Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ (polyscias fruticosa (l ) harms) bằng phương pháp nuôi cấy phôi vô tính

BỘGIÁO DỤCVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠIHỌCNƠNGLÂMTP HCM TRỊNHVIỆTNGA NGHIÊNCỨU NHÂNGIỐNGCÂYĐINHLĂNGLÁNHỎ (Polysciasfruticosa(L.)Harms)BẰNGPHƯƠNGPHÁPNICẤ YPHƠIVƠTÍNH Chun ngành: Khoa học Cây trờngMãsố:9.62.01.10 LUẬNÁNTIẾNSĨNGÀNHNƠNGNGHIỆP TP.HCM -Năm2020 TRỊNHVIỆTNGA NGHIÊNCỨU NHÂNGIỐNGCÂYĐINHLĂNGLÁNHỎ (Polysciasfruticosa(L.)Harms)BẰNGPHƯƠNGPHÁPNICẤ YPHƠIVƠTÍNH Chun ngành: Khoa học Cây trờngMãsố:9.62.01.10 LUẬNÁNTIẾNSĨNGÀNHNƠNGNGHIỆP Ngườihướngdẫnkhoahọc:PGS.TS.PhạmThị MinhTâm TS.NguyễnHữuHổ TP.HCM -Năm2020 LỜICAMĐOAN Tơixincamđoanđâylàcơngtrìnhnghiêncứukhoahọcmàtơiđãtiếnhànhvàtổchứ cthựchiện.Cácsốliệuvàkếtquảnêutrongluậnánlàtrungthực TP.HờChíMinh,ngày24tháng04 năm2020 Tácgiảluận án TrịnhViệtNga LỜICẢM ƠN Để hoàn thành khóa học luận án xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:PGS.TS.PhạmThịMinhTâmvàTS.NguyễnHữuHổlànhữngngườiThầy, Cơđãtậntìnhhướng dẫnvàgiúp đỡtơithựchiệnluậnán TS Bùi Minh Trí, TS Huỳnh Văn Biết, Ks Nguyễn Đức Minh Hùng chỉbảovàgiúpđỡ tôirấtnhiềuvềchuyênmôn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP Hờ Chí Minh, quý Thầy CơPhòng Đào tạo Sau Đại học Khoa Nông học của Nhà trường tạo mọi điều kiệnthuậnlợichotơitrongsuốtqtrìnhhọctậpvàthực hiệnluậnán Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật tạomọiđiều kiệnthuậnlợigiúptơihồnthànhđượcchươngtrìnhhọc tập Viện Nghiên cứu Cơng nghệ Sinh học Mơi trường - Trường Đại học NơngLâmTP.HờChíMinh,TrungtâmSâmvàDượcliệuTP.HờChíMinh,CơngtyTNHH Khoa học Cơng nghệ Khải Hồn, bạn bè đồng nghiệp dành chotôinhiềusự giúpđỡquýbáutrongsuốtnămnămqua Các em: Ths Triệu Thị Bích, Ths Ngơ Thị Anh Khơi, Ths Nguyễn XnLinh, Ths Nguyễn Cao Kiệt, Ks Nguyễn Thị Hoài Thương, Ks Trương Thị Hồnglà cộng giúp đỡ rất nhiều q trình thực thí nghiệmkhoahọc Chờng, cùng người thân gia đình ln động viên tơitrongnhữnglúckhókhăn Ba mẹđãhếtlòng vìcon TP Hờ Chí Minh ngày 24 tháng 04 năm 2020Tácgiảluậnán TrịnhViệtNga TĨMTẮT Đề tài “Nghiên cứu nhân giống đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa(L.)Harms)bằngphươngphápnicấyphơivơtính”đãđượctiếnhànhtạiViệnSi nh học Nhiệt đới Thành phố Hờ Chí Minh từ tháng năm 2015 đến tháng năm2019.Mụctiêutổngqtcủađềtàilàxâydựngquytrìnhnhângiốnghồnchỉnhcâyđinh lăng nhỏ (ĐLLN) thơng qua đường cảm ứng tạo phơi vơ tính (Somaticembryo)nhằmđạtđượchệsốnhâncao,chấtlượngcâygiốngđờngnhất.Mụctiêucụthể gờm: (1)Xácđịnhhàmlượngaxítoleanoliccủa18mẫugiốngđinhlăngvàtrìnhtựDNAbarcodecủa8mẫugiốngĐLLN;(2)Xácđịnhmơi trườngnicấythíchhợp hình thành mô sẹo có khả phát sinh phôi vô tính; (3) Xác định mơi trườngvà chế độ ni cấy phù hợp để cảm ứng, nhân sinh khối phôi tạo hồn chỉnhtừ phơi; (4) Xác định điều kiện dưỡng phù hợp được tạo từphơivơtính Đề tài gờm bốn nội dung: (i) Chọn lọc dòng ĐLLN tiêu biểu xác định đặctrưng di