TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ
LỜI CẢM ƠN
Hà Nội, 29 tháng 11 năm 2019 Học viên
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Bệnh sốt mò
Hình 1.1. Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141]
Bảng 1.1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99]
Hình 1.2. Hình ảnh nốt loét do mò đốt
Hình 1.5. Mô hình về quá trình hấp thu và vận chuyển nội bào của O. tsutsugamushi [62]
1.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh sốt mò
1.3.1. Phương pháp huyết thanh học
1.3.2. Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR
1.3.3. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA)
Thành phần phản ứng RPA
Bảng 1.2: Tóm tắt các thành phần, nồng độ và vai trò các thành phần trong phản ứng RPA
Hình 1.6. Chu trình phản ứng RPA [53]
Hình 1.7. Sơ đồ mô tả cấu trúc của exo probe [53]
Bảng 1.3: Bảng so sánh một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt
CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu
2.2. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA
2.2. Tổng hợp chứng dương nhân tạo
Hình 2.2: Trình tự gen đích 47-kDa tổng hợp nhân tạo
2.3. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa do nhóm nghiên cứu thiết kế
Bảng 2.1: Nồng độ và thành phần ban đầu sử dụng trong phản ứng RPA
Hình 2.3: Hình ảnh thiết bị Genie® II sử dụng trong nghiên cứu
2.4. Tối ưu quy trình RPA đã thiết lập
2.5. Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại)
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng realtime PCR
2.6. Đánh giá ngưỡng phát hiện
2.7. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa
Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát hiện O. tsutsugamushi
Hình 3.1. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen 47-kDa của
3.2. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình mồi và probe trong nghiên cứu
3.3. Kết quả tối ưu quy trình RPA
Hình 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi
Hình 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi
Hình 3.6. Kết quả tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi
Bảng 3.2: Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA
Bảng 3.3: Chuẩn bị master mix
3.5. Ngưỡng phát hiện quy trình RPA
Hình 3.7. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi
Hình 3.8. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình realtime PCR (PrimerDesign) phát hiện O. tsutsugamushi
Bảng 3.4: So sánh thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình phát hiện O. tsutsugamushi
3.6. Đánh giá và so sánh độ nhạy với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường (PrimerDesign)
Hình 3.9. Đánh giá độ nhạy quy trình RPA và quy trình realtime PCR trên các mẫu dương tính giả định với O. tsutsugamushi (tp1-tp10)
3.7. Đánh giá và so sánh độ đặc hiệu với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường
Hình 3.10. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR (PrimerDesign) trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò
Hình 3.11. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA khuếch đại DNA Orientia tsutsugamushi trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Phụ lục 2: Kết quả tách chiết các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò
nghiên cứu chế tạo