Luận văn thạc sĩ khoa học nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thúy NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ[.]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thúy NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thúy NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS HỒ HỮU THỌ TS MAI THỊ ĐÀM LINH Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Hồ Hữu Thọ - Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học Viện Quân Y người thầy tạo điều kiện, trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS Mai Thị Đàm Linh – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN người hướng dẫn, bảo tận tình, truyền đạt kiến thức giúp đỡ suốt thời gian học tập thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn đồng nghiệp Phịng Cơng nghệ gen Di truyền tế bào giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Tơi xin trân trọng cảm ơn tồn thể thầy, cô giáo Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, 29 tháng 11 năm 2019 Học viên Lê Thị Thúy MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT 10 ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1.1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh sốt mò 1.1.1 Dịch tễ học 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng 1.1.3 Điều trị 1.1.4 Phòng bệnh sốt mò 10 1.2 Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi .10 1.2.1 Đặc điểm sinh học .10 1.2.2 Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò 14 1.2.3 Cơ chế gây bệnh sốt mò 18 1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh sốt mò 22 1.3.1 Phương pháp huyết học 22 1.3.2 Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR 24 1.3.3 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) 24 CHƯƠNG : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .34 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 34 2.2 Thiết kế mồi probe cho phản ứng RPA .34 2.2 Tổng hợp chứng dương nhân tạo 35 2.3 Kiểm tra khả khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa nhóm nghiên cứu thiết kế 35 2.4 Tối ưu quy trình RPA thiết lập 37 2.4.1 Tối ưu điều kiện phản ứng 37 2.4.2 Tối ưu thành phần phản ứng 38 2.5 Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại) 39 2.6 Đánh giá ngưỡng phát 40 2.7 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu so sánh với kit thương mại có thị trường .41 2.7.1 Đánh giá độ nhạy 41 2.7.2 Đánh giá độ đặc hiệu .41 CHƯƠNG : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 3.1 Thiết kế mồi probe đặc hiệu gen đích 47-kDa 43 3.2 Kiểm tra khả khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa 44 3.3 Kết tối ưu quy trình RPA 45 3.4 Quy trình RPA phát O tsutsugamushi 52 3.5 Ngưỡng phát quy trình RPA 55 3.6 Đánh giá so sánh độ nhạy với kit thương mại có thị trường (PrimerDesign) 57 3.7 Đánh giá so sánh độ đặc hiệu với kit thương mại có thị trường .59 KẾT LUẬN .64 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 84 Phụ lục 1: Danh sách mẫu âm tính với Orientia tsutsugamushi .84 Phụ lục 2: Kết tách chiết chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đốn phân biệt sốt mị 85 Phụ lục 3: Chứng nhận kiểm định chất lượng kit khuếch đại đẳng nhiệt phát O tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) nhóm nghiên cứu chế tạo 86 Phụ lục 4: Hình ảnh kit khuếch đại đẳng nhiệt phát O tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) nhóm nghiên cứu chế tạo .87 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bản đồ phân bố bệnh sốt mò giới [141] Hình 1.2 Hình ảnh nốt loét mò đốt Hình 1.3 Hình ảnh vi khuẩn Orientia tsutsugamushi xâm nhập ký sinh tế bào nội mô mạch máu .11 Hình 1.4 Hình ảnh Leptotrombidium (Lep.) deliense 16 Hình 1.5 Mơ hình trình hấp thu vận chuyển nội bào O tsutsugamushi [62] 21 Hình 1.6 Chu trình phản ứng RPA [53] 29 Hình 1.7 Sơ đồ mô tả cấu trúc exo probe [53] 31 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 34 Hình 2.2: Trình tự gen đích 47-kDa tổng hợp nhân tạo 35 Hình 2.3: Hình ảnh thiết bị Genie® II sử dụng nghiên cứu 37 Hình 3.1 Kết so sánh mức độ tương đồng trình tự gen 47-kDa O tsutsugamushi Đơng Nam Á với mồi xuôi (A), probe (B) mồi ngược (C) nghiên cứu nhóm nghiên cứu nghiên cứu công bố Chao cs [38] 44 Hình 3.2 Kết kiểm tra khả khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa trình mồi probe nghiên cứu 45 Hình 3.3 Kết tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát O tsutsugamushi 47 Hình 3.4 Kết tối ưu nồng độ mồi phản ứng RPA phát O tsutsugamushi 49 Hình 3.5 Kết tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O tsutsugamushi 50 Hình 3.6 Kết tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O tsutsugamushi 51 Hình 3.7 Kết đánh giá ngưỡng phát quy trình RPA phát O tsutsugamushi 55 Hình 3.8 Kết đánh giá ngưỡng phát quy trình realtime PCR (PrimerDesign) phát O tsutsugamushi .56 Hình 3.9 Đánh giá độ nhạy quy trình RPA quy trình realtime PCR mẫu dương tính giả định với O tsutsugamushi (tp1-tp10) .59 Hình 3.10 Kết đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR (PrimerDesign) mẫu âm tính chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đốn phân biệt sốt mị 60 Hình 3.11 Kết đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA khuếch đại DNA Orientia tsutsugamushi mẫu âm tính chủng vi sinh vật thường gặp chẩn đoán phân biệt 62 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Dịch sốt mò số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99] Bảng 1.2: Tóm tắt thành phần, nồng độ vai trò thành phần phản ứng RPA 26 Bảng 1.3: Bảng so sánh số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt .32 Bảng 2.1: Nồng độ thành phần ban đầu sử dụng phản ứng RPA .36 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng realtime PCR 39 Bảng 2.3: Chu trình nhiệt 40 Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát O tsutsugamushi 43 Bảng 3.2: Bảng kết tối ưu thành phần phản ứng RPA .52 Bảng 3.3: Chuẩn bị master mix 52 Bảng 3.4: So sánh thời gian phát tương ứng nồng độ quy trình phát O tsutsugamushi .57 Bảng 3.5: So sánh độ đặc hiệu quy trình 62 DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ bp : Base pair DNA : Deoxyribonucleic acid kb : Kilo base LAMP : Loop-mediated isothermal amplification NAT : Nucleic acid test PCR : Polymerase chain reaction RNA : Ribonucleic acid RPA : Recombinase polymerase amplification ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt mò vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng khu vực châu ÁThái Bình Dương, có Việt Nam Theo thống kê của Cục Y tế dự phòng, bệnh sốt mị có mặt hầu hết 24 tỉnh phía Bắc chiếm 38,51% số bệnh nhân sốt nhập viện, không rõ nguyên Bệnh tác nhân Orientia tsutsugamushi gây nên; trung gian truyền bệnh ấu trùng mò Leptotrombidium Nếu không điều trị sớm với loại kháng sinh phù hợp dẫn đến biến chứng nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong cao Trong đó, triệu chứng bệnh sốt mị thường khơng đặc hiệu lẫn với nhiều loại mầm bệnh khác với phác đồ điều trị khác (sốt xuyết huyết, sốt xoắn khuẩn vàng da …) Để bắt đầu phác đồ điều trị phù hợp kịp thời, việc chẩn đốn sớm nhiễm O tsutsugamushi đóng vai trò định Hiện nay, phương pháp sinh học phân tử PCR/realtime PCR phát O tsutsugamushi nghiên cứu phát triển nhằm cải thiện hạn chế độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp huyết học phát kháng thể đặc hiệu có chẩn đốn sốt mị Tuy nhiên, để ứng dụng phương pháp vào chẩn đoán đòi hỏi phải đào tạo vận hành máy luân nhiệt PCR, điều kiện với nguồn lực hạn chế việc trang bị, bảo dưỡng, chỉnh máy luân nhiệt đảm bảo hoạt động ổn định khó khăn Để khắc phục giới hạn phương pháp PCR/realtime PCR truyền thống kỷ nguyên khuếch đại acid nucleic dùng chẩn đoán phân tử thực địa, nghiên cứu gần có xu hướng chuyển sang phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) phương pháp khuếch đại acid nuclecic đẳng nhiệt với nhiều ưu điểm bật Khác với PCR truyền thống, công nghệ sử dụng hỗn hợp recombinase sinh vật tiền nhân (Escherichia coli RecA recombinase T4 UvsX protein) giúp mồi gắn đặc hiệu vào gen đích enzyme DNA polymerase với hoạt tính thay sợi cho phép tổng hợp liên tục DNA mà khơng cần biến tính sợi kép DNA nhiệt độ cao, không cần đến thiết bị luân nhiệt thiết kế tinh vi với giá thành cao Phản ứng RPA tiến hành khoảng nhiệt độ từ 24°C đến 45°C, so với kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt khác NASBA, SDA hay LAMP điều kiện nhiệt độ RPA dễ dàng thiết lập đảm bảo Bên cạnh đó, thời gian để phát tín hiệu từ đơn phân tử đích ngắn nhiều so với phương pháp đẳng nhiệt khác PCR Những ưu điểm gợi ý RPA lựa chọn tối ưu để áp dụng phát acid nucleic chẩn đoán bệnh thực địa khu vực hạn chế nguồn lực Hiện nay, giới có nghiên cứu thiết lập quy trình RPA nhằm phát nhanh xác tác nhân gây bệnh sốt mị -O tsutsugamushi Các quy trình thiết lập cịn nhiều hạn chế độ nhạy, đặc biệt đánh giá mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu thấp khu vực Đơng Nam Á Qua phân tích tính đa hình nhận thấy trình tự mồi xi probe thiết kế nghiên cứu cơng bố có đến 03 vị trí chưa bổ sung hồn tồn với trình tự gen đích 47-kDa hầu hết chủng O tsutsugamushi khu vực Đông Nam Á, dẫn đến hiệu suất chẩn đốn bệnh sốt mị bị hạn chế áp dụng Việt Nam nước khu vực Với lý thực tiễn trên, nhóm nghiên cứu tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) phát tác nhân gây bệnh sốt mò” với hai mục tiêu chính: 1) Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt RPA cho phép phát nhanh xác O tsutsugamushi với độ nhạy, độ đặc hiệu cao 2) Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu quy trình RPA thiết lập CHƯƠNG : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh sốt mò Bệnh sốt mò hay phát ban, biết đến với tên gọi bệnh tsutsugamushi, gây trực khuẩn gram âm Orientia tsutsugamushi ký sinh nội bào bắt buộc [112, 135] Khoảng đến 14 ngày sau bị cắn tác nhân mang bệnh – mò Leptotrombidium, người bệnh bắt đầu có biểu nhiễm trùng triệu chứng giống cúm sốt, phát ban, sẩn vết cắn, đau đầu, đau cơ, ho, hạch, buồn nôn, nôn đau bụng [74, 