trùn thơng qua việc đánh giá hàm lượng axít oleanolic phân tích sửdụng chỉ thị phân tử; dòng tiêu biểu được sử dụng làm nguồn vật liệu cho cácbướcnhângiốngtiếptheo;(ii)Cảmứngtạomơsẹo,sauđótiếptụctáibiệthóađểtạo phơi vơ tính dòng ĐLLN tiêu biểu; (iii) Xác định điều kiện môi trườngnuôi cấy phù hợp cho nhân nhanh sinh khối đạt được phôi trưởng thành củadòng ĐLLN tiêu biểu; (iv) Xác định điều kiện chăm sóc sau nuôi cấy mô cho dòngĐLLNtiêubiểuvàđánhgiásựđồngnhấtditruyềncủacáccâyconthànhphẩmbằngkỹthuậtI SSR Kết phân tích ghi nhận dòng ĐLLN D7 có hàm lượng axít oleanolic caonhất (1,18%) có khác biệt di truyền so với dòng khác thông qua kết quảphântíchHPLC vàcácchỉthịDNAbarcode Mẫu phiến ĐLLNin vitroni cấy môi trường MS có bổ sung2,4D nồng độ mg/L hình thành mơ sẹo tốt nhất với tỷ lệ 98,9%, đường kính mơsẹođ t , c m , t r ọ n g l ợ n g m ô s ẹ o l , m g , đ t c h ấ t l ợ n g t ố t g i a iđoạn 40 - 50 ngày sau cấy (NSC) Mô sẹo tạo phôi vơ tính tốt nhất được ni cấy trênmơitrườngMScóbổsungBA1,5mg/LvàNAA0,1mg/Lvớitỷlệhìnhthànhphơiđạt80,0% ,sốlượngphơiđạt549phơi/đĩasau45ngàynicấy.Trênmơitrườngcóbổsungsucrose40g/L,mơsẹo phátsinhphơitốtnhấtvớitỷlệhìnhthànhphơiđạt90,8% Phơivơtínhtăngsinhkhốinhanhnhấtkhinicấytrongbioreactorsụckhíởdunglượng6 00mL/ phút,hệsốtăngsinhphơiở30NSClà22,9lần.Phơivơtínhđơnpháttriểntốttrongmơitrường1/2M Scóbổsungsucrose15g/L,adeninesulfate10mg/L,kinetin0,5mg/L,IBA0,2mg/Lởđiềukiệnnicấylỏnglắcvà bioreactorsục khí Mơi trường SH cho kết tạo hoàn chỉnh tốt nhất: chiều cao đạt2,5 cm, số đạt 8,9 lá/cây, số rễ đạt 7,7 rễ, chiều dài rễ 6,2 cm, trọng lượng tươiđạt5,9gvàtrọnglượngkhơđạt0,3gở8NSC Saugiaiđoạninvitro,câyconĐLLNphátsinhtừphơiđượclấyratừbìnhcấymơvàđượctrờ ngtrêngiáthể100%cátkếthợpchesángtrong7ngàyđầutiênchosinhtrưởngổnđịnhnhất:chiề ucaocâyđạt3,04cm,sốlátrêncâyđạt5,13lá/cây,trọnglượngtrungbìnhcâyđạt928,3mg/ cây,tỷlệsốngcaonhấtđạt84,4%.Câyphátsinhtừphơisaukhichuyểnsangtrờngtrongbầuchứagiát hể1/2mụndừa:1/4trotrấu:1/4phânhữucơvisinhkếthợpbổsung0,6gN+0,6gP2O5/ bầu+0,3gK2O/bầuchocâysinhtrưởngtốt,tỷlệx́tvườncaonhấtđạt92,6100%,chiềucaocâytừ8,9đến12,3cm,có5,4-7,4lá/câyvàtừ6,7đến8,7rễ/ cây,trọnglượngcâytươiđạtcaonhấtlà20,2-34,3g/cây Kết đánh giá di truyền kỹ thuật ISSR cho thấy thành phẩmhìnhthànhthơngquaconđườngphátsinhphơivơtínhđềuđờngnhấtvềmặtditrùnsovớicâym ẹ SUMMARY Thes t u d y " M u l t i p l i c a t i o n o f P o l y s c i a s f r u t i c o s a ( L ) H a r m s b y i nvitro somaticembryoculturemethod"wasconductedattheInstituteofTropicalBiology - Ho Chi Minh City from April of 2015 to March of 2019 The general objective ofthe study was to establish the protocol for multiplication and acclimation ofP.fruticosathrough somatic embryogenesis The specific objectives of the study wereto identify: (1) oleanolic acid content of 18 selected samples ofPolyciasspp andDNAbarcodeof8selectedsamplesofP.fruticosa;(2)theoptimalcultureconditionsfor induce callus, then re-differentiate the callus to create somatic embryos; (3) theoptimalin- vitroconditionsforrapidembryomultiplicationandforplantregeneration;(4)optimalexvitroconditionsforthegrowthofembryo-derivedplantlets The study comprised of four contents: (i) to select the prominentP fruticosasamples through the evaluation of oleanolic acid content and to determine geneticcharacteristics of the selected samples based on molecular marker analysis; Thepromising samples will be used as material for subsequent propagation steps; (ii) toinduce callus, then redifferentiate the callus to create somatic embryos; (iii) todetermine the optimalinvitroconditions for rapid embryo multiplication and forplant regeneration; (iv) to determine optimalex-vitroconditions for the growth ofembryo- derivedplantletsandtoevaluatethegenetichomogeneityoftheplantsusingISSRtechnique TheresultsobtainedthroughthegeneticevaluationshowedthatthematKandrbcLgene regionsoftheP.fruticosasamplesseemedhighlyconservedandvariationoccurred in thetrnHpsbAregion Oleanolic acid content was the highest in leaf oftheD7 selectedsample(1,18%) The experiment on callus induction from leaf explant was carried out andrecorded that the best callus induction obtained on MS medium supplemented with2,4-D2mg/L,thehighestcallusformationratewas98.9%,callusdiameterat1.9cm, fresh weight of callus at 219.7 mg, embryogenic callus usually formed in the periodof 40 - 50 days after culture (DAC) MS medium supplemented with BA 1.5 mg/Land NAA 0.1 mg/L induced the best somatic embryo with induction rate of 80.0%,number of embryos was 549 embryos per plate at 45 DAC Medium containingsucrose 40 g/L was most effective in inducing somatic embryos with induction rateof90.8%,numberofembryos287perplateat45DAC Thesomaticembryoreachedthehighestbiomasswhenculturedbyusingair-bubble bioreactor with aeration speed of 600 mL/minute, the embryo multiplicationrate was 22.9 times at 30 DAC Single somatic embryos regenerated on the 1/2 MSmedium supplemented with sucrose 15 g/L, adenine sulfate 10 mg/L, kinetin 0.5mg/LandIBA0.2mg/ Lbothinshackedflasksandinair-bubblebioreactor.TheSHmediumwassuitableforplantdevelopment:theplant height reached up to 2.5 cmwith leaves and roots gained 8.9 and 7.7 per plantlets, respectively; the root lengthobtained6.2cm;thefreshweightanddryweightreached5.9gand0.3gat84DAC,respectiv ely At theex vitrostage, P.fruticosaplantlets in nursery grown well on sand(100%) and shaded during the first days The plantlet reached a height of 3.0 cm,number of leaves gained 5.1 leaves/plantlet, fresh weight reached 928.3 mg/plantlet,thehighestsurvivalratewas84.4%.Theseplantletstransplantedintomixedsubstrate(1 /2coconutdust:1/4ricehusk:1/4organicmicroorganism)supplementedwithof 0.6gN/pot+0.6gP2O5/potdevelopedandgainedtherateofseedlingsvariedfrom 92.6to100%,plantletheightvaried8.9-12.3cm,numberofleavesandrootsranged 5.4-7.4and6.7-8.7perplantlet,respectively;thefreshweightrecordedat20.234.3g/plantlet TheresultofthegeneticevaluationbyISSRtechniqueshowedthatallsomaticembryoderiv edplantsweregeneticallyhomogeneousascomparedtothemotherplant MỤCLỤC Trang Trangphụbìa Lờicamđoan i Lờicảmơn ii Tómtắt iii Mụclục vii Danhsáchcác chữ viếttắt .xi Danhsáchcác bảng xiv Danhsáchcáchình xviii MỞĐẦU .1 Chương1TỔNGQUANTÀILIỆU .5 1.1 Giớithiệusơlượcvềcâyđinhlăng 1.1.1 Nguồngốcvàsựphânbốcủacâyđinhlăng 1.1.2 Phân loạivàsự đadạngcủacâyđinhlăng 1.1.3 Đặcđiểmhìnhtháicủacâyđinhlănglánhỏ 1.1.4 Nhu cầuvềđiềukiệnsinhtháicủacâyđinhlăng 1.1.5 Cácthànhphầnhóahọcchínhvàgiátrịdượctínhcủacâyđinhlăng 1.2 Hiệntrạngcôngtácgiốngtrongpháttriểnsảnxuấtcâyđinhlăng 1.3 Phương phápnicấymơvàkỹthuậttạophơivơtính ởthực vật .9 1.3.1 Cơ sởkhoahọc củani cấymơvàqtrìnhtạophơivơtính .9 1.3.2 Qtrìnhtạophơivơtính .11 1.3.3 Ảnh hưởngcủacácloạimơ đếnsự tạophơivơtính 12 1.3.4 Ảnh hưởngcủachất điềuhòasinhtrưởngthựcvật đếnsựtạo phơi vơtính 13 1.3.5 Nuôi cấymôvàtếbàotrongdịch lỏng 16 1.3.6 Bioreactor 18 1.4 Tìnhhìnhnghiêncứutrênthếgiớivàtrongnướcvềnicấymơ/ phơivơtínhcâyđinhlăngvàhàmlượngaxítoleanolic/saponinởmột sốgiốngđinhlăng 19 1.4.1 Tìnhhìnhnghiêncứunicấymơ/phơivơtínhcâyđinhlăngtrên thếgiớivàtrongnước 19 1.4.2 Hàmlượngaxít oleanolic/saponin ởmột sốgiốngđinhlăng 22 1.5 ỨngdụngkỹthuậtchỉthịphântửDNAtrongnghiêncứuđặcđiểm ditruyền .23 1.5.1 KỹthuậtmãvạchDNA(DNAbarcode) 23 1.5.2 Kỹthuật ISSR 25 1.6 Thuần dưỡngcâycontừ nuôicấyinvitroravườnươm 25 1.6.1 Ảnhh n g c ủ a g i t h ể đ ế n s i n h t r n g c ủ a c â y t r ồ n g s a u n u ô i cấymô .25 1.6.2 Ảnhh n g c ủ a n h s n g đ ế n s i n h t r n g c ủ a c â y c o n t r o n g vườnươm .27 1.6.3 Ảnhhư n gc ủa p h â n b ón đ ế n s in ht rư n gc ủa c â y cons a un uô i cấymô .28 Chương2NỘIDUNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 31 2.1 Thời gianvàđịa điểmnghiêncứu .31 2.2 Nộidungnghiên cứu .31 2.3 Nộidung1:Đánhgiáhàmlượngaxít oleanoliccủa 18mẫugiống đinhlăngvàxácđịnhtrìnhtự DNAbarcodecủa8mẫuĐLLN 33 2.4 Nộidung2:Tạomơsẹovàtạo phơivơtínhdòngĐLLNưutú 39 2.5 Nộidung3.Nhânphơivơtính,tạophơivơtínhtrưởngthànhvàtạo câytừ phơivơtínhĐLLN .43 2.6 Nộidung4:KhảosátsựsinhtrưởngởgiaiđoạnvườnươmcủadòngĐLLNđ ã đ ợ c n u ô i c ấ y v đ n h g i đ ộ đ ồ n g n h ấ t d i t r u y ề n câycon .47 2.7 Phươngphápphân tíchdữliệu 54 ...TRỊNHVIỆTNGA NGHIÊNCỨU NHÂNGIỐNGCÂYĐINHLĂNGLÁNHỎ (Polysciasfruticosa(L.)Harms)BẰNGPHƯƠNGPHÁPNICẤ YPHƠIVƠTÍNH Chun ngành: Khoa học Cây trờngMãsố:9.62.01.10 LUẬNÁNTIẾNSĨNGÀNHNƠNGNGHIỆP... năm 2020Tácgiảluậnán TrịnhViệtNga TÓMTẮT Đề tài ? ?Nghiên cứu nhân giống đinh lăng nhỏ (Polyscias fruticosa( L.)Harms)bằngphươngphápnicấyphơiv? ?tính? ??đãđượctiếnhànhtạiViệnSi nh học Nhiệt đới Thành... 1.1 Giớithiệusơlượcvê? ?cây? ?inhlăng 1.1.1 Nguồngốcvàsựphânbốcủacâyđinhlăng 1.1.2 Phân loạivàsự đadạngcủacâyđinhlăng 1.1.3 Đặcđiểmhìnhtháicủacâyđinhlănglánhỏ 1.1.4 Nhu