Đang tải... (xem toàn văn)
i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MAI HOÀNG OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb ) Nakai) LUẬN VĂN THẠC[.]
i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - MAI HOÀNG OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên – 2016 ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - MAI HOÀNG OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI CÂY SĨI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hải Yến Thái Nguyên - 2016 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu, số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Mai Hoàng Oanh iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hải Yến - Khoa Khoa học sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn ThS Hồ Mạnh Tường cán nghiên cứu thuộc Phịng cơng nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô giáo nhà khoa học trực tiếp giảng dạy truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu Cảm ơn thầy cô, đồng nghiệp bạn bè tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Tơi ln trân trọng biết ơn giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán sở đào tạo thuộc Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập trình thực đề tài Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Mai Hoàng Oanh v MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sói rừng .3 1.1.1 Phân loại học 1.1.2 Thành phần hóa học sói rừng 1.1.3 Tác dụng sinh học sói rừng 1.2 Tổng quan mã vạch DNA 1.2.1 Giới thiệu DNA Barcode 1.2.2 Các đặc điểm trình tự barcode 1.2.3 Một số locus sử dụng phương pháp DNA barcode thực vật 1.2.3.1 Trình tự gen nhân 1.2.3.2 Vùng gen mã hóa ribosome 10 1.2.3.3 Trình tự gen lục lạp 10 1.3 Ứng dụng mã vạch DNA nhận biết dược liệu 14 Chương 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu nghiên cứu, hóa chất thiết bị .18 2.1.1 Vật liệu thực vật 18 2.1.2 Chủng vi khuẩn 18 2.1.3 Hóa chất 18 2.1.4 Thiết bị sử dụng 19 2.1.5 Địa điểm nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái 19 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 20 2.2.2.2 Kiểm tra sản phẩm DNA sau tách chiết 21 2.2.2.3 Phương pháp nhân gen đích kỹ thuật PCR 22 2.2.2.4 Tinh sản phẩm PCR 24 vi 2.2.2.5 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector 25 2.2.2.6 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli phương pháp sốc nhiệt 26 2.2.2.7 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR) 26 2.2.2.8 Tách chiết plasmid từ tế bào E coli 28 2.2.2.9 Phương pháp xác định trình tự gen 29 2.2.2.10 Phương pháp phân tích số liệu 29 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Đặc điểm thực vật học sói rừng thu Lạng Sơn 30 3.2 Phân lập gen từ mẫu sói rừng 32 3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 32 3.2.2 Khuếch đại vùng gen nghiên cứu phản ứng PCR 33 3.2.3 Kết ghép nối gen vào vector tách dòng 35 3.2.4 Kết chọn dòng tế bào mang gen tái tổ hợp 36 3.2.5 Kết tách chiết plasmid tái tổ hợp 37 3.3 Kết xác định trình tự đoạn đoạn gen nghiên cứu 38 3.3.1 Phân tích trình tự đoạn gen rpoC1 39 3.3.2 Phân tích vùng ITS 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh bp Base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleostide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid E coli Escherichia coli IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside UV Ultraviolet LB Luria Bertani ITS-rDNA Internal Transcribed Spacer-rDNA Kb Kilobase OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rDNA Ribosome deoxyribonucleic acid Rnase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate Sol Solution STS Sequence-Tagged Site TAE Tris - Acetic acid - EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TE Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid X-gal X - - brom - - chloro3 - indolyl - β - D - galactosidase viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 111 Bảng 2.1 Các máy móc thiết bị sử dụng thí nghiệm 19 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch đệm rửa 200 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm tách 200 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 22 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen ITS 23 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen rpoC1 23 Bảng 2.7 Trình tự mồi dùng phản ứng PCR 23 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng 25 Bảng 2.9.Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang 26 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng colony - PCR 27 Bảng 2.11 Chu trình nhiệt phản ứng colony-PCR 27 Bảng 2.12 Thành phần hóa chất tách plasmid 28 Bảng 3.1 Các vị trí sai khác trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 41 Bảng 3.2 Hệ số tương đồng hệ số sai khác trình tự nucleotide gen rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng thu lạng sơn 41 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng gen ITS mẫu sói rừng nghiên cứu với số trình tự ngân hàng gen giới (NCBI) 44 Bảng 3.4 Các vị trí sai khác trình tự nucleotide đoạn gen ITS 46 Bảng 3.5 Hệ số tương đồng hệ số sai khác trình tự nucleotide gen ITS phân lập từ mẫu sói rừng thu lạng sơn 46 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh sói rừng tự nhiên Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 25 Hình 3.1 Mẫu Sói rừng thu thập Lạng sơn 30 Hình 3.2 Các phận sói rừng 31 Hình 3.3 Kết điện di DNA tổng số Sói rừng gel agarose 1% 32 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 sản phẩm nhân gen ITS từ cặp mồi đặc hiệu 34 Hình 3.5 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 35 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc sử dụng mồi rpoC1 mồi ITS 37 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm tách chiết plasmid 38 Hình 3.8 Trình tự nucleotide đoạn rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng hai trình tự mang mã số EF380352 KP256024 Genbank 40 Hình 3.9 Sơ đồ hình so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 mẫu sói rừng với mẫu EF380352 KP256024 Genbank 42 Hình 3.10 Trình tự nucleotide đoạn gen ITS phân lập từ mẫu sói rừng SR trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 ngân hàng gen quốc tế 45 Hình 3.11 Sơ đồ hình so sánh mức độ tương đồng đoạn vùng gen ITS mẫu sói rừng với mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 ngân hàng gen quốc tế ………………………………………………… 46 MỞ ĐẦU Theo đánh giá Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh ung thư gánh nặng kinh tế - xã hội quốc gia, trung bình năm có thêm 10 - 16 triệu người mắc bệnh Đây bệnh nguy hiểm, có tỷ lệ tử vong cao Mặc dù có nhiều phương pháp điều trị đại nhằm loại bỏ khối u phương pháp xạ trị, hóa trị, liệu pháp hormon, liệu pháp sinh học, điều trị trúng đích ghép tế bào gốc để ức chế tiêu diệt tế bào ung thư Ngoài ra, người bệnh phải sử dụng thuốc nhằm nâng cao thể trạng, khắc phục hậu khối u gây ra, kéo dài thời gian sống cho người bệnh Tuy nhiên, phương pháp tốn mặt kinh tế [3], [9] Ngày việc sử dụng loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền hay hợp chất tổng hợp từ chất có nguồn gốc thiên nhiên có xu hướng ngày tăng chiếm vị trí quan trọng y học, chúng có khả chữa trị bệnh cao, an tồn tác dụng phụ Ở Việt Nam tính đến 2005 xác định 3948 loài thực vật nấm, 52 loài tảo biển, 408 loài động vật 75 loại khống vật có cơng dụng làm thuốc Đa số thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu quần xã rừng, có gần 10 % số thuốc trồng [1] Kết cho thấy nguồn dược liệu nước ta phong phú đa dạng chủng loại Các nghiên cứu khoa học gần cho thấy Sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) dược liệu có khả chữa trị bệnh cảm mạo, viêm phổi, viêm ruột thừa, đau lưng số bệnh ung thư ung thư tụy, ung thư dày, ung thư gan, ung thư trực tràng, ung thư cuống họng… [2], [12], [21] Tuy nhiên việc nghiên cứu sử dụng thuốc chưa quan tâm mức làm cho khu vực phân bố loài bị thu hẹp trữ lượng loài suy giảm cách nghiêm trọng 2 Hiện thị trường nguồn nguyên liệu thảo dược dùng sản xuất dược phẩm có tiềm lớn tiếp tục phát triển Tuy nhiên với phát triển đó, giả mạo nguyên liệu thảo dược thuốc trở thành vấn đề toàn cầu Các nguyên liệu thảo dược thay loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi DNA barcode phương pháp phục vụ định danh lồi xác, nhanh chóng, tự động hóa cách sử dụng vùng DNA chuẩn hay gọi thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) Việc xác định lồi DNA thị có hiệu cao việc phân biệt loài thực vật Xuất phát từ nguyên nhân lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái xác định số trình tự gen phân loại sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai)” Mục tiêu nghiên cứu - Mô tả số đặc điểm hình thái sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai - Xác định số trình tự gen phân loại sói rừng Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm thực vật học sói rừng - Nghiên cứu thơng tin trình tự gen rpoC1 ITS Nhân tách dòng hai đoạn gen rpoC1 ITS - Xác định, phân tích đa dạng trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 ITS phân lập từ mẫu sói rừng thu từ Lạng Sơn 3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sói rừng 1.1.1 Phân loại học Tên khoa học: Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai Phân loại: Giới: Plantae Bộ: Chloranthales Họ: Chloranthaceae Chi: Sarcandra Loài: S glabra Ngồi cịn có tên khác như: Chloranthus brachystachys Blum, Chlorathus glaber (Thunb.) Makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thuộc họ Hoa sói Chloranthaceae Ở Việt Nam sói rừng cịn có số tên gọi khác sói lãng, sói nhẵn, cửu tiết kim túc lan, cửu tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà, tiếp cốt liên, thảo sách hồ, tiếp cốt mộc [5] Cây Sói rừng phân bố nhiều nước: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam Malaysia Ở Việt Nam, mọc hoang vùng Hình 1.1 Hình ảnh cấy Sói rừng núi đất, bìa rừng ven đồi ẩm tự nhiên nhiều nơi như: Cao Bằng, Lạng Sơn, Hịa Bình đến Kon Tum, Lâm Đồng Thu hái toàn vào mùa hạ, dùng tươi hay phơi khô râm Rễ thu hái quanh năm, rửa cắt đoạn, phơi khô râm dùng tươi [5] 1.1.2 Thành phần hóa học sói rừng Trong thành phần Sói rừng có chứa số hợp chất có hoạt tính sinh học cao như: flavonoid, coumarin , sesquiterpen, saponin,… Các este, phenol, đường, flavon, cyanogens, axit fumaric, …[7] Các nhà khoa học Trung Quốc, Mỹ, Nhật nghiên cứu thuốc cho thấy thành phần hóa học chủ yếu Sói rừng sesquiterpen lactose, curmarin, flavonoid [17], [19], [46] Những nghiên cứu gần thành phần hóa học xác định Sói rừng có chứa số hợp chất thuộc nhóm flavonoid chloranoside A; Tertorigenin 7-glucoside có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp tiêu hóa, hợp chất isofraxidin, vị thuốc thuốc trị bệnh vảy nến Trung Quốc [4], [6] Bên cạnh đó, bột Sói rừng cịn có hoạt tính kháng gốc tự do, có tác dụng ức chế phát triển khối u, hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Các kết thử nghiệm in vitro cho thấy dịch chiết sói rừng có tác dụng ức chế phát triển dòng tế bào ung thư người Hep-A549, HCT-29, BGC-823 [2], [12] 1.1.3 Tác dụng sinh học sói rừng Theo Đơng y, Sói rừng có vị đắng cay, tính ấm, có tác dụng hoạt huyết giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc Trong dân gian, rễ ngâm rượu, uống chữa đau tức ngực Lá sắc uống trị bệnh lao, giã đắp chữa rắn cắn, ngâm rượu xoa bóp chữa vết thương, mụn nhọt, phong thấp, đau nhức xương khớp [4], [6] Ở Trung Quốc, dùng để chữa số bệnh ung thư: ung thư tụy, dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo, kinh nguyệt không đều, hoa dùng