75, 101] Sốt đau đầu đặc điểm phổ biến bệnh nhân sốt phát ban, chiếm tỷ lệ 95% đến 100% trường hợp [74] 1.1.1 Dịch tễ học  Dịch tễ học bệnh sốt mò giới Bệnh sốt mò lưu hành rộng giới, gặp khu vực Châu Á - Thái Bình Dương, Đơng Nam Á [82], phía bắc Liên bang Nga, phía bắc bang Queensland tới phía đơng Australia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan, Sri Lanka, Philippines [98, 124, 141] Trước đây, bệnh xác định vùng dịch tễ tam giác lưu hành Orientia tsutsugamushi từ bắc Nhật Bản đến phía đơng Liên bang Nga, phía bắc nước Úc phía tây Pakistan, Afghanistan [75, 99, 138] Tuy nhiên, báo cáo gần bệnh sốt mò cho thấy bệnh vượt giới hạn “Tam giác Tsutsugamushi” phát Chile, Peru, bán đảo Ả rập, số khu vực Châu Phi [92, 139] Hình 1.1 Bản đồ phân bố bệnh sốt mò giới [141] Bệnh vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng bệnh truyền nhiễm bị lãng quên Ước tính năm có khoảng triệu ca nhiễm bệnh sốt mị tỷ người giới có nguy mắc bệnh hàng năm Trong năm vừa qua, bệnh sốt mò gây dịch nhiều nước với số mắc tử vong cao nhiều khu vực [77, 99, 107] Bảng 1.1: Dịch sốt mò số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99] TT Quốc gia Khu vực Thời gian Thái Lan Chiang Mai Ấn Độ Bishnipur-Manipur Ấn Độ Himachal Pradesh (northern India) Số ca tử Số ca mắc vong 2007 65 2007 38 2008 Ấn Độ Pondicherry 2008 50 Ấn Độ Meghalaya 2010 24 Ấn Độ Sikkim 2011 63 TT Quốc gia Khu vực Thời gian Ấn Độ Chennai Úc Northern Queensland Số ca tử Số ca mắc vong 2011 52 2011 124 Trung Quốc Guangdong 2012 29 10 Ấn Độ Meghalaya 2012 90 11 Ấn Độ Rajasthan 2012 42 12 Trung Quốc Jiangsu 2013 271 13 Ấn Độ Puducherry 2013 28 14 Ấn Độ Northern India 2013-2014 228 15 Quần đảo Western Province 2014 Solomon 16 Bu-tan Thimphu 2014 12 17 Ấn Độ Uttarakhand 2014 69 18 Ấn Độ Andhra-pradesh 2014 176 19 Ấn Độ Rajasthan 2014 66 14 20 Nepal Kathmandu 2015 23 21 Nepal Chaitwan 2016 264  Phân bố bệnh sốt mò Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh sốt mò phát từ đầu kỷ XX Một nghiên cứu thực miền Nam miền Bắc năm 1964 cho thấy bệnh ghi nhận lưu hành 11 tỉnh, thành Tuy nhiên, thời gian dài, bệnh phát việc sử dụng rộng rãi chloramphenicol tetracycline thực hành y khoa thiếu xét nghiệm chẩn đoán bệnh đặc hiệu cần thiết [108, 25] Sau năm 1990, hàng nghìn người mắc hàng trăm người chết bệnh sốt mò ghi nhận tỉnh Sơn La, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Quảng Trị, Bình Phước, [11] Sau thời gian dài bệnh tạm lắng, gần bệnh lẻ tẻ xuất nhiều nơi có xu hướng ngày tăng cao Tại Bắc Giang từ năm 1998-2000 ghi nhận 71 trường hợp mắc bệnh sốt mò Năm 2011, số bệnh nhân đến bệnh viện điều trị sốt mò 18 trường hợp từ huyện: Lạng Giang, Lục Nam, Yên Dũng, Tân Yên Lục Ngạn Trong có bệnh nhân nam (33,3%) 12 bệnh nhân nữ (66,7%) [20] Theo kết điều tra Nguyễn Duy Quyền (2002), đảo Thanh Lân Cô Tô (Quảng Ninh) tỷ lệ người dân bị mắc bệnh sốt mò 0,14/1.000 dân [24] Năm 2000-2002, Bệnh viện ng Bí (Quảng Ninh) có 449 bệnh nhân sốt mị vào điều trị Bệnh nhân sốt mò phát rải rác quanh năm, tập trung nhiều từ tháng 5-10 Các dấu hiệu lâm sàng: Có nốt mị đốt (94,2%); có sốt (100%); có hạch (98,7%) phát ban (52,2%) Điều trị chloramphenicol tetracyclin sau 5-7 ngày hết sốt [18] Trong thời gian từ 2001-2003, Viện Y học lâm sàng bệnh nhiệt đới thống kê 251 ca bệnh sốt mị (trong nam chiếm 50,6% nữ chiếm 49,4%) từ 225 xã thuộc 125 huyện 24 tỉnh thuộc Bắc Bắc Trung nhập viện điều trị, chiếm 35,3% số trường hợp sốt không rõ nguyên nhân [5, 25] Từ năm 1998 đến năm 2005, Bệnh viện 110 điều trị 168 ca sốt mò Từ năm 2010 đến nay, bệnh tiếp tục lưu hành nhiều vùng trung du rừng núi Việt Nam, đặc biệt số ca báo cáo nhiều tỉnh Khánh Hịa, Phú n, Bình Định, Quảng Nam, Quảng Bình, Quảng Ninh, Hịa Bình, n Bái, Lai Châu, Điện Biên, với số ca bệnh lên đến hàng trăm ca năm [7, 13, 21] Theo tác giả Đoàn Trọng Tuyên cộng (2008-2010), kết điều tra sơ huyết học xác định số yếu tố nguy phơi nhiễm Orientia tsutsugamushi cộng đồng dân cư khu vực nghiên cứu thuộc khu vực Nam Trung Tây Nguyên cho thấy: Tỷ lệ người mang kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi khu vực Khánh Hòa 21,04%, Gia Lai 10,58% (huyện Chư Prông 13,99% huyện Krông Pa 7,14%), Kon Tum 5,21% [11] Từ 2008 đến 2010, miền Trung Tây nguyên có 471 bệnh nhân sốt mị, M’ Drăk (Đăk Lăk) có bệnh nhân, cịn lại 469 bệnh nhân địa bàn tỉnh Khánh Hòa, chủ yếu tập trung Ninh Hòa (55,01%), Thành Phố Nha Trang (27,93%), Diên Khánh (7,46%), Cam Lâm (3,62%), Vạn Ninh (2,99%) [11] Tại tỉnh Yên Bái, năm từ 2014 - 2015 số bệnh nhân sốt mị tăng đột biến, có 397 bệnh nhân (năm 2014: 136 trường hợp, năm 2015: 261 trường hợp) đến điều trị sốt mị Trong số có ca tử vong Các bệnh nhân đến từ huyện: Văn Chấn 99 bệnh nhân (24,9%); Trạm Tấu 53 bệnh nhân (13,3%); Mù Cang Chải 157 bệnh nhân (39,5%); thị xã Nghĩa Lộ 57 bệnh nhân (14,3%); Văn Yên 30 bệnh nhân (7,6%); huyện Trấn Yên bệnh nhân (0,4%) Bệnh nhân gặp nữ (61,25%) nhiều nam (38,75%) Bệnh gặp tất lứa tuổi bệnh nhân độ tuổi lao động nhiều (51%) Bệnh nhân làm nhiều nghề khác gặp nhiều làm ruộng, nương rẫy (51,3%) [13, 22] Các thông tin cho thấy phạm vi phân bố bệnh sốt mị Việt Nam có xu hướng ngày mở rộng, bệnh xuất rải rác nhiều khu vực với số bệnh nhân ngày tăng lên 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng Ca bệnh lâm sàng: Ủ bệnh, trung bình - 12 ngày (6 đến 21 ngày) [1] Lúc đầu nơi ấu trùng mị đốt có nốt nước kích thước khoảng - 5mm, không đau, bệnh nhân thường không ý; sau thời gian ủ bệnh, bệnh phát với triệu chứng sau: Sốt ≥ 38 - 400C, liên tục, kéo dài 15 - 20 ngày, có trường hợp sốt tới 27 ngày khơng điều trị; Có rét run - ngày đầu, kèm theo sốt thường có nhức đầu nặng, đau mỏi Nốt lt đặc trưng (điển hình sốt mị): Thường vùng da mềm, ẩm, phận sinh dục, vùng hậu mơn, bẹn, nách, cổ…, đơi vị trí bất ngờ vành tai, rốn, mi mắt (dễ nhầm với lẹo mắt); đặc điểm nốt loét: Không đau, khơng ngứa; người bệnh thường có nốt, có nhiều hơn; nốt hình trịn bầu dục đường kính từ 1mm đến 20mm; nốt ban đầu phát triển dần thành dịch đục sẩn đỏ, sau - ngày vỡ thành nốt có vẩy nâu nhạt đen tùy vào vùng da mềm hay cứng độ non hay già nốt loét; sau thời gian, vẩy bong để lộ nốt loét lõm đáy nông, hồng nhạt, không mủ, không tiết dịch, bờ viền hồng đỏ thâm tùy theo bệnh phát triển hay lui; từ hết sốt nốt loét liền dần; nốt loét gặp 65 - 80% trường hợp [1, 15, 26] Hình 1.2 Hình ảnh nốt loét mò đốt Hạch ban dát sẩn: Hạch khu vực nốt loét thường sưng đau, không đỏ, di động, xuất với sốt sau - ngày, điểm tìm nốt loét; Hạch toàn thân sưng đau nhẹ hơn, trừ ca nặng Ban dát sẩn mọc cuối tuần thứ đầu tuần thứ hai, mọc khắp người, trừ lòng bàn tay bàn chân, tồn vài đến