Khóa luận tốt nghiệp đại học nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài mốc hồng (paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG (PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2015-2019 Thái Nguyên, năm 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM DƯƠNG THỊ THU HỒI Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG (PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K47 - CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2015-2019 Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Tình Thái Nguyên, năm 2019 i LỜI CẢM ƠN Được sự đồng ý của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro ” Trang đầu tiên của khoá luận này em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới giáo ThS Ngũn Thị Tình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em thời gian thực hiện đề tài Đồng thời, em xin cám ơn ThS Ma Thị Hoàn đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em suốt quá trình thực tập tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất và là chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Trong quá trình thực tập, cũng là quá trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn không tránh khỏi sai sót Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện Lời cuối em xin kính chúc các thầy, cô giáo nhà trường, khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, cùng các bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành công cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 03 tháng năm 2019 Sinh viên thực hiện Dương Thị Thu Hoài ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] .8 Bảng 3.1 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 25 Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của dung dịch HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả tái sinh chồi lan Hài P micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 39 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả nhân nhanh lan Hài P micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 41 Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả nhân nhanh chồi lan P micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) 44 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả nhân nhanh lan Hài P micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 47 Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả rễ tạo hồn chỉnh của lan Hài P.micranthum (sau 40 ngày ni cấy ) .49 Bảng 4.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của lan Hài P micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) .51 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh về lan Hài Paphiopedilum micranthum tại nhà lưới khoa CNSH-CNTP 11 Hình 2.2 Sơ đờ q trình phân hóa phản phân hóa của tế bào thực vật Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng đến khả tái sinh, nhân nhanh chồi rễ của lan Hài P.micranthum 28 Hình 4.1 Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng (sau ngày ni cấy) .36 Hình 4.2 Mợt sớ hình ảnh tạo vật liệu vơ trùng 37 Hình 4.3 Biểu đờ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P micranthum 38 Hình 4.4 Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh chồi lan Hài P micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy) 39 Hình 4.5 Biểu đồ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum (sau 20 ngày ni cấy) 40 Hình 4.6 Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 41 Hình 4.7 Biêu đồ ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả nhân nhanh lan Hài P micranthum (sau 20 ngày nuôi cấy) 42 Hình 4.8 Hình ảnh ảnh nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả nhân nhanh chồi lan hài P micranthum ( sau 20 ngày nuôi cấy ) 43 Hình 4.9 Biểu đờ ảnh hưởng của BA tốt nhất kết hợp với Giberellin đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum (sau 20 ngày ni cấy) 45 Hình 4.10 Hình ảnh ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum ( sau 20 ngày ni cấy ) 46 Hình 4.11 Biểu đờ ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum(sau 20 ngày nuôi cấy ) .47 iv Hình 4.12 Hình ảnh ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum (sau 20 ngày ni cấy) .48 Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hưởng của IAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của lan Hài P micranthum (sau 40 ngày ni cấy) .50 Hình 4.14 Hình ảnh ảnh hưởng của IAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của lan Hài P micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) 51 Hình 4.15 Biểu đờ ảnh hưởng của IBA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của lan Hài P micranthum(sau 40 ngày nuôi cấy ) .52 Hình 4.16 Hình ảnh ảnh hưởng của IBA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của lan Hài P micranthum (sau 40 ngày nuôi cấy ) 53 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B5 BAP CS CT CV Đ/C LSD : Gamborg cs, 1976 : 6-Benzyl amino purine : Cộng sự : Công thức : Coeficient of Variation – Hệ số