Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - HÀ THỊ PHƢỢNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - HÀ THỊ PHƢỢNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU Thái Nguyên - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Chu Hồng MậuPhó Giám đốc Đại học Thái ngun TS Chu Hồng Hà - Phó Giám đốc Phịng thí nghiệm trọng điểm , Viện Cơng nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hƣớng dẫn , chỉ bảo , hết lòng giúp đỡ suốt quá trì nh nghiên cƣ́u và thực đề tài luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Lê Trần Bình - Ngun Viện trƣởng Viện Cơng nghệ Sinh học giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn của mì nh Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Trƣờng Đại học khoa học tƣ̣ nhiên –ĐH Thái nguyên CN Hoàng Hà - Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật , Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ trình thực đề tài luận văn Trong trình thƣ̣c hiện đề tài , tơi nhận đƣợc giúp đỡ nhiệt tình tồn thể cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa sau đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái nguyên giảng dạy tạo điều kiện cho tơi hồn thành khố học Tơi xin cảm ơn lãnh đạo trƣờng THPT Đồng Hỷ , bạn đồng nghiệp tạo điều kiện giúp đỡ q trình học tập hồn thành luận văn Cuối biết ơn ngƣời thân gia đình, bạn của tơi ln động viên, quan tâm, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng năm 2010 Tác giả luận văn Hà Thị Phƣợng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang phụ bì a Trang Lời cảm ơn Nhƣ̃ng chƣ̃ viết tắt Danh mục các bảng luận án Danh mục các hì nh luận án MỞ ĐẦU………………………………………………………… Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………… 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG VÀ ĐẶC TÍ NH CHỊ U HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG .4 1.1.1 Cây đậu tƣơng…………………………… …………… 1.1.2 Đặc tính chịu hạn đậu tƣơng………… ……… … .8 1.2 CHẤT Ƣ́C CHẾ CYSTATIN VÀ GEN CYSTATIN Ở THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƢƠNG 12 1.2.1 Chất ƣ́c chế Cystatin 12 1.2.1.1 Giới thiệu chung về Cystatin ở sinh vật .12 1.2.1.2 Phân loại Cystatin .13 1.2.1.3 Cấu trúc, chức Cystatin thực vật 15 1.2.2 Gen mã hóa Cystatin ở thƣ̣c vật và đậu tƣơng… …….….… .19 1.3 ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN LẬP GEN 21 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .28 2.1.1 Vật liệu thực vật 28 2.1.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 29 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 2.2.1 Đánh gía khả chịu hạn giai đoạn non phƣơng pháp gây hạn nhân tạo .29 2.2.2 Xử lý kết quả tính tốn số liệu 31 2.2.3 Phƣơng pháp sinh học phân tử 31 2.2.3.1 Phƣơng pháp tách chiết ARN tổng số từ mầm đậu tƣơng 31 2.2.3.2 Phƣơng pháp điện di ADN gel agarose .32 2.2.3.3 Phƣơng pháp RT-P 32 2.2.3.4 Ph-ơng pháp gắn gen vào vector tách dòng 35 2.2.3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5 36 2.2.3.6 Ph-ơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 36 2.2.3.7 Tách chiết plasmit 37 2.2.3.8 Phƣơng pháp xác định trình tự gen thiết bị tự động( N) 37 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA HẠT VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 38 3.1.1 Đặc điểm hình thái, kích thƣớc khối lƣợng hạt giống đậu tƣơng nghiên cứu 38 3.1.2 Khả chịu hạn giống đậu tƣơng 39 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊ NH TRÌ NH TƢ̣ GEN CYSTATIN Ở ĐẬU TƢƠNG 40 3.2.1 Tách chiết ARN tổng số 40 3.2.2 KÕt qu¶ RT-PCR 43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.3 KÕt qu¶ biÕn nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 44 3.2.4 Kết chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp 46 3.2.5 Kết tách chiết ADN plasmid 47 3.2.6 Kết kiểm tra dòng plasmid 48 3.2.7 Kết quả giải trình tự nucleotit 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……………… .