tuần, thưa so với sốt Dengue cổ điển, khoảng 35 - 70% số bệnh nhân xuất ban, tùy thời điểm bệnh nhân khám; đơi có đốm xuất huyết (dưới 10%) Trong ngày đầu, da niêm mạc xung huyết đa số trường hợp (khoảng 88%), khác với sốt rét thương hàn [67, 113, 26] Ở bệnh nhân nặng hay gặp tiếng tim mờ, huyết áp thấp, mạch chậm so với nhiệt độ, chảy máu cam, xuất huyết tiêu hóa, viêm phế quản, viêm phổi khơng điển hình [2, 143] Ngồi ra, sốt mị cịn ẩn thể khơng điển hình (khơng có nốt lt) Nếu điều trị kháng sinh thích hợp, cắt sốt nhanh Nếu can thiệp muộn khơng hiệu quả, có biến chứng viêm tim, sốc nhiễm khuẩn, viêm phổi, suy hô hấp, viêm não - màng não dẫn đến tử vong [6, 102] Tỷ lệ tử vong Orientia tsutsugamushi khác nước, vùng, phụ thuộc vào chủng lưu hành địa phương Ở Việt Nam, tỷ lệ tử vong khoảng 1%, Indonesia Đài Loan 5-20%, Malaysia 15 - 20%, Nhật Bản 20 - 60% [132, 26] 1.1.3 Điều trị Kháng sinh đặc hiệu điều trị bệnh sốt mò chloramphenicol, doxycycline tetracycline Các bệnh nhân điều trị kháng sinh đặc hiệu hết sốt sau ngày Tuy nhiên, kháng sinh khơng có tác dụng diệt vi khuẩn mà có tác dụng hãm khuẩn nên vi khuẩn Orientia tsutsugamushi sống tồn hạch bạch huyết, hệ võng nội mô nhiều ngày, nhiều tháng dễ tái phát bệnh [12, 25, 26] - Doxycycline thuốc lựa chọn hàng đầu Liều thường dùng viên 100mg uống hai lần ngày, kéo dài ngày - Tetracycline sử dụng liều 2g/24 chia lần, cách - Chloramphenicol sử dụng đường uống đường tiêm, liều khuyến cáo 2g ngày chia lần, đến hết sốt 2-3 ngày - Các thuốc macrolide có tác dụng với sốt mị, tốt azithromycin thuốc định cho trẻ tuổi phụ nữ mang thai [40] 1.1.4 Phòng bệnh sốt mò Thực biện pháp tuyền truyền giáo dục sức khỏe kết hợp vệ sinh phòng bệnh Điều tra phát ổ dịch địa bàn nghi ngờ có người để xử lý (bắt thú nhỏ gặm nhấm, bắt mị, phân loại, phân lập O tsutsugamushi , tìm kháng thể, phát bệnh nhân) Tại ổ dịch xác định nghi ngờ: - Biện pháp ngăn ngừa mò đốt: + Tránh ngồi nằm phơi quần áo đặt balô bãi cỏ, gần bờ bụi, gốc cây; phát nương làm rẫy, hành quân dã ngoại, trinh sát vào rừng cần mang giầy tất, chít ống quần + Tối ưu tẩm quần áo thuốc diệt mò (permethrine benzyl benzoat) xoa chân, tay, cổ thuốc xua mò (diethyltoluamid, DEET, ) - Diệt mị mơi trường: phun tồn lưu vào đất ẩm, bờ bụi cỏ cao 20 cm quanh nhà nơi dâm mát thuốc diazinon, fenthion, malathion, lindane, dieldrin, chlordan - Diệt chuột theo mùa, ý rắc thuốc diệt mò trước - Phát quang thảm thực vật quanh nhà chọn lọc đám thực vật có nhiều ấu trùng mò (đảo mò) 1.2 Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi 1.2.1 Đặc điểm sinh học Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay gọi bệnh sốt mị Việt Nam Orientia tsutsugamushi (cịn có tên Rickettsia orientalis, Rickettsia tsutsugamushi) lồi nhóm Rickettsia thuộc Giới Bacteria, Ngành Proteobacteria, Lớp Alphaproteobacteria, Bộ Rickettsiales, Họ Rickettsiaceae, Giống 10 ... đề tài ? ?Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) phát tác nhân gây bệnh sốt mò? ?? với hai mục tiêu chính: 1) Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thúy NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT... dụng phát acid nucleic chẩn đoán bệnh thực địa khu vực hạn chế nguồn lực Hiện nay, giới có nghiên cứu thiết lập quy trình RPA nhằm phát nhanh xác tác nhân gây bệnh sốt mị -O tsutsugamushi Các quy