ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Luận văn Thạc sĩ được em thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm, để có được những kết quả này em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS Vũ Nguyên Thành và Cô PGS.TS Bùi Thị Việt Hà những người thầy ln tận tình hướng dẫn, bảo, tạo điều kiện giúp em thực hiện luận văn Để có được tảng kiến thức khoa học tốt, phục vụ nghiên cứu này em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nợi ln tận tình truyền đạt kiến thức, bảo cho em suốt thời gian sinh viên học viên cao học Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị cán bộ tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệp, hỗ trợ kỹ thuật suốt thời gian qua Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và bạn bè, những người động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em yên tâm học tập và nghiên cứu khoa học Hà Nội, ngày 11 tháng 12 năm 2019 Học viên Lê Thị Quyên i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu rượu truyền thống 1.1.1 Men rượu 1.1.2 Các giai đoạn lên men rượu 1.2 Giới thiệu họ Mucoraceae 1.3 Tình hình nghiên cứu rượu truyền thống Việt Nam 11 1.4 Giới thiệu sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) 12 1.5 Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS phân tích các hợp chất tạo hương đồ uống 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng 16 2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc 16 2.2.1 Hóa chất 16 2.2.2 Dụng cụ trang thiết bị, máy móc 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp phân lập 17 2.3.2 Làm giữ giống 17 2.3.3 Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào 18 2.3.4 Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men 18 2.3.5 Phương pháp tinh chế DNA 18 2.3.6 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting 19 2.3.7 Phương pháp điện di 20 2.3.8 Nhuộm gel đọc kết quả 20 2.3.9 Phương pháp phân loại nấm dựa vào đọc trình tự rDNA 20 ii 2.3.10 Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ chủng mốc 21 2.3.11 Kiểm tra khả chịu nhiệt chủng mốc đại diện 23 2.3.12 Kiểm tra thủy phân tinh bột số nhóm mốc có đường 23 2.3.13 Lên men rượu từ chủng mốc men chọn lọc 24 2.3.14 Đo độ cồn sôi kế 25 2.3.15 Phân tích phổ hương mẫu rượu gạo chưng cất máy sắc ký khí kết nối khối phổ GCMS 26 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men 28 3.2 Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào 28 3.3 Phân nhóm kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm đại diện dựa vào phân tích trình tự rDNA 34 3.4 Phân tích hoạt lực enzyme amylase DNS 39 3.5 Kiểm tra khả chịu nhiệt các chủng mốc đại diện 43 3.6 Kết quả sự thủy phân tinh bợt mợt số nhóm mốc có đường 45 3.7 Kết quả lên men rượu từ chủng nấm mốc và nấm men thuần 47 3.8.Phân nhóm mẫu rượu dựa kết quả các hợp chất bay mẫu rượu thu thập và các mẫu sử dụng chủng thuần 49 KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC 59 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á Bảng 2.1 Tỷ lệ bổ sung giống ở mẫu lên men 25 Bảng 3.1 Kết quả phân nhóm chủng fingerprinting và đọc trình tự các chủng đại diện 36 Bảng 3.2 Hoạt lực enzyme amylase các chủng mốc thuần 39 Bảng 3.3 Kích cỡ khuẩn lạc môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ 44 Bảng 3.4 Kết quả đo độ cồn dịch lên men rượu từ chủng thuần 15 mẫu bánh men 47 Bảng 3.5 Các nhóm hợp chất xuất hiện mẫu rượu 50 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mợt quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam Hình 1.2 Quá trình thủy phân tinh bợt bởi các enzyme amylase .6 Hình 1.3 Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo GC-MS 13 Hình 1.5 Sơ đồ tách chiết hợp chất bay HS-SPME GCMS 14 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc tế bào nhóm nấm đại diện .32 Hình 3.2 Phổ băng DNA fingerprinting 35 Hình 3.3 Hoạt lực enzyme amylase các chủng nấm mốc (IU/ml) 42 Hình 3.4 Đường kính khuẩn lạc nấm mốc môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ .45 Hình 3.5 Kết quả thủy phân tinh bợt môi trường có đường các chủng mốc 46 Hình 3.6 Các nhóm rượu khác từ 32 mẫu rượu……………………… …….51 v DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT °C: độ celsius CNTP: Công nghiệp Thực phẩm dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate h: hour (giờ) ITS: Internal transcribed spacer PCR: Polymerase chain reaction rDNA: ribosomal DNA rpm: round per minute (vòng/phút) TTVSVCN: Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp HS-SPME GCMS: headspace-solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometer vi MỞ ĐẦU Rượu truyền thống loại đồ uống có cồn, xuất hiện từ rất lâu đời và được sử dùng rộng rãi nhân dân Chúng thường được sản xuất theo quy mô hộ gia đình và có hương vị đa dạng từng vùng miền rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định) Để tạo nên sự khác biệt đó có nhiều yếu tố nguyên liệu, cách thức nấu, và đặc biệt là sự biến đổi hệ vi sinh vật bánh men Việc sử dụng bánh men với phức hệ vi sinh quá đa dạng thường gây khó khăn quá trình kiểm soát chất lượng sản phẩm rượu, việc nghiên cứu sâu chủng giống sẽ rất cần thiết Các loại rượu thế giới cho thấy loài Saccharomyces cerevisiae đóng vai trò chủ đạo lên men rượu, nhiên nấm mốc khác biệt hơn, với loại rượu lồi nấm mốc là khác nói tới rượu Sake Nhật Bản biết đến lồi Aspergillus oryzae, nhắc tới rượu Hong Qu ở Trung Quốc biết đến loài Monascus purpureus, thế ở Việt Nam chưa có nghiên cứu loài nấm mốc nào đóng vai trò chủ đạo lên men rượu truyền thống Việt Nam Trong lên men rượu truyền thống Việt Nam hầu hết các nhóm chủng được tìm thấy thuộc họ Mucoraceae có khả thủy phân chất giàu tinh bột thành đường chưa được nghiên cứu kỹ đặc tính liên quan tới đường hóa Các nghiên cứu trước liên quan tới men rượu chủ yếu tính đa dạng vi sinh vật bánh men và lựa chọn các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả lên men rượu tốt để làm bánh men Vì vậy, luận văn này được thực hiện nhằm đánh giá đặc tính thủy phân tinh bột các chủng nấm mốc thuộc họ Mucoraceae phân lập từ bánh men rượu từ đó biết được chủng nào đóng vai trò quan trọng giai đoạn đường hóa và bước đầu thử nghiệm sử dụng chủng mốc thuần kết hợp với chủng nấm men thuần làm giống khởi động nhằm mục đích so sánh phổ hương rượu với các dòng rượu truyền thống để từ đó biết được loài nấm mốc nào đóng vai trò quan trọng lên men rượu truyền thống Việt Nam Việc sử dụng chủng thuần phương pháp phân tích sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) để nghiên cứu hương rượu là những tính luận văn Để thực hiện mục tiêu đề tài nêu, các nội dung chính sau được thực hiện: - Phân lập vi nấm từ men rượu truyền thống Việt Nam - Phân nhóm vi nấm PCR-fingerprinting và định tên chủng đại diện giải trình tự rDNA - Đánh giá hoạt tính amylase nấm mốc thuộc họ Mucoraceae - Đánh giá khả thủy phân tinh bột các chủng mốc thuộc họ Mucoraceae các điều kiện nhiệt độ khác - Đánh giá khả thủy phân tinh bột Mucoraceae môi trường đường - Thử nghiệm sử dụng chủng thuần khiết làm giống khởi động, phân tích các hợp chất bay dịch chưng cất sau lên men và so sánh với các sản phẩm rượu truyền thống khác CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu rượu truyền thống Đồ uống có cồn bia, rượu những sản phẩm lên men phổ biến và đóng vai trò quan trọng đời sống tinh thần và văn hóa người Ở Việt Nam, rượu gạo có từ rất lâu đời, cho đến thức uống phổ biến chiếm 80% tổng số loại đồ uống có cồn Tùy tḥc vào từng địa phương mà thành phần quy trình sản xuất rượu có sự khác nhau, đó rượu được sản xuất có tên địa phương khác rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Kiên