……………… … 58 CÔNG TRÌ NH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic ASTT Áp suất thẩm thấu ATP- aza Enzym phân giải ATP Bp Cặp bazơ cADN Sợi ADN bổ sung đƣợc tổng hợp từ mARN nhờ enzyme phiên mã ngƣợc dNTP Deoxynucleotid cs Cộng sƣ̣ DHA Docosa Hexaenoic Axit EDTA Ethylendiamin tetraacetic axit EPA Eicosa Pentaenoic axit HSP Heat shock protein - Protein sốc nhiệt HSG Heat Shock Granules HSPL Hệ số pha loãng Kb Kilo bazơ = 1000 bp LEA Late embryogenesis abundant MGPT Môi giới phân tử - Molecular chaperone MW Molecular weight - Khối lƣợng phân tử PCR Polymeraza chain reaction - Phản ứng chuỗi polimeraza Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tên Bảng Trang Nguồn gốc, đặc điểm giống đậu tƣơng nghiên 30 cứu 2.2 Thành phần phản ứng PCR 24 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 37 2.4 Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT 38 3.1 Màu sắc, số lƣợng khối lƣợng hạt giống đậu 42 tƣơng nghiên cứu 3.2 Đánh giá khả chị u hạn của giống đậu tƣơng 45 Hệ số tƣơng đồng và hệ số khác của gen cystatin 58 nghiên cứu 3.3 10 giớng đậu tƣơng (%) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên Hì nh Trang 2.1 Sơ đờ vector pBT 38 3.1 Hình ảnh hạt giống đậu tƣơng nghiên cứu 42 3.2 Hình ảnh đậu tƣơng trƣớc xử lý hạn 44 3.3 Hình ảnh đậu tƣơng sau xử lý hạn 44 3.4 Kết quả tách chiết RNA tổng số 46 3.5 KÕt qu¶ PCR nhân gen củ a giớng đậu tƣơng Thái 48 Nguyên 3.6 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α 49 3.7 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pUC18F- 50 3.8 Kết quả tách ADN plasmid tái tổ hợp 51 3.9 Kết quả cắt plasmid enzyme giới hạn BamHI 52 3.10 Trình tự trình tự nucleotid mẫu nghiên cứu 54 Thái Nguyên mẫu giống đậu tƣơng đã công bố genbank 3.11 Biểu đồ hì nh so sánh mƣ́c tƣơng đồng gen 59 cystatin của 10 giống đậu tƣơng 3.12 Trình tự axit amin của mẫu nghiên cƣ́u Thái 60 Nguyên và mẫu giống đậu tƣơng đã công bố genbank Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đậu tƣơng Glycine max (L.) Merrill loại có vị trí quan trọng cấu trờng nơng nghiệp, có giá trị kinh tế hàm lƣợng dinh dƣỡng cao Hạt đậu tƣơng chứa 30%- 46% protein, 12%-25% lipit, nhiều loại vitamin (B1, B2, C,D, E, K…), chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin, xystein, lizin…), nguồn lƣợng cần thiết cho ngƣời Cây đậu tƣơng có thời gian sinh trƣởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm, tạo khả cố định nitơ khơng khí thành chất hữu nên đậu tƣơng thƣờng đƣợc trồng luân canh với lúa ngô để tăng vụ cải tạo đất bạc màu Vì trờng đậu tƣơng góp phần cải tạo đất bảo vệ mơi trƣờng Với giá trị to lớn đó, mà đậu tƣơng đƣợc trồng phổ biến nhiều nƣớc giới, phát triển mạnh Mỹ, Braxin, Argentina , Trung Quốc và Ấn Độ Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc gieo trồng cả vùng nông nghiệp cả nƣớc với nguồn gen đa dạng phong phú, gồm giống nhập nội, giống lai tạo, giống đột biến tập đoàn giống địa phƣơng Sự đa dạng phong phú nguồn nguyên liệu phục vụ cho công tác giống nhằm chọn tạo giống đậu tƣơng cho suất chất lƣợng phù hợp với mục tiêu chọn giống [9] Những giống đậu tƣơng địa phƣơng thƣờng có suất thấp, nhƣng lại có chất lƣợng hạt tốt khả chống chịu cao đối với điều kiện bất lợi ngoại cảnh Trong năm gần diễn biến khí hậu ngày phức tạp, lƣợng mƣa phân bố không vùng thờì kỳ năm nên hạn hán nắng nóng kéo dài với biến đổi yếu tố môi trƣờng khác tác động xấu đến sinh trƣởng phát triển, làm giảm suất Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Gen cystatin của giống đậu tƣơng Thái Ngun có độ tƣơng đờng 94,5% so với gen cystatin các giống mang mã số AK243705, AK243707 BT089987 Và đạt mức độ tƣơng đồng so với gen cystatin của giớng có mã số BT098957 99,7% Ở mức độ nucleotide, hệ số tƣơng đồng cao 99,8% so với giống có mã số AC167784, AC187164, AK246065, D31700 D64115 Th Ngu yen seq AC 167 784 seq AC 187 164 seq AK246 06 5.seq D3 170 0.se q D6 411 5.se q BTO98 957 s eq AK243 70 5.seq AK243 70 7.seq BT089 98 7.seq 2.8 Nu cleo tide Sub stitution s (x10 0) Hình 3.10 Biểu đờ hì nh so sánh mƣ́c tƣơng đồng gen cystatin của 10 giống đậu tƣơng Biểu đồ hì nh thể hiện mối quan hệ di truyền 10 giống đậu tƣơng sở phân tí chtrình tự gen cystatin Kết quả sơ đờ hình (h×nh 3.10) cho thấy 10 giớng đậu tƣơng đƣợcphân thành nhóm chính: - Nhóm I phân thành nhóm phụ: nhóm phụ gồm giống Thái Nguyên, AC167784, AC187164, AK246065, D31700, D64115 nhóm phụ giống BT098957 - Nhóm II phân nh nhóm phụ: nhóm phụ gờm giống AK243705, AK243707 nhóm phụ giống BT 089987 Gen cystatin phân lập đƣợc tƣ̀ giống đậu tƣơng Thái Ngun có kích thƣớc 738 bp đƣợc tách tƣ̀ mARN nên trình tự nucleotide vùng mã hóa Chúng tơi tiến hành so sánh trì nh tƣ̣ axit amin chuỗi polypeptide gen cystatin mã hóa giống đậu tƣơng nghiên cƣ́u với giớng đậu tƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.lrc-tnu.edu.vn có hệ số tƣơng đồng cao công bố ngân hàng G enBank Kết quả so sánh đƣợc thể hiện ở hình 3.11 D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | ATGAGAGCATTAACCTCTTCTTCTTCCACTTTCATTCCAAAGCGTTATTCCTTCTTCTTC MetArgAlaLeuThrSerSerSerSerThrPheIleProLysArgTyrSerPhePhePhe MetArgAlaLeuThrSerSerSerSerThrPheIleProLysArgTyrSerPhePhePhe MetArgAlaLeuThrSerSerSerSerThrPheIleProLysArgTyrSerPhePhePhe MetArgAlaLeuThrSerSerSerSerThrPheIleProLysArgTyrSerPhePhePhe MetArgAlaLeuThrSerSerSerSerThrPheIleProLysArgTyrSerPhePhePhe 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | TTCCTCTCCATTCTCTTCGCTCTTCGATCCTCGTCCGGGGGCTGCTCCGAATACCACCAC PheLeuSerIleLeuPheAlaLeuArgSerSerSerGlyGlyCysSerGluTyrHisHis PheLeuSerIleLeuPheAlaLeuArgSerSerSerGlyGlyCysSerGluTyrHisHis PheLeuSerIleLeuPheAlaLeuArgSerSerSerGlyGlyCysSerGluTyrHisHis PheLeuSerIleLeuPheAlaLeuArgSerSerSerGlyGlyCysSerGluTyrHisHis T PheLeuSerIleLeuPheAlaLeuArgSerSerSerGlyGlyCysSerEndTyrHisHis 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | CACCACGCGCCGATGGCCACGATAGGAGGCTTACGCGACTCCCAAGGCTCTCAGAACAGC HisHisAlaProMetAlaThrIleGlyGlyLeuArgAspSerGlnGlySerGlnAsnSer A HisHisThrProMetAlaThrIleGlyGlyLeuArgAspSerGlnGlySerGlnAsnSer HisHisAlaProMetAlaThrIleGlyGlyLeuArgAspSerGlnGlySerGlnAsnSer HisHisAlaProMetAlaThrIleGlyGlyLeuArgAspSerGlnGlySerGlnAsnSer HisHisAlaProMetAlaThrIleGlyGlyLeuArgAspSerGlnGlySerGlnAsnSer 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | GTCCAAACCGAGGCCCTCGCTCGATTCGCCGTCGATGAACACAACAAGAAGCAGAATTCA ValGlnThrGluAlaLeuAlaArgPheAlaValAspGluHisAsnLysLysGlnAsnSer ValGlnThrGluAlaLeuAlaArgPheAlaValAspGluHisAsnLysLysGlnAsnSer ValGlnThrGluAlaLeuAlaArgPheAlaValAspGluHisAsnLysLysGlnAsnSer ValGlnThrGluAlaLeuAlaArgPheAlaValAspGluHisAsnLysLysGlnAsnSer ValGlnThrGluAlaLeuAlaArgPheAlaValAspGluHisAsnLysLysGlnAsnSer Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | CTTCTGGAGTTTTCTAGGGTGGTGAGGACACAGGAACAGGTTGTTGCGGGAACCCTGCAT LeuLeuGluPheSerArgValValArgThrGlnGluGlnValValAlaGlyThrLeuHis LeuLeuGluPheSerArgValValArgThrGlnGluGlnValValAlaGlyThrLeuHis LeuLeuGluPheSerArgValValArgThrGlnGluGlnValValAlaGlyThrLeuHis LeuLeuGluPheSerArgValValArgThrGlnGluGlnValValAlaGlyThrLeuHis LeuLeuGluPheSerArgValValArgThrGlnGluGlnValValAlaGlyThrLeuHis 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | CACCTTACTCTCGAAGCTATTGAGGCAGGTGAGAAGAAGCTCTATGAAGCCAAGGTGTGG HisLeuThrLeuGluAlaIleGluAlaGlyGluLysLysLeuTyrGluAlaLysValTrp HisLeuThrLeuGluAlaIleGluAlaGlyGluLysLysLeuTyrGluAlaLysValTrp HisLeuThrLeuGluAlaIleGluAlaGlyGluLysLysLeuTyrGluAlaLysValTrp HisLeuThrLeuGluAlaIleGluAlaGlyGluLysLysLeuTyrGluAlaLysValTrp HisLeuThrLeuGluAlaIleGluAlaGlyGluLysLysLeuTyrGluAlaLysValTrp 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | GTGAAACCATGGTTGAATTTCAAAGAACTCCAAGAGTTCAAGCCTGCTGGTGATGTACCA ValLysProTrpLeuAsnPheLysGluLeuGlnGluPheLysProAlaGlyAspValPro ValLysProTrpLeuAsnPheLysGluLeuGlnGluPheLysProAlaGlyAspValPro ValLysProTrpLeuAsnPheLysGluLeuGlnGluPheLysProAlaGlyAspValPro ValLysProTrpLeuAsnPheLysGluLeuGlnGluPheLysProAlaGlyAspValPro ValLysProTrpLeuAsnPheLysGluLeuGlnGluPheLysProAlaGlyAspValPro 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | TCATTTACCTCTGCTGATCTTGGTGTCAAAAAGGATGGTCACCAACCTGGATGGCAATCT SerPheThrSerAlaAspLeuGlyValLysLysAspGlyHisGlnProGlyTrpGlnSer SerPheThrSerAlaAspLeuGlyValLysLysAspGlyHisGlnProGlyTrpGlnSer SerPheThrSerAlaAspLeuGlyValLysLysAspGlyHisGlnProGlyTrpGlnSer SerPheThrSerAlaAspLeuGlyValLysLysAspGlyHisGlnProGlyTrpGlnSer SerPheThrSerAlaAspLeuGlyValLysLysAspGlyHisGlnProGlyTrpGlnSer 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | GTGCCAACACATGACCCTCAAGTTCAGGATGCAGCAAATCATGCGATCAAGACTATCCAG ValProThrHisAspProGlnValGlnAspAlaAlaAsnHisAlaIleLysThrIleGln ValProThrHisAspProGlnValGlnAspAlaAlaAsnHisAlaIleLysThrIleGln ValProThrHisAspProGlnValGlnAspAlaAlaAsnHisAlaIleLysThrIleGln ValProThrHisAspProGlnValGlnAspAlaAlaAsnHisAlaIleLysThrIleGln ValProThrHisAspProGlnValGlnAspAlaAlaAsnHisAlaIleLysThrIleGln Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên D31700 BT098957 unkno Exon DNA D6411 Gly AK246065 Thái Nguyên 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | CAAAGGTCTAATTCACTAGTACCCTATGAGCTTCATGAGGTTGCTGATGCAAAGGCTGAG GlnArgSerAsnSerLeuValProTyrGluLeuHisGluValAlaAspAlaLysAlaGlu GlnArgSerAsnSerLeuValProTyrGluLeuHisGluValAlaAspAlaLysAlaGlu GlnArgSerAsnSerLeuValProTyrGluLeuHisGluValAlaAspAlaLysAlaGlu GlnArgSerAsnSerLeuValProTyrGluLeuHisGluValAlaAspAlaLysAlaGlu GlnArgSerAsnSerLeuValProTyrGluLeuHisGluValAlaAspAlaLysAlaGlu 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | GTCATTGATGACTTTGCCAAGTTTAATCTGCTTCTCAAAGTCAAGAGGGGACAGAAGGAA ValIleAspAspPheAlaLysPheAsnLeuLeuLeuLysValLysArgGlyGlnLysGlu ValIleAspAspPheAlaLysPheAsnLeuLeuLeuLysValLysArgGlyGlnLysGlu ValIleAspAspPheAlaLysPheAsnLeuLeuLeuLysValLysArgGlyGlnLysGlu ValIleAspAspPheAlaLysPheAsnLeuLeuLeuLysValLysArgGlyGlnLysGlu ValIleAspAspPheAlaLysPheAsnLeuLeuLeuLysValLysArgGlyGlnLysGlu 670 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | GAGAAGTTCAAGGTAGAGGTACATAAGAATAACCAAGGTGGGTTCCATCTAAATCAGATG GluLysPheLysValGluValHisLysAsnAsnGlnGlyGlyPheHisLeuAsnGlnMet GluLysPheLysValGluValHisLysAsnAsnGlnGlyGlyPheHisLeuAsnGlnMet GluLysPheLysValGluValHisLysAsnAsnGlnGlyGlyPheHisLeuAsnGlnMet GluLysPheLysValGluValHisLysAsnAsnGlnGlyGlyPheHisLeuAsnGlnMet GluLysPheLysValGluValHisLysAsnAsnGlnGlyGlyPheHisLeuAsnGlnMet 730 | | | GAACAAGATCATTCCTAA GluGlnAspHisSerEnd GluGlnAspHisSerEnd GluGlnAspHisSerEnd GluGlnAspHisSerEnd GluGlnAspHisSerEnd Hình 3.11 So sánh t rình tự axit amin mã hóa gen cystatin phân lập tƣ̀ giống đậu Thái Nguyên mẫu giống đậu tƣơng đã cơng bớ GenBank Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.lrc-tnu.edu.vn Gen cystatin giống Thái Nguyên mà chúng phân lập có trình tự nucleotide so với gen mã D 31700; AK246065; D64115 chỉ khác nucleotide (G thay bằng T tại vị trí nucleotide số 109) Và so với gen cystatin có mã số BT 098957 khác nucleotide vị trí nucleotide 109 (T thay G) 127 (A thay bằng G ) Đây là sƣ̣ thay thế nucleotide nên chỉ dẫn tới kết quả làm thay đổi một axit amin ch̃i polypeptidevà nhƣ trình tự axit amin giống Thái Nguyênchỉ khác axit amin so với trình tự D31700; AK246065 D64115 khác axit amin so với BT098957 Bộ ba GAA vị trí nu cleotide sớ 109 127 mã hóa axit amin Glutamic Tuy nhiên G thay bằng T nên b ộ ba GAA biến đổi thành TAA ba kết thúc quá trình dịch mã Sƣ̣ thay thế G bởi T có thể xảy số khả sau: (1) Trong quá trì nh phiên mã ngƣợc tổng hợp cDNA tƣ̀ mRNA sƣ̣ lắp ghép sai mợt nucleotide; Hay q trình nhân gen PCR có lắp ghép sai , vị trí nucleotide 109 lẽ G lại bị thay T ; (2) quá trì nh tái bản hoặc q trình phiên mã gen bị đợt biến thay thế nucleotide; (3) Gen cystatin phân lập tƣ̀ ADN hệ gen có kích thƣớc 5863 bp gờm đoạn exon và đoạn intron Trình tự g en cystatin của giớng nghiên cƣ́u đƣợc tách từ mRNA có trình tự nucleotide tƣơng đờng với trình tự nucleotide exon Khi phiên mã tổng hợp mRNA , đoạn khơng mã hóa mã hóa đƣợc thành phân tƣ̉ tiền mRNA (pre-mRNA) Qua giai đoạn cắt bỏ các đoạn intron và nối các exon lại với dẫn tới sƣ̣ sai sót Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn (4) Ở khả d o đột biến thay thế thì đoạn polypeptide đƣợc dịch mã có kích thƣớc 36 axit amin; chuỗi polypeptide đƣợc suy diễn từ trình tự nucleotide cADN –đƣợc phiên mã từ mARN tách từ hạ t non, xảy số trƣờng hợp sau: - Cystatin không đƣợc tổng hợp nên enzyme cysteine proteinase không bị ức chế - Đoạn polypeptide gồm 36 axit amin tham gia hoạt động sinh lý, hóa sinh tế bào Chính lẽ cần phải có nghiên cứu làm sáng tỏ vấn đề Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Các giống đậu tƣơng địa phƣơng nghiên cứu có đa dạng phong phú hình thái, số quả số hạt , khối lƣợng hạt, màu sắc hạt và màu sắc rớn hạt Giống có khối lƣợng 1000 hạt cao giống DT84 (145g) thấp giống TN và CT có khối lƣợng (68g) Sớ quả dao động 42,6 - 107,8 quả, số hạt dao động 78,2 - 195,4 hạt Khối lƣợng 1000 hạt giống xếp theo thứ tự DT84> BH> BD> CT = TN 1.2 Ở giai đoạn non ba lá, giống đậu tƣơng DT84, BH, BD, CT TN có phản ứng khác hạn, biểu tỷ lệ thiệt hại, tỉ lệ chết héo Chỉ số chịu hạn tƣơng đối giống dao động 215,07 3595,77 Trong đó, giống BD có khả chịu hạn tốt Khả chịu hạn giai đoạn non giống đậu tƣơng xếp theo thứ tự: BD> BH > TN> CT> DT84 1.3 Đã thiết kế cặp mồi và khu ếch đại thành công gen cystatin từ mARN tách chiết hạt non giống đậu tƣơng Thái Nguyên 1.4 Đã tách dịng xác định đƣợc trình tự nucleotide gen cystatin phân lập từ giống đậu tƣơng Thái Ngun , có kích thƣớc 738 bp So sánh gen cystatin từ giống đậu tƣơng Thái Nguyên với giống đậu tƣơng có các mã số genbank là D 31700; AK246065; D64115 BT098957 khác nucleotide G thay bằng T vị trí nucletide thứ 109, dẫn tới bộ ba GAA thay bằng TAA 1.5 So sánh với trình tự nucleotide gen cystatin đậu tƣơng công bố ngân hàng gen quốc tế (NCBI), thấy trình tự nucleotide gen cystatin giống đậu tƣơng Thái Ngun có độ tƣơng đờng dao động từ94,5% - 99,8% ĐỀ NGHỊ Tiếp tục n ghiên cƣ́u cấu trúc của gen c ystatin giống đậu tƣơng khác Đặc biệt so sánh cấu trúc gen c ystatin của giống đậu tƣơng thuộc nhóm chịu hạn tốt với giống đậu tƣơng chị u hạn kém , để xác định mối liên quan giƣ̃a sƣ̣ thay đổi cấu trúc gen với đặc tí nh chịu hạn đậu tƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn CÔNG TRÌ NH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Đặc điểm gen cystatin phân lập từ hạt no n đậu tƣơng Tạp chí Khoa học &Cơng nghệ Đại học Thái Ngun , sớ tháng 9/2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng Việt Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội Lê Trần Bình cs ( 1997), Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Giáo trình cao học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội Ngô Mạnh Dũng (2008), So sánh khả chịu hạn phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn số giống lúa Tạp chí khoa học cơng nghệ - sớ 3(47)Tập 2/ Năm 2008 4.Hồng Văn Đức, Kết nghiên cứu quốc tế đỗ tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1986 Nguyễn Thu Hiền (2005), Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh phân lập gen dehydrin liên quan đến khả chị u hạn của một số giống đậu tương đị a phương vùng núi phí a Bắc Việt nam” , Luận văn thạc sĩ sinh học , trƣờng Đại học sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương nhập nội miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ, Hà Nội Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các đậu ăn hạt Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 19, N02, tr 5-10 Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hố sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, NXB Nơng nghiệp Hà Nội 10 Trần Đình Long, Nguyễn Thị Chinh, Hoàng Minh Tâm, Nguyễn Văn Thắng, Lê Khả Tƣờng, Trần Thị Trƣờng cs, Kết nghiên cứu phát Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn triển đậu đỗ Việt Nam (giai đoạn 2001-2005), Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam 11 Chu Hồng Mậu, Nơng Thị Man, Lê Trần Bình (2000), “Đánh giá số tính trạng kinh tế quan trọng khả chịu hạn dòng đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) đột biến”, Tạp chí khoa học công nghệ, 1(13), Đại học Thái Nguyên, 16-21 12 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đơng Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 13 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền học đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên 14 Đinh Thị Ngọc (2008) Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh phân lập gen chaperonin liên quan đến tính chịu hạn số giống đậu tương địa phương trồng vùng Tây Nguyên Luận văn thạc sĩ Sinh học 15 Trịnh Thị Nhất, Trần Hờng Uy Trần Đình Long (1997), Ảnh hưởng trồng xen ngô- đậu tương đến thời gian sinh trưởng suất hệ thống trồng, Nông nghiệp Công nghiệp thực phẩm, N0 426, tr 537538 16 Đinh Thị Phòng ( 2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiễn Sĩ Sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 17 Lê Trọng Quang, Phạm Thị Trân Châu (1994), Một số tiêu sinh hóa số dòng đậu tương (Glycine max) có tính chống chịu khác nhau, Thông báo khoa học trƣờng đại học, tr 66- 75 18 Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả chịu nóng chọn dòng chịu nóng lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn 19 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và phân lập một số gen liên quan đến tí nh chị u hạn của đậu xanh (Vignaradiata (L.) Wilczek) Luận văn Tiến sĩ Sinh học , Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội Phần tiếng Anh 20 Abe K, Emori Y, Kondo H, Suzuki K, Arai K (1987) Molecular cloning of a cysteine proteinase inhibitor of rice (oryzacystatin) Homology with animal cystatins and transient expression in the ripening process of rice seeds J Biol Chem 262: 16793-16797 21 Arai S, Abe K (2000) Cystatin-based control of insects, with special reference to oryzacystatin in:D.Michaud (Ed.),Recombinant Protease Inhibitors in Plants Landes Bioscience/Eurekah.com, Georgetown,TX, 27-42 proteinase inhibitor genes during development and in response to wounding and methyl jasmonate Plant Physiol 112: 1201-1210 22 Abe M and Arai S (1991) Some properties of a cysteine proteinase inhibitors from corn endosperm Agric Biol.Chem., 55 (9): 2417-2418 23 Barrett AJ, Rawlings ND, Davies ME, Machleidt W, Salvesen G, Turk V (1986) Cysteine proteinase inhibitors of the cystatin superfamily in: A.J Barrett, G Salvesen (Eds.), Proteinase Inhibitors Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, 519-569 24 Barrett AJ (1987) The Cystatins; a new class of peptidase inhibitors Trend Biochem Sci., 12: 193-196 25 Bode W, Engh R, Musil D, Thiele U, Huber R, Karshikov A,Brzin J, Kos J, Turk V (1988) The 2.0 A X-ray crystal structure of chicken egg white cystatin and its possible mode of interaction with cysteine proteinases EMBO J 7: 2593-2599 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn 26 Bolter C (1993) Methyl jasmonate induces papain inhibitor(s) in tomato leaves Plant Physiol 103: 1347-1353 27 Botella MA, Xu Y, Prabha TN, Zhao Y, Narasimhan ML, Wilson KA, Nielsen SS, Bressan RA, Hasegawa PM (1996) Differential expression of soybean cysteine 28 Chan A, Puiu D, Melake A, Orvis J, Zhao Q, Wortman J, Utterback T, Rosovitz MJ, Inman JM, Amedeo P, Schobel S, Galinsky K, Fraser C, Ravel J and Rabinowicz P (2008) Direct Submission Submitted (22-OCT-2008) J Craig Venter Institute, 9704 Medical Center Dr., Rockville, MD 20850, USA 29 Filho J.X (1992), “The biological roles of serine and cysteine proteinase inhibitors in plants”, Brazilian Journal of Plant Physiology, (1), pp 1-6 30 Grudkowska M., Zagdanska B (2004), “Multifunctional role of plant cysteine proteinases”, Acta Biochimica Polonia, 51 (3), pp 609-624 31 Jinn T., Chang P L., Chen Y., Key J L ADN Lin C (1997), Tissue-type specific heat- shock proteins in soybean, Plant Physiol., 114, , pp 429 – 438 32 Maitra N ADN Cushman J, C (1994), “Ioslation ADN characterization drought – induced Soybean cDNA encoding a D95 famyly late – embryogennesis – abudant protein”, Plant physiol., 106, 805 - 806 33 Misaka T, Kuroda M, Iwabuchi K, Abe K and Arai S (1996) Soyacystatin, a novel cysteine proteinase inhibitor in soybean, is distinct in protein structure and gene organization from other cystatins of animal and plant origin Eur J Biochem 240 (3): 609-614 34 Nông V H, Arahira M, Phan V C, Kim CS, Zhang D, Udaka K, Fukazawa C (1997), Glycine max cct-d gene (cDNA) for group II-chaperonin delta-subunit complete cds Genbank/EBI/DDBJ databases, Acc No AB004233 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn 35 Silvia Valdes-Rodriguez, Armando Guerrero-Rangel, Claudia MelgozaVillagomez, Alicia Chagolla-Lopez, Francisco Delgado-Vargas, Norma Martinez-Gallardo, Carla Sanchez-Hernandez, John Delano-Frier (2007) Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress Plant Physiology and Biochemistry 45: 790798 36 Tripp M, Southwick A, Karlin-Neumann G, Nguyen M, Miranda M, Palm CJ, Bowser L, Jones T, Banh J, Carninci P, Chen H, Cheuk R, Chung MK, Hayashizaki Y, Ishida J, Kamiya A, Kawai J, Kim C, Lin J, Liu SX, Narusaka M, Pham PK, Sakano H, Sakurai T, Satou M, Seki M, Shinn P, Yamada K, Shinozaki K, Ecker J, Theologis A and Davis RW (2002) Direct Submission Submitted (12-NOV-2002) DNA Sequencing and Technology Center, Stanford University, 855 California Avenue, Palo Alto, CA 94304, USA 37 To KY, Huang YJ, Yap MN, Chiang WJ, Suen DF and Chen SC (2001) Cloning and characterization of leaf senescence up-regulated genes in sweet potato Physiol Plant 113 (3): 384-391 38 Turk V, Bode W (1991), “The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases”, Federation of European Biochemical Societies Letters, 285 (2), pp 213-219.] 40 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/co-gioi-hoa-dong-bo-san-xuat-dau-tuong 39 Colella R, Sakaguchi Y, Nagase H, and Bird JWC (1989) Chiken egg white cystatin J Biol Chem., 264: 17164-17117 40 Gillikin JW, Bevilacqua S and Graham JS (1992) Partial characterization of digestive tract proteinases from western corn root-worm larvae, Diabrotica virgifera Arch Insect Biochem Physiol., 19: 285-298 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn 41 Waldron C, Wegrich LM, Owens Merlo PA, Walsh TA (1993) Characterization of a genomic sequence coding for potato multicystatin, an eight-domain cysteine proteinase inhibitor Plant Mol Biol 23: 801- 812 42 Gruden K, Kuipers AGJ, Guncar G, Slapar N, Strukelj B, Jongsma MA (2004) Molecular basis of Colorado potato beetle adaptation to potato plant defence at the level of digestive cysteine proteinases Insect Biochem Mol Biol 34: 365-375 43 Machleidt W, Borchart U, Fritz H, Brzin J, Ritonja A and Turk V (1983) Protein inhibitors of cysteine proteinase II Primary structure of stefin, a cytosolic inhibitor of cysteine proteinases for human polymorphonuclear granulocyles Hoppe-Seyler’s Physiol Chem., 364: 1481-1486 44 Sato N, Ishidoh K, Uchiyama Y and Kominami E (1990) Molecular cloning and sequencing of cDNA for rat cystatin β Nucleic Acids Res., 18 (22): 6698 45 Machleidt W, Thiele U, Laber B, Arsfald-Machleidt I, EsterL A, Wiegand G, Kos J, Turk V and Bode W (1989) Mechanism of inhibition of papain by chicken egg white cystatin: Inhibition constants of N-terminally truncated forms and cyanogen bromid fragments of the inhibitor FEBS., 243(2): 234238 46 Turk B, Turk V and Turk D (1997) Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinases and their protein inhibitors Biol Chem Hopp Seyler., 378: 141-150 47 Turk V and Bode W (1991) The cystatins: proteinase inhibitors of cysteine proteinse FEBS Lett, 285: 213-219 48 Walsh TA and Strickland JA (1993) Proteolysis of the 85-Kilodalton crystalline cysteine proteinase inhibitor from potato release functional cystatin domains Plant Physiol., 103(4): 1227-1234 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 Stubbs MT, Laber B, Bode W, Huber R, Jerala R, Lenarcic B, Turk V (1990) The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction EMBO J 9: 1939-1947 50 Hanato KI, Kojima M, Tanokura M and Takahashi K (1996) Solution structure of bromelain inhibitor VI from pineapple stem: Structural similarity with Bowman Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor from soybean J Biochem 35:5379-5384 51 Hanato KI, Tanokura M and Takahashi K (1998) The amino acid sequences of isoforms of the bromelain inhibitor from pineapple stem J.Biochem 124: 457-461 52 Kondo H, Abe K, Emori Y, Arai S (1991) Gene organization of oryzacystatin-II, a new cystatin superfamily member of plant origin, is closely related to that of oryzacystatin-I but different from those of animal cystatins FEBS Lett 278: 87- 90 53 Nagata K, Kudo N, Abe K, Arai S, Tanokura M (2000) Threedimensional solution structure of oryzacystatin-I, a cysteine proteinase inhibitor of the rice, Oryza sativa L japonica Biochemistry 39: 14753-14760 54 Steller H (1995) Mechanisms and genes of cellular suicide Science., 267: 1445-1449 55 Groover A, Dewill N, Heidel A and Djones A (1997) Programmedcell death of plant tracheary elements differentiating in vitro Protoplasma, 196: 197-211 56 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/co-gioi-hoa-dong-bo-san-xuat-dau-tuong Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... thạc sĩ là: ' 'Đánh giá khả chịu hạn phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn đậu tương" Mục tiêu nghiên cứu - Xác định khả chịu hạn phân nhóm c về mƣ́c độ chị u hạn giống đậu tƣơng nghiên... NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - HÀ THỊ PHƢỢNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTATIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di... tìm hiểu cở sở phân tử đặc tính chịu nóng, chịu hạn đậu tƣơng, [8], [12], [17], [32] Tuy nhiên, hiểu biết gen liên quan đến khả chịu hạn đậu tƣơng vẫn cịn rất chƣa đƣợc đầy đủ Cystatin chất