để ướp trà [4], [7] 5 Ngồi dịch chiết từ sói rừng có tác dụng chống viêm đạt hiệu 97,6% mà không gây tác dụng phụ, đặc biệt phần có tác dụng kháng khuẩn mạnh Các nhà y học cổ truyền Trung Quốc bào chế Sói rừng thành dạng thuốc tiêm bắp để trị bệnh viêm đa khớp dạng thấp cách hiệu [6], [12] Theo tài liệu thu thập được, nhà khoa học cịn tìm hiểu tác dụng lên hệ miễn dịch sói rừng Nghiên cứu tác dụng kháng u, Zhong L cộng nghiên cứu ảnh hưởng Sói rừng phịng chữa bệnh giảm tiểu cầu sau hóa trị liệu Kết thí nghiệm chứng minh S.glabra có tác dụng rõ rệt điều trị giảm tiểu cầu ngăn ngừa chứng giảm tiểu cầu gây 5-FU Wen J cộng (2003) sử dụng dịch chiết Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai tiêm cho chuột cấy ghép tế bào ung thư gan Hep-A22 đồng thời quan sát tác dụng dịch chiết phát triển in vitro dòng tế bào Kết cho thấy dịch chiết làm giảm phát triển tế bào ung thư Hep-A22 in vitro in vivo [47] Trong nghiên cứu khác Zhenzhen Z., chất SGP-2, polysaccharide chiết xuất từ Sacandra glabra ức chế tăng sinh di tế bào ung thư MG-63 in vitro [55] Các kết nghiên cứu tạo tiền đề xây dựng sở khoa học cho nghiên cứu chống ung thư thành phần có hoạt tính sinh học sói rừng [29] Kang cộng [28] nghiên cứu tác dụng ức chế khối u dịch chiết S glabra gây chết tế bào theo chương trình dịng tế bào gây ung thư biểu mô mũi - họng người Kết cho thấy dịch chiết Sói rừng ngăn cản phát triển khối u invivo Yuan K., Zhu J.X cộng nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dịch chiết n - butanol Sói rừng Kết cho thấy đường kính vịng vơ khuẩn theo mm hợp chất kaempferol-3-O-beta-D-glucoronid, isofraxidin-7-O-betaD-glucopyranosid, kaempferol ghi lại có thứ tự 14,67±0,08; 11,14±1,06; 8,26 ±1,26 [52] Xu X.D., Hu X.R cộng [49] nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn Sói rừng Kết thực nghiệm cho thấy phân đoạn chloroform EtOAc dịch chiết EtOH tồn Sói rừng, có tác dụng kháng khuẩn mạnh Đồng thời với nghiên cứu ức chế phát triển tế bào u, nhà khoa học cịn tìm hiểu tác dụng lên hệ miễn dịch sói rừng Theo tác giả He R (2009) Sun W (2015) tác dụng dịch chiết Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai lên hệ miễn dịch chuột dịch chiết có liên quan tới cân tế bào T, làm tăng phần trăm diệt tự nhiên hiệu bảo vệ theo kiểu miễn dịch chuột bị ung thư thông qua cải thiện tỉ lệ số lượng tế bào miễn dịch, tăng trọng lượng lách, tuyến ức tăng số lượng bạch cầu [23], [38] Trong thí nghiệm tác giả Từ Quốc Lượng cộng (2005), dịch chiết phân đoạn sói rừng làm tăng trọng lượng lách, tuyến ức số lượng tiểu cầu chuột xuất huyết giảm tiểu cầu Nghiên cứu ảnh hưởng sói rừng điều trị giảm tiểu cầu hóa trị liệu [39] Trên bệnh nhân ung thư biểu mô mũi họng, điều trị tia xạ kết hợp uống cao Sói rừng làm giảm số tác dụng phụ tia xạ so với tia xạ đơn [20] Có nhiều thuốc dân gian sử dụng Sói rừng làm thuốc điều trị viêm khớp, phong thấp Ngồi Sói rừng cịn có mặt thành phần số thực phẩm chức Flamasol, Hồng Thấp Linh,viên Gout Tâm Bình, Tiêu Khiết Thanh, hỗ trợ điều trị cho người bị viêm đau khớp, thấp khớp, viêm khớp dạng thấp, thối hóa khớp, giúp phòng ngừa giảm triệu cứng viêm đường hô hấp 7 1.2 Tổng quan mã vạch DNA 1.2.1 Giới thiệu DNA Barcode Để phân loại xác định lồi động, thực vật có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau, hầu hết phương pháp dựa nguyên tắc lồi có chung nguồn gốc, có tính chất giống nhau, gần tính chất giống nhiều Trong phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời xây dựng hệ thống phân loại sinh vật nói chung thực vật nói riêng tương đối đầy đủ toàn diện Tuy nhiên phương pháp phân loại chủ yếu dựa vào khác biệt hình thái quan thể thực vật, đặc biệt quan sinh sản (hoa) nên gặp nhiều khó khăn cần xác định mẫu vật giai đoạn phát triển (chưa hoa), mẫu thực vật có đặc điểm giống thích nghi với điều kiện mơi trường