biến động : Đối chứng : Least Singnificant DifferenceTest MS MT GA3 NAA : Murashighe Skoog, 1962 : Môi trường : Gibberellic acid : α-Napthalene acetic acid IAA IBA IUCN : Indole-3-acetic acid : Indole-3-butyric acid : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources - Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế : Paphiopedilum micranthum : Paphiopedilum malipones : Woody Plant Medium – Lioyd Mc Cown, 1980 P micranthum P malipoens WPM vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v MỤC LỤC vi Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu của đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .3 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum) 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc .4 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Sinh thái 2.1.4 Hiện trạng lan Hài Việt Nam 2.2 Tổng quan về lan Hài P micranthum 10 2.2.1 Nguồn gốc và sự phân bố lan Hài P micranthum ở Việt Nam 10 2.2.2 Hình thái 10 2.2.3 Các điều kiện bản để nuôi trồng giống lan hài P micranthum 11 2.2.4 Các phương pháp nhân giống vô tính lan Hài Mốc Hồng 12 2.3 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 2.3.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 2.3.2 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Error! Bookmark not defined 2.3.3 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 vii 2.3.4 Môi trường dinh dưỡng 14 2.3.5 Các công đoạn của nuôi mô tế bào 18 2.4 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài thế giới và nước .19 2.4.1 Trên thế giới 19 2.4.2 Trong nước 21 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 25 3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 25 3.1.2 Hoá chất sử dụng .25 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 25 3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 26 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu .26 3.2.3 Thời gian nghiên cứu 26 3.3 Nội dung nghiên cứu 26 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian cuả dung dịch khử trùng HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng 26 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh mầm ngủ lan Hài P micranthum 26 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng hợp chất hữu đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ .26 3.3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường rễ tạo hoàn chỉnh lan Hài P micranthum 27 3.4 Phương pháp nghiên cứu 27 3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 27 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giớng 28 3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 28 3.5 Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu 33 viii 3.5.1 Thu thập số liệu .33 3.5.3 Phương pháp sử lý số liệu .34 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .35 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của dung dịch khử trùng HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng 35 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả tái sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài P micranthum 37 4.3 Kết qủa nghiên cứu của một số chất kích thích sinh trưởng hợp chất hữu tự nhiên đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum từ đoạn thân mang mầm ngủ 39 4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng cuả NAA đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum 39 4.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum 41 4.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Giberellin đến khả nhân nhanh chồi lan P micranthum 43 4.3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối đến khả nhân nhanh chồi lan P micranthum .46 4.4 Kết quả nghiên cứu mơi trường rễ tạo hồn chỉnh của lan Hài P micranthum từ mầm ngủ 48 4.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của lan Hài P micranthum 49 4.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả rễ tạo hoàn chỉnh của lan Hài P.micranthum .51 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ix Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam một quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới, được công nhận một quốc gia ưu tiên cao cho bảo tờn tồn cầu Hệ sinh thái của Việt Nam giàu có và đa dạng với nhiều kiểu rừng, nhiều loài động, thực vật độc đáo không có ở nơi nào thế giới [14] Phong lan mọc khắp nơi thế giới nhiên tập trung loài phong lan đẹp nhất phải kể đến hai khu vực Châu Mỹ Châu Á nhiệt đới Việt Nam nằm khu vực châu Á nhiệt đới - nơi phát sinh mợt nhiều lồi phong lan đẹp Theo đánh giá của giáo sư Averyanov, Việt Nam có 158 chi khoảng 900 loài Theo tác giả Trần Duy Quý và cs đã thống kê phát hiện, ở Việt Nam có 160 chi và 1004 loài lan Đây là q́c gia có ng̀n tài ngun thực vật và đặc biệt họ Lan phong phú bậc nhất khu vực Châu Á Trong loài phong lan Việt Nam phải kể đến lan hài, lan hài Việt Nam không chỉ đẹp -phong phú mà đặc hữu hẹp chỉ có ở Việt Nam Theo Tác giả Trần Duy Quý không có nơi