Lao (tỉnh Nam Định), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định), rượu Gò Đen (tỉnh Long An) Tuy nhiên, phương thức sản xuất chung dựa vào trình biến đởi hóa sinh hệ vi sinh vật men rượu [8] 1.1.1 Men rượu Việc chuẩn bị sử dụng men rượu là nguồn cung cấp vi sinh vật sản xuất rượu gạo rất quan trọng Thông thường, giống khởi động cho lên men rượu gồm thành phần vi sinh bản là: nấm mốc, nấm men vi khuẩn Trong đó, nhóm nấm mốc chủ yếu sinh enzyme amylase để đường hóa tinh bột thành các phân tử đường khử glucose, maltose, hay n-dextrin dài Sau đó, lượng đường này được nấm men chuyển hóa thành ethanol chất lượng sản phẩm cuối phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động vi sinh vật Một những cách tiếp cận để cải thiện sản xuất rượu thiết lập các điều kiện tối ưu cho quá trình đường hóa và lên men đồng thời với nuôi cấy hỗn hợp vi sinh vật sinh enzyme thủy phân tinh bột lên men ethanol [8] Như được liệt kê Bảng 1.1, loài mốc các loại giống khởi động truyền thống ở Châu Á Rhizopus spp Mucor spp Nhóm nấm men phổ biến Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp., Candida spp., còn loài giả nấm men phổ biến là Saccharomycopsis fibuligera Bảng 1 Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á Sản phẩm Đất nước Bakhar Ấn Độ Mốc men Mucor spp., Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae Mucor spp., Rhizopus spp.,, Candida spp., Bubud Philippines Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis spp Chu Lookpang Men rượu Murcha Trung Quốc Thái Lan Việt Nam Nepal Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae Mucor spp., Chlamydomucor oryzae, Candida spp., Saccharomyces cerevisiae Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis fibuligera Rhizopus spp., Mucor spp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis fibuligera Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., A.niger, Penicillium Nurock Hàn Quốc spp., Mucor spp., Hansenula anomala, Pichia anomala, Saccharom yces cerevisiae Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium Ragi Indonesia spp., Candida spp., Saccharom yces cerevisiae, Saccharomycopsis fibuligera , Hansenula spp., Rhodotorula spp Tapai Malaysia Rhizopus spp., Saccharomycopsis fibuligera Các thành phần để làm viên men thường bột gạo, bột sắn hoặc kết hợp cả bột gạo bột sắn- Các loại bột đó có thể được trộn với một số loại thảo mộc, những thành phần bổ sung này được cho có vai trị việc ức chế sự sinh trưởng vi sinh vật tạp nhiễm Tỷ lệ giữa bột nghiền với các loại thảo mộc thường 14:1 theo khối lượng Sau đó, nước được thêm vào để tạo độ ẩm tương đối cho khối bột 55-60%, trộn với bột men từ những mẻ trước Những viên men được nặn hình trịn với đường kính cm, dày cm Các khay bánh men được ủ điều kiện nhiệt đợ phịng 28-32 ºC 2-5 ngày và được hong khơ bởi gió hoặc ánh sáng mặt trời [8] Bột gạo Bột men Bột thuốc bắc Nước Khối bột với 50-60% hàm ẩm Nặn viên men tròn ủ 2-5 ngày Hong khơ Hình 1 Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam 1.1.2 Các giai đoạn lên men rượu Có giai đoạn lên men sản xuất rượu đó là: Giai đoạn đường hóa và giai đoạn lên men rượu 1.1.2.1 Giai đoạn 1- Giai đoạn đường hóa Gạo sau được nấu chín sẽ được tãi khay, vải sạch để ng̣i đến nhiệt đợ 30-35°C rắc bợt bánh men vào với tỉ lệ bột bánh men so với gạo 1-5% theo khối lượng Trộn bột bánh men ủ khoảng ngày để vi sinh vật sinh amylase thủy phân tinh bột thành đường điều kiện hiếu khí [8] 1.1.2.1.1 Đặc điểm enzyme amylase Amylase có thể được tổng hợp từ một số loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn xạ khuẩn; Tuy nhiên, nấm mốc được biết đến nhiều nhất tính phở biến ổn định enzyme Có loại amylase là α-amylases, β-amylases và γ-amylase, (αglucosidase) loại cắt các vị trí khác Hình 1.2 minh họa vị trí thủy