Tách dòng gen vigna radiata cystatin chịu hạn ở giống mn93 (cây đậu)

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC CHỦ ĐỀ: TÁCH DÒNG GEN VIGNA RADIATA CYSTATIN CHỊU HẠN Ở GIỐNG MN93 (CÂY ĐẬU) GVHD: PGS.TS.Nguyễn Văn Cách TỔNG QUÁT VỀ CYSTATIN ❑ Đậu xanh trồng ăn hạt trồng nhiều nước giới Đậu xanh chịu hạn kém, mơi trường nóng, lạnh, hạn, sâu bệnh ảnh hưởng trực tiếp đến suất đậu xanh ❑ Cystatin protein ức chế cysteine proteaza thuộc họ papain Cystatin thực vật có nhiều lồi mầm hai mầm, có hoạt tính giống chất ức chế cystein proteaza động vật ❑ Khi trồng gặp hạn cystatin đóng vai trị chất để xâm nhập vào trung tâm hoạt động cysteine proteaza, ức chế khả hoạt động enzyme, làm giảm hoạt động phân giải protein TÌM GEN CYSTATIN TRÊN TRANG NCBI TÌM GEN CYSTATIN TRÊN TRANG NCBI TÌM GEN CYSTATIN TRÊN TRANG NCBI PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CHUỖI TRÊN CLUSTAL OMEGA ❑ Sau chọn dự liệu gen NCBI: Cystatin đậu MN93, Cystatin đậu KP11 Cystatin lúa mạch Nhấn vào FASTA liệu gen, hiển thị đoạn trình tự gen ❑ Copy trình tự gen vừa tìm vào chương trình Clustal Omega, sau nhấn vào Submit để chương trình phân tích PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CHUỖI TRÊN CLUSTAL OMEGA ❑ Sau chạy chương trình cho kết hình bên ❑ So sánh tương đồng trình tự gen, em lấy đoạn gen từ nucleotit thứ 921 đến nucleotit thứ 1006 trình tự gen AM712476.1 để mang thiết kế mồi SỬ DỤNG CHƯƠNG TRÌNH PRIMER BLAST ĐỂ THIẾT KẾ MỒI ⮚ Ta copy gen cần tách dịng thiết lập vị trí thiết kế mồi từ nu 921 đến 1006 ô Forward primer ⮚ Sau thiết lập cài đặt xong ta nhấn Get Primers KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ► Sau chạy chương trình cho ta 10 đoạn mồi CHỌN ĐOẠN MỒI ĐỂ TIẾN HÀNH PCR TEST ⮚ Dựa vào số yêu cầu cặp mồi dung PCR như: độ dài từ 18-24 bp, tỷ lệ GC tối ưu 50-55%, nucleotit cuối đầu 3’ cần có 2G C ⮚ Nên ta chọn Primer pair (thỏa mãn yêu cầu nêu trên) kiểm tra lại mồi xuôi, mồi ngược ta thấy nằm vùng bảo thủ chương trình Clustal Omega PCR TEST ► Sau thiết kế mồi xuôi, mồi ngược, ta tiến hành PCR ► Ta copy trình tự gen AM712476.1 vào ô Input, copy đoạn mồi xuôi (Forward primer) vào ô First Primer, copy đoạn mồi ngược (Reverse primer) vào ô Second Primer ► Sau nhấn vào Submit KẾT QUẢ CHẠY PCR TEST ► Kết PCR đoạn gen dài 102 bp PHÂN TÍCH CẤU TRÚC TƯƠNG ĐỒNG BLAST ⮚ Copy đoạn gen vừa PCR vào chương trình BLAST ⮚ Nhấn vào BLAST để chạy chương trình, sau tìm tính chất cấu trúc tương đồng với đoạn gen PCR KẾT QUẢ THU ĐƯỢC KHI CHẠY BLAST KẾT QUẢ THU ĐƯỢC KHI CHẠY BLAST TÌM HIỂU TÍNH CHẤT CỦA CÁC CẤU TRÚC TƯƠNG ĐỒNG ► Dựa vào chương trình phân tích cấu trúc tương đồng ta thấy đoạn gen PCR tương đồng đến 100% với Vigna radiata mRNA complete cds,… ► Vigna radiata mRNA complete cds, vào liệu địa ta thấy gen