nào mà sự đa dạng của loài lan hài lại cao ở Việt Nam Có thể thấy 22 lồi lan hài tḥc chi Paphiopedilum với vô số dạng lai tự nhiên của chúng đã tạo lên sự đa dạng cho loài lan hài Việt Nam Các loài lan hài Việt Nam đa dạng về màu sắc kiểu dáng không chỉ thu hút người chơi lan nước mà hấp dẫn khách chơi lan ngoại quốc vậy người săn lan hài sẵn sàng trèo lên vỉa đá dốc ở vùng xa xôi hẻo lánh để khai thác Việc thu hái vậy đã gây nên tác động tàn phá thiên nhiên nghiêm trọng Điều này đã đẩy loài lan hài của Việt Nam rơi vào nguy tuyệt chủng, hoặc mức độ cực kỳ nguy cấp [18] Hài Mốc Hồng hay Hài ngọc nữ (Paphiopedilum micranthum) là mợt trơng sớ lồi lan có hoa to, màu sắc sặc sỡ, kiểu dáng đặc biệt với hình dáng của cánh hoa hình túi sâu trông giống một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa và môi điều hấp dẫn nhất đối với người trồng và lai tạo Lan Hài Hoa thường nở vào dịp tết Vùng phân bố của loài hẹp hiện chỉ tìm thấy ở miền Bắc Việt Nam (tập trung tại các tỉnh Cao Bằng, Hà Giang, Tuyên Quang, Thái Nguyên) và vùng Quảng Tây, Quý Châu, Vân Nam (Trung Quốc) Là loài Hài rất quý mới được phát hiện được ưa chuộng ở thị trường và ngoài nước [30] Giống thực trạng các loài lan Hài khác loài lan Hài P.micranthum cũng bị khai thác ồ ạt, cộng với phá nương rẫy khiến chngs mất nơi sinh sống vì vậy lan Hài Mốc Hồng cũng bị đe dọa tiêu diệt và biến mất nhanh chóng khỏi nơi sống tự nhiên của chúng Trước thực trạng bị đe doạ nghiêm trọng vậy việc bảo tồn, phát triển loài lan này hết sức cần thiết Đặc thù riêng của lan Hài P micranthum là sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy mầm của hạt tự nhiên thấp người dân khai thác ồ ạt đã đẩy lan Hài Mốc Hồng có nguy rơi vào danh mục các loài nguy cấp cần phải bảo tồn Vì vậy việc nghiên cứu nhân giống lan Hài rất được chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm Trước đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các loài lan Hài nhiều phương pháp khác gieo hạt, tách mầm phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm chất lượng không đồng đều, chất lượng thấp và số lượng ít…Để khắc phục được điều này, phương pháp nhân giống in vitro đã đời nhằm khắc phục hạn chế Phương pháp này cho số lượng lớn, chất lượng cao, đồng đều sạch bệnh Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được Hiện nay, nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro phát triển mạnh mẽ có thể tạo số lượng lớn, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền một thời gian ngắn và đáp ứng được giá cả phải chẳng của thị trường được coi là một giải pháp lý tưởng để bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy bị tuyệt chủng Trước thực trạng đó chúng tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp in vitro ” 1.2 Mục đích nghiên cứu Nhân giống thành công chồi lan Hài P micranthum từ mầm ngủ kĩ thuật nuôi cấy in vitro 3 1.3 Yêu cầu của đề tài - Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu dung dịch HgCl2 đến hiệu quả tạo vật liệu vô trùng - Xác định ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả tái sinh mầm ngủ lan Hài P micranthum - Xác định môi trường nhân nhanh chồi lan Hài P micranthum tái sinh từ mầm ngủ - Xác định mơi trường rễ tạo hồn chỉnh lan Hài P micranthum 1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn - Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này - Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các liệu khoa học mới về nhân giống lan Hài P micranthum phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, góp phần làm phong phú sở liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề xuất được quy trình nhân nhanh giống lan Hài P micranthum phương pháp nuôi cấy in vitro, tạo số lượng lớn lan Hài P micranthum góp phần bảo tồn giống hoa quý hiếm trước nguy tuyệt chủng đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học 4 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về lan Hài (Paphiopedilum) 2.1.1 Phân loại và nguồn gốc 2.1.1.1 Phân loại Lan Hài (Paphiopedium) một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp hành (Liliidae), lớp mợt lá mầm (Monocotyledoneae), nghành hạt kín (Angiospermatophyta) Lan Hài mợt nhóm rất đặc trưng họ lan Chúng dễ dàng nhận bởi cấu trúc hoa đặc biệt khác thường với mợt cánh hoa hình túi sâu trơng giớng mợt chiếc Hài, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ ngoài đặc sắc có thể dễ dàng phân biệt với loại lan khác Về mặt thực vật học, các loài lan Hài thuộc vào chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, phân bố ở các vùng ôn đới và núi của bán cầu bắc - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon Ở Việt Nam các loài lan Hài đều thuộc chi Paphipedilum, thuộc tông, Cypripedioideae, họ phụ Epidendroideae, họ Lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt kín (Angiospermatophyta), giới thực vật (Plantae) [1] 2.1.1.2 Nguồn gốc Chi Paphiopedilum có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, đó có Việt Nam Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này được tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, mỗi loại chi này đều có khu phân bố rất hạn chế Hầu tất cả các loài lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài gọi là ba lá đài và ba mảnh bao vòng gọi là ba cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong) Xu hướng tiến hoá của họ Lan là giảm số lượng nhị đực và sự dính liền nhị đực hữu thụ với nhị cái là sự biến đổi hoa bản nhất dẫn đến sự tiến hoá của họ Lan Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm lan có ba, hai hay một nhị đực tồn tại hoa Trong họ Lan, chi lan Hài (thuộc tông Cypripedioideae) là dòng tiến hoá có hai nhị đực còn tồn tại hoa [1], [19] 2.1.2 Đặc điểm hình thái Các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng nhiên chúng đều mang đặc điểm hình thái: - Dạng cây: Là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp thành hình quạt, có dạng thân bò Tất cả các loài đều có thân rễ đa số rất ngắn [1] - Lá: Thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên thân Độ dài của lá có thể từ 3- 50 cm Mặt của lá có thể có màu xanh lá hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ Mặt dưới lá có các đốm tím dày đặc hoặc vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gốc lá Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô đều dày, mọng nước và cứng [1] - Cụm hoa: Thường thẳng đứng hay cong Một số loài có cuống hoa nằm ngang, một số loài lại có cuống hoa chúc xuống, hầu hầu các loài đều có cuống hoa dựng đứng Phần lớn các loài chỉ có một hoa riêng lẻ Tuy nhiên cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, xong rất hiếm Trục cụm hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoặc nhẵn Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác tùy loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn Lá hoa thường có ít lông tơ các phần khác của cụm hoa nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần ở mặt ngoài lá, ở một số loài có lá hoa nhẵn - Hoa: Gồm hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng, một lá đài hợp và ba cánh hoa ở vòng Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp và hướng xuống phía dưới Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và nổi bật so với lá đài lưng Cả hai lá đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài [1] Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường xoè xuống dưới theo chiều ngang Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh Cánh hoa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống cái bao hoặc hình chiếc hài Môi dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy, có lông ở mặt và nhẵn ở mặt ngoài Nhị bất thụ của vòng ngoài và nhuỵ cái hợp thành cột nhị- nhuỵ Hai nhị đực hữu thụ của vòng có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhuỵ và hai bên cuốn cột Bầu dưới, một ô, đỉnh noãn bên là điểm đặc trưng của chi này Hầu hết các loài lan Hài, bầu có lông tơ, hình trụ, màu xanh lá hay đỏ tía xỉn [1] - Quả: Dạng quả nang, khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp Quả mở ở gần đỉnh rãnh nứt Quả thường chín điều kiên tự nhiên sau thụ phấn từ sáu đến mười tháng [1] - Hạt: Có hình bầu dục, hình suốt chỉ ngắn dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dìa từ 0,4 – 1,1 mm Phôi nhỏ, dài từ 0,3 – 0,4 mm Hạt không có nội nhũ đó rất khó nảy mầm điều kiện tự nhiên [1] 2.1.3 Sinh thái Các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng Một nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc Việt Nam từ độ cao mặt nước biển lên đến 1600m, nhóm còn lại phân bố ở khu vực có đá mẹ silicat, đá phiến và cát kết ở độ cao từ 7002200m Ngoài ra, có một vài cá thể nhóm này còn mọc bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit Lan Hài của Việt Nam có thể sống đất, bám đá và phụ sinh mùn Các loài sống đất thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán rừng, ở nơi sườn núi dốc, các nền đất có nhiều lá rơi bị phân huỷ mạnh và giàu chất mùn Các loài lan Hài mọc đá thường mọc dưới bóng của kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và bên dưới các đường đỉnh Các loài phụ sinh mùn chủ yếu sống bám vỏ gỗ các vùng rừng mây mù ẩm độ cao 1200-1500m Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, ẩm độ cao Tuy nhiên đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi tốt để có thể sống sót được qua đợt khô hạn định kỳ và chúng nhanh chóng phục hồi mùa mưa trở lại Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng sự hình thành và phát triển của quần thể lan Hài Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều ở các hướng của sườn núi Nhưng các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát triển ở các sườn núi phía Bắc, đông Bắc và tây Bắc của núi Ngày nay, thường chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành đám nhỏ Các nơi sống tự nhiên bị phá huỷ bởi người,sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là