA kết hợp với than hoạt tính ảnh hưởng tới khả rễ 48 Bảng 3.8: Sự phát triển lan Hài Giáp số giá thể ngồi mơi trường tự nhiên (sau tuần) 51 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái lan Hài Giáp 13 Hình 2.1: Cây lan Hài Giáp 27 Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm 29 Hình 3.1: Ảnh hưởng môi trường tới khả nảy mầm hạt sau 12 tuần 36 Hình 3.2: Ảnh hưởng BA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 39 Hình 3.3: Ảnh hưởng BA kết hợp với NAA tới khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 42 Hình 3.4: Ảnh hưởng dịch chiết chuối xanh tới khả nhân nhanh lan Hài Giáp 44 Hình 3.5: Ảnh hưởng NAA tới khả rễ lan Hài Giáp 47 Hình 3.6: Ảnh hưởng NAA kết hợp với THT tới khả rễ lan Hài Giáp 50 Hình 3.7: Ảnh hưởng giá thể tới khả sinh trưởng phát triển lan Hài Giáp 52 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hoa lan người biết đến sớm từ 2.800 năm TCN, coi đỉnh cao tiến hóa lồi hoa Hiện giới với 800 chi 25.000 – 30.000 lồi Họ Lan (Orchidaceae) chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc (Asteraceae) ngành thực vật hạt kín [20] Vì hình thái, cấu tạo hệ thống phân loại họ đa đa dạng phức tạp Việt Nam quốc gia đánh giá có sự đa dạng sinh học phong phú, phong lan Việt Nam đa dạng số loài, màu sắc chủng loại với 140 loại phong lan chia thành 1000 giống nguyên thủy Chúng thường phân bố vùng rừng núi Cao Bằng, Sa Pa, Lào Cai, Huế, Hải Vân, Quy Nhơn, Kontum, Pleiku, Ban Mê Thuật, Phan Rang, Đà Lạt, Di Linh, v.v [13] Trong số lồi lan Việt Nam có nhiều quý điển hình giống Lan Hài (Paphiopedilum) gồm 66 loài phân bố từ Ấn Độ, New Ghine vùng Đơng Nam Á, người Pháp gọi lồi thuộc giống Hài Vệ Nữ Sabot de Venus người Anh dùng với ý nghĩa tương tự Lady's slippers [1] Hiện Việt Nam tìm thấy 22 lồi thuộc chi Paphiopedilum có lồi đặc hữu có giá trị xuất hiện Việt Nam lan Hài Đỏ, lan Hài Vàng, lan Hài Tía, lan Hài Trắng, lan Hài Vân, lan Hài Vân Duyên, lan Hài Đốm, lan Hài Lông hay lan Hài Râu,…[1] Lan Hài Giáp loài lan xuất hiện số tỉnh miền núi phía bắc Bắc Kạn, Hà Giang, Hịa Bình, Lạng Sơn, Sơn La,…Lồi sinh sống khu rừng nguyên sinh rậm, thường xanh rộng hỗn giao kim núi đá vơi kết tinh bị bào mịn mạnh độ cao từ 600 đến 1200m [16] Đây lồi lan Hài đặc biệt có hoa đẹp tao nhã với đài cánh hoa xanh cây, mơi xám, xanh nhạt nhị lép trắng với chóp màu nâu tía, hoa có mùi thơm táo nhẹ Chúng có rộng kẻ chữ nhật đốm khảm xanh tươi xanh thẫm, đốm tím tía mặt dưới cụm hoa thường dài mang hoa to đơn độc [1] Chính vẻ đẹp tao nhã, có giá trị thẩm mỹ cao nên giới ưa chuộng dẫn đến tình trạng thu thập xuất lan Hài Giáp ạt không kiểm soát được, khiến cá thể khan tự nhiên Đồng thời với tình trạng mơi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt hiện nay, lan Hài Giáp biến nhanh chóng Trước tình hình lan Hài Giáp xếp vào nhóm nguy cấp (EN) Sách đỏ Việt Nam nhóm IA (các loài bị nghiêm cấm khai thác sử dụng mục địch thương mại) nghị định 32 năm 2006 Chính Phủ [16] Đặc thù riêng lan Hài Giáp sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy mầm hạt tự nhiên thấp [20] việc nghiên cứu nhân giống lan Hài trọng nhằm mục đích thương mại bảo tồn nguồn gen thực vật quý Trước nhà nghiên cứu tiến hành nhân giống loài lan Hài nhiều phương pháp khác gieo hạt, tách mầm phương pháp nhiều nhược điểm chất lượng thấp, không đồng số lượng [6] Để khắc phục điều này, phương pháp nhân giống in vitro đời nhằm khắc phục hạn chế Phương pháp cho số lượng lớn, chất lượng cao, đồng bệnh, điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện Hiện nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro phát triển mạnh mẽ tạo số lượng lớn, bệnh, ổn định mặt di truyền thời gian ngắn đáp ứng giá phải thị trường coi giải pháp lý tưởng để bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy bị tuyệt chủng [6] Xuất phát từ thực tiễn chúng tơi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) phương pháp in vitro” Mục đích nghiên cứu - Xác định ảnh hưởng môi trường chất kích thích sinh trưởng tới q trình nhân giống in vitro lan Hài Giáp 3 - Xác định giá thể thích hợp để đưa từ ống nghiệm môi trường tự nhiên Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu khử trùng lan Hài Giáp tạo mẫu ban đầu ống nghiệm 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường tới khả nảy mầm hạt lan Hài Giáp 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng chất hữu đến khả nhân nhanh sự sinh trưởng chồi lan Hài Giáp ống nghiệm 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA than hoạt tính đến khả tạo rễ chồi lan Hài Giáp ống nghiệm 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng phát triển in vitro vườn ươm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu xác định mơi trường thích hợp cho nhân giống lan Hài Giáp phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giá ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường nuôi cấy thời gian khử trùng mẫu cấy, bổ sung thêm liệu cho việc nghiên cứu loại lan khác 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu cố gắng cung cấp số lượng giống có chất lượng cao, đồng cho sản xuất 4 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan phân loại đặc điểm lan Hài lan Hài Giáp 1.1.1 Đặc điểm thực vật học lan Hài (Paphiopedilum) 1.1.1.1 Phân loại Về mặt thực vật ho ̣c, các loài lan Hài thuộc vào chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường đươ ̣c go ̣i là Hài Vê ̣ Nữ phân bố ở các vùng ôn đới - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố vùng nhiệt đới Châu Mi.