có nguồn gốc đậu, loại mRNA, chất ức chế protein cysteine, codon bắt đầu vị trí ► Miền giống Cystatin, cystatin họ chất ức chế protease cysteine xảy chủ yếu đơn protein miền Tuy nhiên số protein ngoại bào kininogen, glycoprotein fetuin chứa miền TÁCH DÒNG GEN CYSTATIN Ở CÂY ĐẬU XANH MN93 ► Gen Cystatin thực vật mã hóa cho protein cystatin ức chế hoạt động cysteine proteaza Cystatein proteaza enzyme có vai trị thiết yếu q trình sinh trưởng phát triển thực vật, tích lũy protein dự trữ hạt, huy động protein dự trữ khả chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường ► Cặp mồi Cystatin chịu hạn thiết kế dựa phân tích trình tự gen cystatin giống đậu xanh công bố Ngân hàng gen NCBI với địa AM712476.1 ► Sử dụng vector tách dịng pTZ57R/T TÁCH DỊNG GEN CYSTATIN Ở CÂY ĐẬU XANH MN93 ❑ Tách chiết DNA tổng số khuếch đại gen từ cDNA: - DNA tổng số tách từ hoa đậu xanh - cDNA sau tổng hợp sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại gen Cystatin với cặp mồi đặc hiệu - Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose tinh ❑ Gắn vào vector tách dòng: - Sử dụng vector tách dòng pTZ57R/T - Sản phẩm PCR nhân gen Cystatin vector tách dòng pTZ57R/T cắt đồng thời hai enzyme đặc hiệu - Sản phẩm cắt sau tinh ghép nối enzym ligase - Sau biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α cấy trải đĩa Petri có mơi trường LB đặc bổ sung ampicillin, ủ 37°C 16 TÁCH DÒNG GEN CYSTATIN Ở CÂY ĐẬU XANH MN93 ❑ Chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp: - Tế bào tái tổ hợp sàng lọc PCR với cặp mồi đặc hiệu từ khuẩn lạc - Tế bào tái tổ hợp nuôi tăng sinh, tách plasmid để kiểm tra đoạn chèn enzyme cắt hạn chế giải trình tự gen - Trình tự gen sau kiểm tra cách so sánh với trình tự gen gốc ngân hàng gen NCBI công cụ BLAST ❑ Gắn vào vector chuyển gen: - Vector biểu sử dụng để chuyển gen Crystatin vào đậu - Vector biểu cắt đồng thời enzyme đặc hiệu sau ghép nối enzyme DNA ligase - Sản phẩm ghép nối chuyển vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α nuôi cấy môi trường LB - Để chuyển vào trồng, plasmid tái tổ hợp chuyển vào tế bào vi khuẩn THANK YOU FOR WATCHING ... TÌM GEN CYSTATIN TRÊN TRANG NCBI TÌM GEN CYSTATIN TRÊN TRANG NCBI TÌM GEN CYSTATIN TRÊN TRANG NCBI PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CHUỖI TRÊN CLUSTAL OMEGA ❑ Sau chọn dự liệu gen NCBI: Cystatin đậu MN93, Cystatin. .. địa AM712476.1 ► Sử dụng vector tách dòng pTZ57R/T TÁCH DÒNG GEN CYSTATIN Ở CÂY ĐẬU XANH MN93 ❑ Tách chiết DNA tổng số khuếch đại gen từ cDNA: - DNA tổng số tách từ hoa đậu xanh - cDNA sau tổng... đại gen Cystatin với cặp mồi đặc hiệu - Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose tinh ❑ Gắn vào vector tách dòng: - Sử dụng vector tách dòng pTZ57R/T - Sản phẩm PCR nhân gen Cystatin vector tách dòng