khó nhận biết có nhiều điểm tương đồng bậc phân loại thấp loài loài [24], mẫu thực vật cần giám định khơng cịn ngun vẹn, hình thái bên ngồi Ngồi ra, phương pháp phân loại hình thái thường thực chuyên gia hình thái học, việc phân loại tốn nhiều thời gian công sức [22] Do vậy, việc định danh dựa quan sát hình thái kinh nghiệm dân gian hỗ trợ xác sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử đại Năm 2003, khái niệm mã vạch DNA Paul Heber, nhà nghiên cứu Đại học Guelph, Ontario đưa lần đầu tiên, nhằm giúp nhận diện mẫu thực vật [31] Mã vạch DNA phương pháp định danh mà sử dụng đoạn DNA chuẩn ngắn (400 - 800 bp) nằm genome sinh vật nghiên cứu nhằm xác định sinh vật thuộc lồi Kỹ thuật DNA mã vạch giúp nhà phân loại học công tác phân loại xác định loài Nâng cao lực kiểm soát, hiểu biết tận dụng đa dạng sinh học Ngồi ra, kỹ thuật có triển vọng nghiên cứu ứng dụng khoa học sống, khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất kiểm soát chất lượng thực phẩm Phương pháp vơ có ý nghĩa trường hợp mẫu vật sinh học cần giám định loài qua xử lý, chế biến dạng chế phẩm thuốc hay thực phẩm qua chế biến… Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcode cho tất sinh vật nhân chuẩn sống hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life ) thành lập vào tháng năm 2004, gồm 120 tổ chức từ 45 quốc gia Với mục tiêu ban đầu xây dựng thư viện trực tuyến trình tự barcode cho tất lồi chưa biết đến, làm tiêu chuẩn phân loại cho mẫu DNA Với hỗ trợ CBOL, DNA barcode ngày phát triển trở thành phương pháp phân loại định danh loài [33] Trong bối cảnh kinh tế phát triển nhanh hậu tác động đến động vật, thực vật quốc gia khác nhau, xác định loài sử dụng phương pháp nhanh cần thiết để đánh giá đa dạng sinh học khu vực nhằm bảo vệ loài đặc hữu quý nguy cấp Tuy nhiên cần lưu ý DNA barcode khơng thể thay phân loại cơng cụ hữu ích để tạo thơng tin đơn vị phân loại chưa biết Hiện nay, giới, kỹ thuật sử dụng chủ yếu nhà phân loại học nhiều nhà khoa học lĩnh vực khác khảo cổ học, công nghiệp sinh học chế biến thực phẩm… 1.2.2 Các đặc điểm trình tự barcode Đặc điểm quan trọng DNA barcode phải phổ biến đặc hiệu biến dị dễ dàng sử dụng Điều có nghĩa đoạn gen sử dụng barcode nên thích hợp cho nhiều đơn vị phân loại, có biến đổi loài ổn định bảo thủ cao bên lồi biến đổi khơng đáng kể Do đó, DNA barcode lý tưởng đoạn DNA có trình tự nucleotide ngắn, bắt cặp với cặp mồi thiết kế đặc hiệu để dễ dàng khuếch đại PCR Với động vật, hệ gen ty thể với đặc tính di truyền theo dịng mẹ, tốc độ đột biến cao chủ yếu đột biến thay vùng mã hoá, vùng điều khiển không tái tổ hợp coi công cụ hữu hiệu nghiên cứu tìm nguồn gốc lồi Q trình tìm kiếm thị DNA chung cho lồi thực vật gặp nhiều khó khăn Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp thị DNA hệ gen nhân, vùng DNA nằm gen hay gọi ITS (Internal Transcribed Spacer) thường sử dụng làm DNA thị số nghiên cứu [15], [35], [41] Trong vòng năm qua, nhiều vùng gen nghiên cứu đề xuất thị DNA cho thực vật [16], [27], [41] Tuy nhiên chưa có thị DNA đa phần nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [16], [30], [34] Mặc dù vậy, nhà nghiên cứu tới quan điểm thống cần không mà nhiều vùng DNA thị để định danh loài thực vật [16], [27], [39] Theo Taberlet P cộng (2007), hệ thống mã vạch DNA lý tưởng phải đáp ứng yêu cầu sau đây: - Thứ nhất, đoạn DNA thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt loài phải không khác mức cá thể loài - Thứ hai, hệ thống định danh DNA phải chuẩn hóa, với vùng DNA sử dụng cho nhóm phân loại khác - Thứ ba, đoạn DNA thị cần chứa đủ thơng tin phát sinh lồi để dễ dàng định danh lồi vào nhóm phân loại (chi, họ,…) - Thứ tư, có khả áp dụng với mẫu vật thơ, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực phản ứng khuếch đại đọc trình tự DNA [39] 1.2.3 Một số locus sử dụng phương