phân liên kết loại enzyme Hình Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase a α- amylase α-amylases có khả cắt liên kết α,1-4 glycoside ở phía mạch amylose và amylopectin Enzyme này được tìm thấy ở rất nhiều loài vi sinh vật, nó cắt ở vị trí ngẫu nhiên dọc chuỗi tinh bợt, cuối tạo glucose, maltose, ndextrin α-amylases có xu hướng hoạt động nhanh β-amylase bởi có thể thủy phân nhiều vị trí chất Loại enzyme này được tìm thấy nấm Ascomycetes Basidiomycetes, vi khuẩn Bacillus, nước bọt tuyến tụy ở người [22] Quá trình thủy phân tinh bợt bởi α-amylases là quá trình đa giai đoạn: Giai đoạn (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ mợt số phân tử chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin bị dịch hóa nhanh) [2] Giai đoạn (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp ở giai đoạn bị thủy phân tiếp tạo tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng α-amylase, amylose bị phân giải nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose [2] Giai đoạn 3: Các polyglucose bị phân cắt tiếp tục tạo nên mạch polyglucose ngắn dần bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose maltose và glucose Tóm lại, tác dụng α-amylase, tinh bợt có thể chủn thành maltotetrose, maltose, glucose dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường αamylase thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine Khả dextrin hóa cao α-amylase tính chất đặc trưng Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.[2] b β-amylase β-amylase hay exoamylase có khả cắt liên kết α,1-4 glycoside và α,1-6 glycoside Chúng thủy phân glucose ở phía ngồi mạch amylose amylopectin [23] β-amylase mợt enzyme ngoại bào Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử các nhánh ngoài cùng chất β-amylase phân cắt liên kết α-1,4glucoside gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide lại dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi β-dextrin [2] c γ-amylase γ-amylase cắt liên kết α(1-6) α(1-4) glycoside ở đầu không khử amylose amylopectin, tạo glucose Đa số Enzyme có hoạt lực cao nhất ở vùng PH 3,5-5,5 nhiệt đợ 50ºC Nó bền với acid α-amylase bền rượu, aceton [22] 1.1.1.2.2 Đặc điểm vi nấm giai đoạn đường hóa Q trình đường hóa tinh bợt sẽ cho maltose, glucose để sản x́t ethanol có nguồn gốc từ q trình lên men Thủy phân tinh bợt phương pháp enzyme có nhiều ưu điểm so với phương pháp hóa học, hoạt động điều kiện pH nhiệt độ vừa phải, ngăn ngừa ăn mòn thiết bị và các bước trung hòa tiếp theo Enzyme có tính đặc hiệu chất, loại bỏ sự hình thành sản phẩm phụ không mong muốn thường được xuất hiện trình thủy phân axit [26] 1.1.2.2 Giai đoạn 2- Giai đoạn lên men rượu Nhóm nấm men thường phân lập được từ bánh men là Saccharomyces cerevisiae, Pichia anomala, Candida tropicalis đó Saccharomyces cerevisiae được cho là đóng vai trò chính, phát triển điều kiện oxy, lên men chuyển hóa đường thành ethanol Ethanol sản phẩm ở giai đoạn này, nồng đợ cao dịch lên men sẽ ức chế màng sinh chất, thay đởi tính bán thấm tế bào nấm men vi sinh vật khác Thực tế sản xuất cho thấy giai đoạn ủ cho lên men phụ thuộc vào thời tiết, vào những ngày nóng, giai đoạn ủ thường ngắn Ví dụ ở vùng Đồng Sơng Cửu Long ở miền Nam Việt Nam, nhiệt đợ trung bình 30-33ºC, thời gian ủ cho giai đoạn 2-3 ngày, giai đoạn 3-4 ngày [8] + Lên men rắn là phương pháp thường được sử dụng ở vùng núi cao Nguyên liệu cho sản xuất rượu ở những vùng này thường ngô sắn Ngô sắn sau quá trình đường hóa trở nên mềm, sau đó được thêm nước Quá trình lên men diễn 5-7 ngày và sau đó đem chưng cất [3] + Lên men lỏng thường được sử dụng ở làng nghề đồng Gạo, sau quá trình đường hóa trở nên mền được bổ sung nước theo tỉ lệ 1:1 Lên men tiếp 3-5 ngày Vào mùa hè nhiệt độ cao thời gian lên men thường ngắn mùa đơng [3] Sản phẩm sau lên men