̃ - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 lồi phân bố ở vùng nhiê ̣t đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đế n Philippine, New Guinea và Quầ n đảo Solomon Ở Viê ̣t Nam loài lan Hài đề u thuô ̣c giới Thực vâ ̣t (Plantae), ngành Ha ̣t kiń (Angiospermatophyta), lớp Một lá mầ m (Monocotyledoneae), phân lớp Hành (Liliidae), bô ̣ Lan (Orchidales), ho ̣ Lan (Orchidaceae), họ phu ̣ Epidendroideae, tông Cypripedioideae, chi Paphiopedilum [1] 1.1.1.2 Nguồ n gố c Chi Paphiopedilum có nguồ n gố c từ vùng lu ̣c điạ Đơng Nam Á đó có Viê ̣t Nam Các loài nguyên thuỷ nhấ t chi này đươ ̣c tìm thấ y chủ yế u Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, mỗ i loa ̣i chi này đề u có khu phân bố rấ t ̣n chế [1] Hầ u tấ t cả các loài lan đề u bắ t nguồ n từ các tổ tiên kiể u hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài go ̣i là ba lá đài và ba mảnh bao vòng go ̣i là ba cánh hoa) và sáu nhi đư ̣ c̣ (ba nhi ̣đư ̣c ở vòng ngoài và ba nhi đư ̣ c̣ ở vòng trong) Xu hướng tiế n hoá của ho ̣ Lan là giảm số lươ ̣ng nhi ̣ đư ̣c và sự dính liề n giữa nhi đư ̣ ̣c hữu thu ̣ với nhi ca ̣ ́ i là sự biế n đổ i hoa bản nhấ t dẫn đế n sư ̣ tiế n hoá của ho ̣ Lan Sư ̣ giảm liên tu ̣c số lươ ̣ng nhi đư ̣ c̣ dẫn đế n sư ̣ hình thành các nhóm lan có ba, hai hay mô ̣t nhi ̣đư ̣c tồ n ta ̣i hoa Trong ho ̣ chi lan Hài (thuô ̣c tông Cypripedioideae) là dòng tiế n hoá có hai nhi ̣ đưc̣ còn tồ n ta ̣i hoa [1]; [20] 1.1.1.3 Đă ̣c điểm hin ̀ h thái Theo Nguyễn Thiện Tịnh (2001), các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có hình dạng bên ngoài rấ t đa da ̣ng, chúng mang những đă ̣c điể m hình thái chung sau [20]: - Da ̣ng cây: là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiề u lá mo ̣c thành hai hàng xế p thành hiǹ h qua ̣t, có da ̣ng thân bò Tấ t cả các loài đề u có thân rễ đa số rấ t ngắ n - Lá: thường có hình trứng ngươ ̣c hay bầ u dục thuôn và mở rộng Mỗi có đốt gốc, dưới bẹ hình chữ V xếp lợp xít lên thân Độ dài lá có thể từ 3-50 cm Mặt có thể có màu xanh lá hoă ̣c khảm bởi các mảng đâ ̣m nha ̣t không đề u với các gân màu xanh lá nổ i rõ Mă ̣t dưới lá có các đố m tím dày đă ̣c hoă ̣c vết tím xỉn chỉ thấ y rõ ở gầ n gố c lá Lá của các loài điể n hình cho điều kiê ̣n số ng khô đề u dày, mo ̣ng nước và cứng - Cu ̣m hoa: thường thẳ ng đứng hay cong, mơ ̣t sớ loài có ć ng hoa nằ m ngang, mô ̣t số loài lại có cuố ng hoa chúc xuố ng, hầ u hết loài đề u có cuố ng hoa dựng đứng Phầ n lớn các loài chỉ có mô ̣t hoa riêng lẻ, nhiên cũng có lồi có cụm hoa mang hai hoa, song rấ t hiế m Tru ̣c cu ̣m hoa có lông tơ dầ y và ngắn hay có lơng nhung hoă ̣c nhẵn Lá hoa cụm hoa gấp đơi có hình dạng khác tùy lồi, từ hình múi giáo hay hình trứng có chóp nhọn đến hình bầu dục trịn Lá hoa thường có lơng tơ phần khác cụm hoa nói chung thường có lơng mép lơng cứng gần mặt ngồi lá, mơ ̣t số loài có hoa nhẵn - Hoa: gồ m hai lá đài ở vòng ngoài, mô ̣t lá đài lưng, mô ̣t lá đài hơ ̣p và ba cánh hoa ở vòng Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳ ng lên và thường nổ i bâ ̣t với các va ̣ch hay chấ m ở mă ̣t Lá đài lưng nằ m đố i diêṇ với lá đài hơ ̣p ở vi tri ̣ ́ thấ p và hướng xuố ng phía dưới Lá đài hơ ̣p nằ m phía sau của môi thường có mô ̣t màu tố i xỉn và kém nổ i bâ ̣t so với lá đài lưng Cả hai lá đề u thường có lông tơ dày ở mă ̣t ngoài Hai cánh hoa bên dễ dàng nhận thấy hai bên đài thường xoè