nguyên nhân chính gây sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài khắp các vùng của Việt Nam [1] 2.1.4 Hiện trạng lan Hài Việt Nam Hiện nay, nhu cầu về hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng thế giới cũng nước ngày càng gia tăng Vì vậy, việc trồng lan đã trở thành một ngành kinh tế của nhiều nước thế giới và nhiều nước phát triển khu vực Đông Nam Á Lan Hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm, tìm kiếm nhiều nhất thế giới Với sự hiện hữu của 22 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất Không phong phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng [5] Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm tự nhiên Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt hiện nay, lan Hài càng biến mất nhanh chóng [6] Dựa nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các loài lan Hài tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe doạ tuyệt chủng của tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) được tổng kết ở bảng 2.1 Bảng 2.1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) [1] Tình trạng Tên loài (tiếng Latinh) Tên loài (tiếng Việt) Đã bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên P vietnamense Hài Việt Đang bị tuyệt chủng trầm trọng p delenatii Hài Đỏ P  aspersum P barbigerum var lokianum P callosum P dianthum P emersonii P gratrixianum P hangiannum P helenae P henryanum P  herrmannii P malipoense var jackii P malipoense P micranthum P purpuratum P tralienianum P appletonianum P concolor P hirsutissimum var chiwuawnum P hirsutissimum var esquirolai P villosun var annamense Chưa rõ tên gọi Hài Lộc Hài Vân Hài Xoắn Hài Hương Lan Hài Đuôi công Hài Hằng Hài len Hài Henry Hài Herman Hài Jack Hài Giáp Hài Mốc Hồng Hài Tía Hài Trần liên Hài Cánh Sen Hài Gia Định Hài Tiên biến dị Hài Tiên Hài Lông P  affine P  datalanse P villosum var boxalli Hài Hoà Chưa rõ tên gọi Chưa rõ tên gọi Đang bị tuyệt chủng Sắp bị tuyệt chủng Thiếu dẫn liệu Trên thực tế, mức độ đe doạ tuyệt chủng đối với tất cả các loài lan Hài Việt Nam được chỉ ở bảng đã bị thay đổi nhiều thời gian gần sự suy giảm nhanh các quần thể được biết Trong năm gần đây, qua các đợt điều tra thực địa đã phát hiện tốc độ phá huỷ mạnh mẽ diện rộng của khu rừng còn sót lại của Việt Nam, chủ yếu các đỉnh núi đá vôi [17], [18], [19] Sự thay đổi môi trường sống người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện là nhân tố chính làm suy giảm nhanh chóng số lượng các loài lan Hài Tất nhiên, việc phá huỷ nơi sống tự nhiên của chúng có liên quan đến tốc độ phát triển kinh tế và sự gia tăng dân số của Việt Nam Các loài lan Hài rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường nên bị đe doạ tuyệt chủng nhiều và biến mất trước tiên sau nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái Yếu tố thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài lan Hài ở Việt Nam năm gần là việc thu hái diện rộng của người dân địa phương để bán và xuất khẩu một lượng lớn các loài lan Hài mọc tự nhiên nước ngoài Do không có biện pháp quản lý có hiệu quả việc thu mẫu các loài thực vật hoang dã với sự giàu có nổi bật của lan Hài đặc hữu của Việt Nam đã khuyến khích việc thu thập các loài lan từ thiên nhiên với số lượng lớn toàn bộ lãnh thổ [1] Nếu không có các biện pháp bảo vệ các khu rừng nguyên sinh khẩn cấp và hiệu quả thì chắc chắn các sinh vật phải đối mặt với nguy tuyệt chủng tương lai gần Điều này kéo theo sự tuyệt chủng của một số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài hoa quý này đã được triển khai,chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng Một công trình hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài ở Việt Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp năm 2004 [1] Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã bảo tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắk Lắk), Núi Bà (Lâm Đờng) bảo tờn lồi P appletonianum - Khu bảo tờn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) bảo tờn lồi P callosum - Vườn Q́c Gia Ba Bể, khu bảo tờn Cát Bà (Hải Phịng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cị (Hịa Bình), khu bảo tờn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) bảo tồn P dalatensis - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) bảo tờn lồi P dianthum, P micranthum ... LÂM DƯƠNG THỊ THU HOÀI Tên đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI MỐC HỒNG (PAPHIOPEDILUM MICRANTHUM) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO? ?? KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính... nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: ? ?Nghiên cứu khả nhân nhanh lan Hài Mốc Hồng (Paphiopedilum micranthum) bằng phương pháp. .. 27 3.4 Phương pháp nghiên cứu 27 3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro 27 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu quy trình nhân giớng 28 3.4.3 Phương pháp bố trí