pháp DNA barcode thực vật 1.2.3.1 Trình tự gen nhân Các trình tự barcode nhân từ DNA hệ gen bố mẹ dự kiến cung cấp nhiều thơng tin lồi cần xác định Tuy nhiên khó khăn việc khuếch đại PCR từ gen nhân gen nhân chủ yếu đơn gen 10 có gen thấp, đặc biệt từ suy thoái chất lượng DNA genome khả phân biệt loài bảo toàn gen chức lý hạn chế số lượng gen nhân thử nghiệm xác định loài phương pháp DNA barcode [43], [50] 1.2.3.2 Vùng gen mã hóa ribosome Gen DNA ribosome (rDNA) hệ thống đa gen mã hóa phần RNA ribosome Các gen rDNA mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt loài gần gũi Trong tế bào, rDNA xếp đơn vị lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S xen trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm hai bên sườn vùng 5,8S Vùng mã hóa ba gen rDNA bảo tồn cao hai vùng ITS Nhìn chung đơn vị rDNA lặp lại hàng nghìn lần xếp tập trung vùng lớn nhiễm sắc thể Một tính đáng ý rDNA đơn vị hệ thống đa gen khơng tiến hố độc lập, thay vào tất đơn vị tiến hố cách phối hợp nhờ mà rDNA đạt mức ổn định cao loài khác biệt loài khác Hiện tại, nrITS vùng ITS gen nhân xem công cụ hữu ích để đánh giá phát sinh lồi thực vật động vật phổ biến tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ biến đổi cao hạn chế chức [13] Một số nghiên cứu gần sinh sản hữu tính sinh sản vơ tính cho thấy số mức độ biến đổi số trình tự ITS1 ITS2 nhiều nguyên nhân lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao hình thành gen giả gen chức dẫn đến thay đổi Trên sở nrDNA sử dụng để phân định xác hiệu thực vật loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác (một năm, lâu năm, cạn, nước) nguồn gốc tiến hóa khác [43], [50], [51] 1.2.3.3 Trình tự gen lục lạp Hệ gen lục lạp thực vật gồm phân tử DNA mạch vịng có kích thước 120 - 160 kb chia làm hai đơn đơn lớn (large singlecopy region) đơn nhỏ (small single-copy region) Hai 11 phân cách hai chuỗi lặp lại đảo (IRa IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb Hệ gen lục lạp chứa tất gen rRNA (4 gen thực vật bậc cao), gen tRNA (35 gen) gen khác mã hóa cho protein tổng hợp lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho tồn chúng [8] Bảng 1.1 Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp [14], [26], [ 44] Trình tự 5’→3’ Mồi a-f a-r matK 1F matK 1R matK matK 2F matK 2R rpoB rpoB rpoB rpoB rpoB rpoC1 rpoC1 rpoC1 rpoC1 rpoC1 ycf5 ycf5 ycf5 (ccsA) ycf5 ycf5 trnH2 trnH psbAF psbA trnH(GUG) psb A trnL-c trnL-d trnL-e trnL-F trnL-f trnL-g trnL-h Kí hiệu: → mồi xuôi; ← rbcL ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC GAACTCGTCGGATGGAGTG GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA TAAACGATCCTCTCATTCACGA AAGTGCATTGTTGGAACTGG ATGCAACGTCAAGCAGTTCC CCGTATGTGAAAAGAAGTATA GATCCCAGCATCACAATTCC GTGGATACACTTCTTGATAATGG GGCAAAGAGGGAAGATTTCG TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC CCATAAGCATATCTTGAGTTGG → ← → ← → ← → → ← ← → → ← ← GGATTATTAGTCACTCGTTGG ACTTTAGAGCATATATTAACTC ACTTACGTGCATCATTAACCA CCCAATACCATCATACTTAC → → ← CGCGCATGGTGGATTCACAATCC GTTATGCATGAAAGTAATGCTC ACTGCCTTGATCCACTTGGC CGAAGCTCCATCTACAAATGG → ← → ← → ← → ← → ← CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG3’ GGGCAATCCTGAGCCAA CCATTGAGTCTCTGCACCTATC mồi ngược ... phân loại sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb. ) Nakai)? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Mô tả số đặc điểm hình thái sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb. ) Nakai - Xác định số trình tự gen phân loại sói rừng. .. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - MAI HOÀNG OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb. ) Nakai) Chuyên... Sarcandra Glabra (Thunb. ) Nakai Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm thực vật học sói rừng - Nghiên cứu thơng tin trình tự gen rpoC1 ITS Nhân tách dòng hai đoạn gen rpoC1 ITS - Xác định, phân