rượu gạo Đối với rượu không chưng cất, dịch lên men sau kết thúc giai đoạn sẽ được lọc lấy dịch chứa glucose, ethanol, chất hòa tan khác, với những loại rượu không chưng cất độ cồn khoảng 7-10% (v/v), rượu sẽ không bảo quản được lâu Để giải quyết vấn đề này, người sản xuất sẽ tăng hàm lượng cồn cách hoặc bổ sung đường vào sau giai đoạn hoặc bổ sung cồn vào sau giai đoạn 2, vừa đáp ứng được nhu cầu khách hang vừa kéo dài tuổi thọ cho sản phẩm [3] Đối với rượu chưng cất, sử dụng thiết bị chưng cất có ngun lý hoạt đợng hình dưới, gồm phần bản là: khoang đun, hệ thống làm mát, khoang chứa rượu chưng cất Thơng thường, mẫu rượu đầu có nồng đợ cồn cao có thể lên đến 65% (v/v) sau giai đoạn chưng cất đầu tiên, khoảng 25-30% (v/v) cho mẫu rượu sau [3] Hình Sơ đờ tóm tắt quy trình lên men rượu 1.2 Giới thiệu họ Mucoraceae Họ Mucoraceae là họ nấm thuộc bộ Mucorales, đặc trưng bởi hệ sợi không vách ngăn Một số chi có thể kể đến bao gồm Absidia, Apophysomyces, Mucor, Rhizomucor, và Rhizopus.Theo ước tính năm 2008, họ này bao gồm 25 chi và 129 loài [15] Sau là một số loài thuộc chi Rhizopus và Mucor thường xuất hiện ở bánh men rượu a Rhizopus oryzae Rhizopus oryzae là thành viên chi Rhizopus, thuộc họ Mucoraceae Hệ thống phân loại Rhizopus oryzae không đơn giản Những nghiên cứu gần Mucorales dựa trình tự ITS đưa các tên loài đồng nghĩa sau: Amylomyces rouxii, Rhizopus achlamydosporus, R arrhizus, R boreas, R delemar, R chiuniang, R javanicus, R oryzae, R maydis, R niveus, R peka, R tonkinensis [26] Mặc dù nhiều chủng nấm mốc bánh men có khả thủy phân tinh bợt gạo Rhizopus oryzae (hay Amylomyces rouxii được biết đến chủng điển hình nhất, được mơ tả đầu tiên bởi Calmette năm 1982) Ông coi chủng này đóng vai trò quan trọng quá trình thủy phân tinh bột gạo Khi sử dụng nấm mốc thuần chủng này nấm men thương phẩm ơng có thể thu 340 g cồn đặc từ 1000 g gạo thay 180 g sử dụng bánh men Ngoài ra, nấm này được sử dụng nghiên cứu tạo bánh men để sản xuất rượu gạo từ gạo nếp cẩm [1] Bên cạnh đó, R oryzae là loài phổ biến chiếm ưu thế được phát hiện ở Yao Qu, ở mợt số Hồng Qu Nó được tìm thấy ở một số giống khởi động khác với khả sinh amylase mạnh, đóng góp lớn cho sản xuất rượu [23] Nghiên cứu trước còn R oryzae có thể tạo hợp chất dễ bay quá trình lên men, chẳng hạn ethanol, 2-methyl-1butanol 3- methyl-1-butanol [4] b Rhizopus microsporus Rhizopus microsporus nhóm nấm tḥc chi Rhizopus, họ Mucoraceae phở biến thứ hai phân lập từ bánh men [6] Các enzyme thủy phân từ lồi Rhizopus hoạt đợng tối ưu điều kiện pH 4.0-5.5 Nhóm Rhizopus microsporus có khả chịu nhiệt độ cao, chủng Rhizopus microsporus var rhizopodiformis có thể sinh trưởng ở 50°C sinh amylase tối ưu ở 45°C [7] Rhizopus microsporus var chinensis CICIM-CU F0088 cho thấy khả phát triển ở 40°C, tiết amylase ở nhiệt độ cao Rhizopus oryzae [17] Các chủng R microsporus có thể sinh đợc tố rhizoxins, bản thân khơng tạo mà được tạo bởi vi khuẩn Burkholderia chúng sống bên tế bào nấm Một nghiên cứu vi khuẩn này từng được tìm thấy ở chủng Rhizopus microsporus CBS 111563, được phân lập từ sufu Một lượng đáng kể rhizoxins được phát hiện sản phẩm cuối [7] Tuy nhiên chưa biết rõ Rhizopus microsporus từ bánh men có độc tố không c Mucor indicus Các chủng Mucor indicus thuộc nhóm này thường khuẩn lạc có màu vàng đậm đặc trưng, có nhiệt độ tăng trưởng tối đa 42ºC Bào tử có màu vàng nhạt, sợi liên tục phân nhánh, với nhánh dài Túi bào tử có màu vàng đến nâu, đường kính lên tới 75 µm, với màng khác Cuống gần hình cầu, cao tới 40 µm Bào tử có vách trơn, gần cầu tới elip, và có đường kính 4-5 µm Có nhiều Chlamydospores, đặc biệt 10 ánh sáng Bào tử tiếp hợp zygospores có màu đen, hình cầu, có đường kính lên tới 100 µm [14] M indicus có khả sinh ethanol từ nhiều nguồn đường khác glucose, mannose, fructose, hay