xuống dưới theo chiều ngang Chúng có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay trịn Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh Cánh hoa thứ ba biế n da ̣ng rõ rê ̣t thành mô ̣t môi giố ng cái bao hoă ̣c hình chiế c hài Môi dạng túi sâu và phồ ng lên, hình giầ y, có lơng mă ̣t và nhẵn ở mă ̣t ngoài Nhi ̣ bấ t thụ của vòng ngoài nhụy cái hơ ̣p thành cô ̣t nhi ̣– nhụy Hai nhị đưc̣ hữu thu ̣ vòng có chỉ nhi ̣ ngắ n dính liề n ở phía sau núm nhụy và hai bên cô ̣t Bầu dưới, mô ̣t ô, đỉnh noañ bên là điể m đă ̣c trưng của chi này Hầ u hết các loài lan Hài bầ u có lông tơ, hình tru ̣, màu xanh lá hay đỏ tía xỉn - Quả: da ̣ng nang, khô, dài, có mô ̣t ô với ba van rô ̣ng và ba van hep ̣ Quả mở ở gầ n đỉnh bằ ng rañ h nứt Quả thường chín điề u kiên tự nhiên sau thu ̣ phấ n từ sáu đế n mười tháng - Ha ̣t: có hin ̀ h bầu dục, hiǹ h suố t chỉ ngắn,da ̣ng thuôn dài hay he ̣p và thường có chiề u dài từ 0,4 – 1,1 mm, phôi nhỏ dài từ 0,3 – 0,4 mm Ha ̣t khơng có nơ ̣i nhũ đó khó nảy mầm điề u kiêṇ tự nhiên - Rễ: rễ chùm, có lớp mơ xớ p bo ̣c xung quanh rễ thâ ̣t, lớp màng xố p này có vai trò viêc̣ giữ nước và ngăn chă ̣n ánh sáng gay gắ t Sau rễ trưởng thành thì có da ̣ng sơ ̣i mảnh với ̣ floem phát triể n ma ̣nh và không có búi nấ m xung quanh rễ 1.1.1.4 Sinh thái Các loài lan Hài ở Viê ̣t Nam có thể chia thành hai nhóm riêng Mô ̣t nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phiá Bắ c Viêṭ Nam từ đô ̣ cao mă ̣t nước biể n lên đế n 1600m, nhóm còn la ̣i phân bố ở khu vực có đá me ̣ silicat, đá phiế n và cát kế t ở đô ̣ cao từ 700m – 2200m Ngoài có mô ̣t vài cá thể nhóm này còn mo ̣c bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit [16] Lan Hài của Viêṭ Nam có thể số ng đấ t, bám đá và phu ̣ sinh mùn Các loài sống đấ t thường mo ̣c ở nơi có ít ánh sáng của tán rừng, ở nơi sườn núi dố c, các nề n đất có nhiề u lá rơi bi ̣phân huỷ ma ̣nh và giàu chấ t mùn Các loài lan Hài mo ̣c đá thường mo ̣c dưới bóng của kiể u rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và bên dưới các đường đỉnh Các loài phu ̣ sinh mù n chủ yế u số ng bá m vỏ gỗ vùng rừng mây mù ẩm đô ̣ cao 1200m – 1500m [16] Ta ̣i Viê ̣t Nam lan Hài thường phân bố vùng có lươ ̣ng mưa lớn, ẩm đô ̣ cao Tuy nhiên đặc trưng vùng khí hậu nhiê ̣t đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua mô ̣t giai đoa ̣n khô ̣n Sự xuấ t hiê ̣n lá dày, dai và mo ̣ng nước hướng thích nghi tốt để có thể sống sót đươ ̣c qua ̣t khô ̣n đinh ̣ kỳ và chúng nhanh chóng phu ̣c hồ i mùa mưa trở la ̣i Đô ̣ ẩ m xung quanh rễ, kiể u đất, đô ̣ pH, sự có mặt các nấ m rễ, tác nhân thu ̣ phấ n và cường đô ̣ ánh sáng là các nhân tố quan tro ̣ng sự hiǹ h thành và phát triể n của quầ n thể lan Hài Trong rừng nguyên sinh lan Hài phân bố đề u các hướng của sườn núi Nhưng các vùng rừng đã bị xuố ng cấ p, lan Hài có khuynh hướng phát triể n ở sườn núi phía Bắ c, Đông Bắ c Tây Bắ c Ngày thường chỉ tìm thấ y lan Hài mọc thành từng đám nhỏ Các nơi số ng tự nhiên bi pha ̣ ́ huỷ bởi người, sự thay đổ i các điều kiêṇ môi trường và viê ̣c thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây sự tuyê ̣t chủng nhanh chóng lan Hài khắ p các vùng của Viê ̣t Nam [5]; [16] 1.1.1.5 Hiê ̣n tra ̣ng lan Hài Viê ̣t Nam Lan Hài là chủng ho ̣ lan có giá tri ̣ thương ma ̣i cao, sưu tầm tìm kiếm nhiều Với sư ̣ hiê ̣n hữu của 20 loài thuô ̣c chi Paphiopedilum, Viêṭ Nam là mô ̣t các quố c gia có nguồ n lan Hài tư ̣ nhiên phong phú Không những phong phú về chủng loa ̣i, Viê ̣t Nam còn có nhiề u loài lan đă ̣c hữu có giá tri thẩ ̣ m mĩ cao đươ ̣c thế giới ưa ch ̣ng [15] Vì tình tra ̣ng thu thâ ̣p và xuấ t khẩ u lan Hài mô ̣t cách ồ a ̣t, không kiể m soát dẫn đế n viê ̣c lan Hài ngày càng hiế m tự nhiên đồ ng thời với tình tra ̣ng môi trường tư ̣ nhiên bi ̣ khai thác ca ̣n kiê ̣t hiê ̣n lan Hài càng biế n mấ t nhanh chóng Dựa nghiên cứu thực điạ gầ n đây, tình tra ̣ng bảo tồ n các loài lan Hài tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ ̣ng về mức đô ̣ đe doa ̣ tuyê ̣t chủng của tổ chức bảo tồ n thiên nhiên Quốc tế (IUCN) đươ ̣c tổ ng kết ở bảng 1.1 9 Bảng 1.1: Các nhóm lan Hài Viêṭ Nam theo thứ ̣ng bảo tồ n của Tổ chức Bảo tồ n Thiên nhiên Quố c tế (IUCN) Tên loài (tiế ngviêṭ ) Tin ̀ h trạng Tên loài (tiế ng Latinh) Đã bi tuyê ṭ chủng ̣ ngoài thiên nhiên P vietnamense Hài Bóng Đang bị tuyêṭ chủng trầ m trọng P delenatii Hài Đỏ P  aspersum P.barbigerum var lokianum P callosum P dianthum P emersonii P gratrixianum P hangiannum P helenae P henryanum P  herrmannii P malipoense var jackii P malipoense P micranthum P purpuratum P tralienianum P appletonianum P concolor P hirsutissimum var chiwuawnum P hirsutissimum var esquirolai P villosun var annamense P  affine P  datalanse P villosum var boxalli Chưa rõ tên go ̣i Hài Lô ̣c Hài Vân Hài Xoắn Hài Hương Lan Hài Đuôi công Hài Hằng Hài Hê Len Hài Henry Hài Herman Hài Jack Hài Giáp Hài Mố c Hồng Hài Tía Hài Trần Liên Hài Cánh Sen Hài Gia Đinh ̣ Hài Tiên biế n di ̣ Hài Tiên Hài Lông Đang bi tuyê ṭ chủng ̣ Sắ p bi tuyê ṭ chủng ̣ Thiế u dẫn liệu Hài Hoà Chưa rõ tên go ̣i Chưa rõ tên go ̣i (Nguồn: Averyanov cs 2004 ) 10 Trên thực tế mức đô ̣ đe doa ̣tuyê ̣t chủng đố i với tất cả các loài lan Hài Viê ̣t Nam bảng đã bi ̣thay đổ i nhiề u thời gian gầ n sự suy giảm nhanh quầ n thể được biế t Trong năm gầ n đây, qua đợt điề u tra thực địa phát hiê ̣n tốc đô ̣ phá huỷ ma ̣nh mẽ diê ̣n rô ̣ng của những khu rừng còn sót la ̣i của Viê ̣t Nam chủ yế u đỉnh núi đá vơi [1]; [16]; [20] Trước tiǹ h hình lan Hài ca ̣n kiê ̣t thiên nhiên, nhiề u chương trình quố c gia về bảo tồ n loài hoa quý đã đươ ̣c triể n khai chủ yế u là thu thâ ̣p, phân loa ̣i, nghiên cứu lồi lan Hài và bảo tờ n môi trường số ng tự nhiên của chúng Một cơng trình hơ ̣p tác q́ c tế về liñ h vực này là mô tả các giố ng lan Hài ở Viê ̣t Nam nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lô ̣c Nguyễn Tiế n Hiê ̣p năm 2004 [1] Một mạng lưới rộng khắp khu bảo tồn thành lập Việt Nam Đặc biệt hàng loạt khu bảo tồn bảo tồn loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P appletonianum - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) bảo tồn loài P callosum - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) bảo tồn P.dalatensis - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cị (Hịa Bình) bảo tồn loài P dianthum, P.micranthum - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) bảo tồn loài P.emersoii, P.hangianum, P malipoense varijackii - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn bảo tồn loài P.gratrixianum - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) bảo tồn loài P helanae 11 - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha bảo tồn lồi P malipoense Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa ho ̣c nghiên cứu và ứng du ̣ng phương pháp nuôi cấ y mô tế bào thực vâ ̣t in vitro nhằ m nhân nhanh số lươ ̣ng lớn lan Hài Đầ u tiên phải kể đế n PGS TS Dương Tấ n Nhựt người đầ u tiên nuôi cấ y thành công lan Hài Hồ ng năm 2005 Sau đó đã có nhiề u nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấ y in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác hài Hằ ng, hài Tam Đảo các phương pháp nuôi cấy mô khác 1.1.2 Đặc điểm thực vật học lan Hài Giáp 1.1.2.1 Nguồ n gố c và sự phân bố Năm 1954, hai nhà thực vật học Trung Quốc là Chen S C Tsi Z H đưa bản mô tả về Hài Giáp (Paphipedilum malipoense) dựa tiêu thực vật Feng K M thu thâ ̣p đươ ̣c năm 1947 gần Malipo, đông nam tỉnh Vân Nam sát biên giới Việt Nam Tiêu gốc lưu giữ phòng Tiêu thực vật thuộc Viện Thực vật Bắc Kinh Tuy đươ ̣c mô tả năm 1954 chỉ đưa vào trồ ng từ năm 1984, từ đó Hài Giáp đươ ̣c xuấ t khỏi Trung Quốc đươ ̣c trồ ng phổ biế n từ năm 1984 Mặc dù có lượng lớn xuất khỏi Trung Quốc thời gian dài sự phân bố tự nhiên nơi sống chúng chưa biết rõ ràng Ban đầu thu từ núi gần thị trấn Malipo, bên cạnh địa điểm thu mẫu chuẩn này, quần thể tự nhiên loài quan sát thấy dọc theo ranh giới nam cao nguyên đá vôi Quý Châu độ cao 800-1100 m, phía tây tỉnh Quảng Tây Rất nhiề u quầ n thể của loài lan này đươ ̣c phát hiêṇ ở Bắc Viê ̣t Nam thông qua các ̣t nghiên cứu thực điạ năm 1994 – 1997 [20]; [42] Lan Hài Giáp phân bố ở phía Bắ c Viê ̣t Nam (Bắc Kạn, Hà Giang, Hịa Bình, Lạng Sơn, Sơn La, Thanh Hoá Tuyên Quang) các khu rừng nguyên sinh ... xuất hiện Việt Nam lan Hài Đỏ, lan Hài Vàng, lan Hài Tía, lan Hài Trắng, lan Hài Vân, lan Hài Vân Duyên, lan Hài Đốm, lan Hài Lông hay lan Hài Râu,…[1] Lan Hài Giáp loài lan xuất hiện số tỉnh...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRỊNH THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP ( Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã... 35 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng hợp chất hữu đến khả nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 36 3.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BA tới khả nhân nhanh chồi lan hài Hài Giáp