galactose Chúng có khả lên men xylose thành ethanol điều kiện hiếu khí hoặc vi hiếu khí Sản lượng ethanol sau lên men từ xylose xấp xỉ lượng ethanol Pichia stipites lên men (Pichia stipites được biết đến loài sản xuất ethanol tốt nhất từ xylose) Tuy nhiên, nhiều chủng nấm khơng có khả lên men đường sucrose, M indicus không thể thay thế S cerevisiae để lên men ethanol từ chất chứa sucrose [14] M indicus loài nấm mốc lên men ethanol hiệu quả có thể sinh ethanol 5% sinh trưởng môi trường chứa glucose Bên cạnh đó, một nghiên cứu khác hoạt lực amylase M indicus dường rất thấp hoặc không có sinh trưởng môi trường gạo [14] d Mucor circinelloides Trong số nấm tḥc chi Mucor tìm thấy bánh men, Mucor circinelloides lồi phở biến Tuy nhiên khả thủy phân tinh bột chúng [12] Chúng lồi dị hình giới tính có thể phát triển giống nấm mốc nấm men Bên cạnh khả thủy phân tinh bợt, chúng cịn có khả thủy phân cellulose [14] 1.3 Tình hình nghiên cứu rượu truyền thống Việt Nam Các nghiên cứu lên men rượu truyền thống Việt Nam có thể được phân loại thành hai nhóm chính: (i) tính đa dạng vi sinh vật bánh men (ii) lựa chọn chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả lên men rượu tốt để làm bánh men, cải tiến quy trình [25] Hệ vi sinh bánh men được nghiên cứu khá rõ, gam bánh men chứa 103-106 CFU mốc, 103-107 CFU men, và 103-106 CFU vi khuẩn lactic Bánh men chứa hệ vi sinh vật tương đối ổn định, bao gồm các loài mốc Rhizopus microsporus, Mucor indicus, Mucor circinelloides, loài giả men Saccharomycopsis fibuligera, loài nấm men Hyphopichia burtonii, Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis, 11 Pichia anomala, Candida tropicalis, Pichia ranongensis, Clavispora lusitaniae, Pediococcus pentosaceus, loài vi khuẩn Lactbacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Weissella confusa, Weissella paramesenteroides Nó được kết luận hệ vi sinh bánh men tương tự ragi và các dạng men Châu Á khác Tuy nhiên, để có mợt cái nhìn rõ đặc tính thủy phân tinh bột các nhóm chủng vi nấm xuất hiện phổ biến bánh men rượu Việt Nam chưa có nghiên cứu nào được thực hiện trước đó Bên cạnh đó, chọn các chủng nấm tốt để tạo men rượu cải tiến từ chủng thuần rượu sau chưng cất được đánh giá cảm quan mà ít có phân tích phổ hương rõ sắc kí khí [9] nên nghiên cứu này sẽ phân tích các hợp chất bay các mẫu rượu sử dụng chủng thuần và so sánh với các sản phẩm rượu truyền gạo truyền thống 1.4 Phân tích hợp chất bay 1.4.1 Giới thiệu sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) Sắc kí khí kết nối khối phở (GCMS) gồm phần GC MS, đó GC (Gas Chromatography) loại sắc kí có pha động là khí mang, thường khí trơ heli, nitơ hay hydro, còn pha tĩnh là một lớp dịch mỏng hoặc polymer bên cột Mẫu được chạy qua cột bởi dịng khí mang Các thành phần mẫu được tách qua cợt mợt chu trình nhiệt đợ từ thấp tới cao Cịn MS (Mass Spectrometer) detector khối phổ cho GC, chất khí sau qua cột sẽ sang MS bị bắn phá thành mảnh có khối lượng khác nhau, chất khí có mợt danh sách mảnh khác nhau, dựa vào thơng tin khối lượng điện tích m/z, sau đó chất này được so sánh với thư viện phở để biết tên chất [11] Sắc kí khí kết nối khối phổ một phương pháp phân tích kết hợp cả đặc trưng sắc kí khí khối phở để định tính hợp chất mẫu GC có thể tách hợp chất bay và bán bay khơng thể định danh chúng MS có thể cung cấp thông tin cấu trúc chi tiết cho hầu hết hợp chất và định danh chúng MS lại không tách được chúng khỏi mẫu [16] Sơ đồ cấu tạo được trình bày ở hình 1.4 12 ... HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học. .. Sinh Vật Học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Luận văn Thạc sĩ được em thực hiện... thực hiện luận văn Để có được tảng kiến thức khoa học tốt, phục vụ nghiên cứu này em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc